Клонування, функціональна ідентифікація та аналіз експресії халконсинтази з Cistanche Tubulosa Ⅱ

3 Результати та аналіз

3.1 Клонування гена CtCHS

Чотири послідовності, анотовані як "халконсинтаза", були відібрані за допомогою даних транскриптомів квіток Cistanches tubulosa. За допомогою порівняння NCBI Blast було виявлено, що лише одна послідовність мала повну довжину гена CHS і FPKM більше 10. Специфічні праймери були розроблені на основі цієї послідовності, і фрагмент приблизно 1200 bp був отриманий шляхом ПЛР-ампліфікації з використанням КДНК квітки Cistanches tubulosa як матриця (рис. 1). Продукт ПЛР виділяли з гелю та з’єднували з вектором pCE2TA/Blunt-Zero. Результати секвенування узгоджувалися з аналізом транскриптомів. Ген отримав назву CtCHS. Довжина послідовності становить 1173 bp і кодує 390 амінокислот.

Служба підтримки Wecistanche - найбільшого експортера cistanche в Китаї:

Електронна адреса:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Тел.:+86 15292862950

Зверніться в магазин, щоб дізнатися більше про технічні характеристики:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

3.2 Біоінформатичний аналіз CtCHS

3.2.1 Фізичні та хімічні властивості CtCHS та аналіз трансмембранного домену

Онлайн-програмне забезпечення ProtParam використовувалося для аналізу фізичних і хімічних властивостей білка, кодованого геном CtCHS. CtCHS кодує 390 амінокислот, молекулярна формула — C1908H3041N511O562S22, відносна молекулярна маса — 42 836.54, теоретична ізоелектрична точка — 5,85, і він нестабільний. Коефіцієнт II становить 43,24, що є нестабільним білком, а загальна середня гідрофільність (GRAVY) становить -0,052, що є гідрофільним білком. Онлайн-інструмент Prot Scale далі використовувався для аналізу гідрофільності/гідрофобності білка. Результати аналізу показали, що максимальне значення гідрофільності/гідрофобності білка CtCHS становило 2,422 (342), а мінімальне значення – −2,489 (119). Амінокислотний пептидний ланцюг, який кодується геном CtCHS, має більше гідрофільних амінокислотних залишків, ніж гідрофобних амінокислотних залишків, тому це гідрофільний білок. Онлайн-програмне забезпечення TMHMM використовувалося для прогнозування трансмембранної структури білка. Білок CtCHS не має трансмембранного домену.

Рис. 1 ПЛР-ампліфікація гена CtCHS

3.2.2 Прогнозування вторинної та третинної структури білка CtCHS

Онлайн-інструмент SOPMA використовувався для прогнозування вторинної структури білка. Результати показано на малюнку 2-A. 44,87% -спіралей, 31,03% випадкових клубків, 15,64% розширених ланцюгів і 8,46% -листів складають вторинну структуру білка CtCHS. структура рівня. Програмне забезпечення онлайн-аналізу SWISS-MODEL використовувалося для прогнозування третинної структури білка, а кристалічна структура рису CHS1 використовувалася як шаблон для прогнозування тривимірної структури білка CtCHS. Результати показано на малюнку 2-B. Узгодженість між Cistanche tubulosa CtCHS і рисом CHS1 становить 83,55%.

3.2.3 Порівняння послідовностей та аналіз і застосування філогенетичного дерева

Програмне забезпечення DNAMAN виконує порівняння гомології між CtCHS та амінокислотними послідовностями CHS інших видів. Результати показано на малюнку 3-C. Послідовність амінокислот CtCHS узгоджується з Sesamum indicum L. (XP_011091402.1) і Antirrhinum majus L. (P06515.1), Mazus pumilus (NL Burman)Steenis (AAN05791.1), Erythranthe lewisiiG. L. Nesom & NS Fraga (AHJ80976.1), Perilla frutescens (L.) Britton (O04111.1) і Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (NP_196897.1). Амінокислотні послідовності CHS дуже схожі: подібність становить 90,93%, 90,68%, 90,18%, 89,42%, 89,42% і 81,61%.

НАТУРАЛЬНИЙ ОРГАНІЧНИЙ ЕКСТРАКТ ЦИСТАНКИ З 30% ЕХІНАКОЗИДУ ТА 12% АКТЕОЗИДУ

Крім того, множинне вирівнювання послідовностей також показало, що CtCHS має консервативні каталітичні залишки Cys164, His303 і Asn336. Для подальшого розуміння еволюційного положення CtCHS Cistanche tubulosa в сімействі CHS рослин було використано програмне забезпечення MEGA-X для побудови філогенетичного дерева між білками CtCHS і CHS інших рослин. Результати показано на малюнку 3-DE lewisii AHJ80976.1) ElCHS тісно пов’язаний.

3.3 CtCHS прокаріотична експресія та очищення

Плазміду pET-28a-CtCHS трансформували в експресійний штам E. coli BL21 (DE3), а експресію білка індукували за допомогою IPTG при низькій температурі. Білок очищали за допомогою колонки афінної хроматографії з іонами нікелю, і очищений білок виявляли за допомогою 10% SDSPAGE. Результати показано на малюнку 3. Смуга білка CtCHS з’явилася біля 40, 000, що узгоджується з відносною молекулярною масою білка CtCHS 42 800.

3.4 Аналіз активності ферментів CtCHS

Щоб ідентифікувати функцію CtCHS, очищений білок CtCHS інкубували з малоніл-КоА, 4-кумароїл-КоА, а продукти виявляли за допомогою ВЕРХ та МС. У природних умовах нарингенін-халкон нестабільний у розчині і легко циклізується в нарингенін. Тому нарингенін-халкон і нарингенін були обрані як стандартні контролі.

Результати тесту ВЕРХ показано на рисунках 4-A та B. Час утримання продукту ферментативної реакції подібний до часу утримування стандарту нарингеніну. Обидва мають максимальне поглинання при 289 нм в УФ-спектрі поглинання, що відрізняється від часу утримання нарингенін-халкону. Час і УФ-спектри поглинання були різними, але в якості негативного контролю продукт після інкубації високотемпературного інактивованого білка CtCHS із субстратом не містив нарингеніну, халкону та нарингеніну. Подальше виявлення за допомогою мас-спектрометрії, мас-спектр першого рівня (рис. 4-C, D) показало, що продукт реакції ферменту має [MH]-пік m/z271.060 97, тоді як нарингенін має [MH ]-пік m/z 271.060 91.

Порівнюючи спектри MS2 (рис. 5-E, F), продукт реакції ферменту CtCHS і нарингенін мають характерні піки фрагментів при m/z 107, 151 і 177, що узгоджується з літературним звітом [19], вказуючи на те, що CtCHS містить халконовий комплекс. Ферментативна активність, він може каталізувати реакцію малоніл-КоА та 4-кумароїл-КоА в нарингенін-халкон.

3.5 Аналіз субклітинної локалізації

Щоб вивчити роль білка CtCHS у клітинах, плазміду pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS було сконструйовано та трансформовано в протопласти Arabidopsis thaliana для спостереження за її субклітинною локалізацією. Результати показано на малюнку 5. Як контроль білок pCAMBIA1300-35S-GFP розподілявся в ядрі та цитоплазмі, тоді як злитий білок pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS був переважно розподілений у цитоплазмі, що вказує на те, що білок CtCHS може функціонувати в цитоплазмі рослинних клітин. функція.

3.6 Аналіз шаблону експресії CtCHS

QRT-PCR використовували для виявлення відносної експресії CtCHS у квітках Cistanche deserticola трьох кольорів: білого, фіолетового та червоного. Результати показані на малюнку 6. Експресія CtCHS у фіолетових і червоних квітах була значно вищою, ніж у білих квітах. кількість. Порівняно з білими квітками, рівень експресії CtCHS у фіолетових квітках вищий у 8,44 рази, а рівень експресії CtCHS у червоних – у 3,21 разів. Ці результати вказують на те, що зміни в рівнях експресії CtCHS можуть бути пов’язані з різницею в кольорі квітки Cistanche deserticola. Чим вищий рівень експресії, тим темніший колір квітки. , чим нижчий рівень експресії, тим світліший колір квітки.

****P＜0.000 1Рис. 6 Відносний рівень експресії CtCHS у квітках різного забарвлення

4 Обговорення

CHS - це aключовий фермент у шляху біосинтезу флавоноїдіві має відношення до горегулювання забарвлення квітоку багатьох рослин. Наприклад, колір квіткиДіантус китайськийЛ.[20] та Petunia × hybrida Hort. exVilm.[22] всі уражені CHS. КОНТРОЛЬ.Цистанки трубчастів основному має три кольори квіток: білий, червоний і фіолетовий, але механізм регуляції забарвлення квіток ще невідомий. У цьому дослідженні ген CtCHS був клонований за допомогою RT-PCRаналіз транскриптомних даних квіток Cistanches tubulosa, і його

Біоінформатичний аналізбуло проведено, і результати показали, що CtCHS має високу подібність і тісний генетичний зв’язок з амінокислотною послідовністю ElCHS Physalis nigra (AHJ80976.1). CHS є полікетидсинтазою типу III (PKSIII), і дослідження показали, що CHS має збережену каталітичну тріаду Cys-His-Asn [23]. У цьому дослідженні аналіз вирівнювання амінокислотної послідовності показав, що CtCHS має консервативні каталітичні залишки Cys164, His303 і Asn336, що вказує на те, що CtCHS може мати типову функцію халконсинтази.

здатний. Аналіз ферментативної активності проводили з використанням прокаріотичної експресії білка CtCHS у Escherichia coli та виявляли за допомогою ВЕРХ та МС. Було виявлено, що білок CtCHS може каталізувати 4-кумароїл-КоА та малоніл-КоА для утворення нарингенін-халкону.

CHS бере участь у синтезі флавоноїдів у багатьох рослинах, але його субклітинне розташування різне у різних видів. Наприклад, Carthamus tinctorius L. CtCHS1[24], Morus atropurpurea Roxb. MaCHS[25], Eupatorium adenophorum Spreng. Усі EaCHS[26] розташовані в цитоплазмі, тоді як Paeonia delavayi var. lutea (Delavay ex Franch.) Finet et Gagnep. PdCHS

[27], баклажана Solanum melongena L. SmCHS [28] знаходиться в цитоплазмі та ядрі, а у винограду Vitis vinifera L. VvCHS знаходиться в цитоплазмі, ядрі та клітинній стінці [29]. У цьому дослідженні плазміду pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS використовували для трансформації протопластів Arabidopsis thaliana, і було виявлено, що білок CtCHS в основному локалізований у цитоплазмі та може каталізувати виробництво нарингенін-халкону в цитоплазмі для сприяють накопиченню флавоноїдів.

Фенілпропаноїдний шлях розгалужується від 4-кумароїл-КоА до шляху синтезу флавоноїдів і шляху біосинтезу лігнану. CHS каталізує 4-кумароїл-КоА та малоніл-КоА для генерації нарінгеніну та халкону для ініціювання флавоноїдів. Шлях біосинтезу складноподібних сполук є першим ключовим ферментом цього шляху [30]. Таким чином, сильно виражений CHS є корисним для рослин, щоб накопичувати більш високий рівень флавоноїдів і виробляти темніші квіти. Наприклад, рівень експресії CHS у сортах Hosta plantaginea (Lam.) Aschers з пурпуровими квітками вищий, ніж у сортах з білими квітками. Hosta HpCHS трансформується в тютюн для отримання. Порівняно з диким типом тютюну, рослини надекспресії мають темніші пелюстки та вищий загальний вміст антоціанів [31].

У цьому дослідженні рівень експресії гена CtCHS пов’язаний із кольором квіток цистанції трубчастої. Він сильно виражений у темно-фіолетових і червоних квітках і слабкий у світло-білих квітках. Різниця в експресії CtCHS може бути пов’язана з різницею в квітках Cistanches tubulosa. Одна з причин наявності різних костюмів і кольорів. Підсумовуючи, це дослідження клонувало ген CtCHS з квітів Cistanche deserticola та проводило його біоінформаційний аналіз. Рекомбінантний білок CtCHS був отриманий шляхом екзогенної експресії в Escherichia coli. Аналіз активності ферментів довів, що білок CtCHS може каталізувати 4-кумароїлкофермент. А і малоніл-коензим А утворюють нарингенін-халкон. Було виявлено, що ген CtCHS сильно експресується в фіолетових і червоних квітках і низько в білих. Ці результати вказують на те, що ген CtCHS може регулювати вироблення різних кольорів квіток у Cistanche deserticola, що є корисним для подальших досліджень регуляторного механізму забарвлення квіток Cistanche tubulosa та є посиланням для наступних досліджень ролі CtCHS у регуляції забарвлення квіток у Cistanche deserticola.