Клонування, функціональна ідентифікація та аналіз експресії халконсинтази з Cistanche Tubulosa

Анотація: Мета

Для вивчення функціїхалконсинтаза з Cistanche tubulosaі модель експресії гена CtCHS у білих, червоних і фіолетових квітах.

методиГен CtCHS клонували за допомогою RT-PCR і проводили біоінформаційний аналіз. Плазміду pET-28a-CtCHS перенесли в Escherichia coli, щоб індукувати експресію білка за допомогою IPTG. Рекомбінантний білок CtCHS інкубували з субстратами п-кумароїл-КоА та малоніл-КоА, а продукти виявляли за допомогою ВЕРХ та МС. Плазміду pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS перенесли в протопласт Arabidopsis thaliana для спостереження за субклітинною локалізацією білка CtCHS. Патерн експресії гена CtCHS у квітках C. tubulosa з трьома кольорами виявлено за допомогою ПЛР-ПЛР.

РезультатиБуло клоновано ген CtCHS. Довжина відкритої рамки зчитування (ORF) становила 1173 bp, що кодує 390 амінокислот, а молекулярна маса білка становила 42 8000.

ОРГАНІЧНИЙ ЕКСТРАКТ ЦИСТАНКИ З 30% ЕХІНАКОЗИДУ ТА 12% АКТЕОЗИДУ

CtCHS містив каталітичні залишки Cys164, His303, Asn336, які збереглися в халконсинтазі. Білок CtCHS експресували в E.coli та очищали для отримання рекомбінантного білка. Білок CtCHS може каталізувати п-кумароїл-КоА та малоніл-КоА для отримання халкону нарингеніну. Білок CtCHS був переважно локалізований у цитоплазмі. Ген CtCHS був високо експресований у фіолетових і червоних квітах, а відносні рівні експресії були в 8,44 і 3,21 рази вищими, ніж у білих квітках відповідно.

Висновок Ген CtCHS був клонований із квітки C. tubulosa та експресований білок. Білок CtCHS виконує функцію халконсинтази, а експресія гена CtCHS вища в темніших квітах, що вказує на те, що ген CtCHS може регулювати забарвлення квітки C. tubulosa, що закладає основу для подальших досліджень механізму регуляції забарвлення квітки C. .tubulosa.

Ключові слова: Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; халконсинтаза; аналіз активності ферментів; субклітинна локалізація; аналіз експресії

Цистанка трубчаста(SCHENK) WIGHT — рослина роду Pyreal, яка в природі поширена в південному Сіньцзяні [1] в районі Хетян в Сіньцзяні [2]. Квіти трубочки мають високу лікувальну цінність. Його м'ясні стебла є одним із джерел версії 2020 року "Китайська фармакопея". [3] Дослідження стебел м'яса кордонуса звичайних збільшено, але відносно мало біологічних досліджень його квітів. Період цвітіння звичайних квітів триває з квітня по травень [4], в основному існує три кольори білого. , червоний і фіолетовий. Квіти трубчасті багаті за кольором, але механізм регуляції забарвлення квіток не пов’язаний із типом, вмістом і розподілом тканини пелюсток, а також регуляцією факторів навколишнього середовища і генетичні фактори [5], в основному, включає в себе три категорії: флавоноїди, каротин, найбільш широкий діапазон кольорів як три різновиди Paeonia Lactiflora Pall.

Він виглядає як білий, а основний колір кольору містить колір червоного, і красива компетенція робить квіти присутніми як фіолетово-червоні [8]. Забарвлення квітів є важливою ознакою багатьох декоративних рослин, а також ключовим фактором, який приваблює рожевих комах [9]. Дослідження показали, що він передається у спадок Найбільш часто комахи відвідують рослину темно-пурпурову цистанку [10]. Для біологічних досліджень синтетичних генетичних досліджень цистаноїдів у квітках трубчастої квітки цистанозавра це сприяє з’ясуванню механізму контролю забарвлення кордону трубчастої квітки, забезпечуючи теоретичну основу для покращення кольору технології генної інженерії, просування його більш насичених кольорів, збільшення перегляду, розширення сфери застосування.

Біосинтетичний шляхфлавоноїдипочинається зфенілпропаноїдний шлях. Фенілаланін спочатку перетворюється на коричну кислоту під дією фенілаланін-амоніаліази (PAL), а корична кислота 4-гідроксилюється коричною кислотою. Фермент (-4-гідроксилаза коричної кислоти, C4H) і 4-кумараткоензим А лігаза (4-кумараткоензим А лігаза, 4CL) каталізують реакцію з утворенням 4-кумароїл-КоА [11]. Одна молекула 4-кумароїл-КоА та три молекули малоніл-КоА каталізуються халконсинтазою (CHS) для утворення халкону нарингеніну, якийфлавоноїдні сполуки.Основний скелет халконізомерази, флаванон{0}}гідроксилази, дигідрофлавонол4-редуктази тощо генерує різноманітні флавоноїди, такі як ізофлавони, флавоноли, антоціани тощо [12]. Як ключовий фермент у шляху біосинтезу флавоноїдів, CHS регулює вміст флавоноїдів у рослинах, а також відіграє важливу роль у регуляції забарвлення квіток рослин [13]. Наприклад, посттранскрипційне мовчання генів Gentiana scabra Bunge CHS може пригнічувати біосинтез антоціанів і викликати специфічне відбілювання часток віночка [14]. Приглушення гена CHS Actinidia eriantha Benth. CHS знижує вміст антоціанів у пелюстках і спричиняє забарвлення червоних пелюсток [15]. Таким чином, у цьому дослідженні ген CtCHS було клоновано з квітів Cistanche deserticola, і для дослідження функції CtCHS на ньому було проведено біоінформаційний аналіз, експресію та очищення прокаріотів, аналіз активності ферментів, аналіз субклітинної локалізації та аналіз експресії в трьох кольорах квітів. протеїн і модель експресії гена CtCHS були використані для попереднього дослідження зв’язку між CtCHS і забарвленням квіток Cistanche deserticola, що заклало основу для вивчення регуляторного механізму забарвлення квіток Cistanche deserticola.

1 Матеріали та інструменти

1.1 Матеріали

Квіти Cistanche tuberosa були зібрані з округу Юйтянь, префектура Хотань, Сіньцзян у травні 2018 року. Під час відбору зразків дотримувалися принципу випадкової вибірки, і були відібрані квіти Cistanche tuberosa з хорошим фізіологічним станом і постійною висотою рослин. Три сорти Cistanche deserticola з трьома кольорами квіток білого, червоного та фіолетового були взяті та ідентифіковані як Cistanche tubulosa (Schenk) Wight професором Ту Пенфей з Пекінського університету фармацевтичної школи. Їх швидко заморозили в рідкому азоті, зберігали на сухому льоду та перевезли до Пекіна. Хімічно компетентні клітини E. coli DH5 були придбані у Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., а хімічно компетентні клітини E. coli BL21 (DE3) були придбані у Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP. Вектор було придбано в Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA було придбано в Sigma Company, 4-coumaroyl-CoA, naringenin -халкон були придбані у Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., а нарингенін був придбаний у Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Інструменти

спектрофотометр Nanodrop 2000C (Thermo Fisher Company, США); прилад градієнтної ПЛР (компанія Eppendorf, Німеччина); Прилад для флуоресцентної кількісної ПЛР CFX 96, пристрій для зображення гелю UVP, прилад для електрофорезу в гелі, прилад для електрофорезу білків (компанія BioRad, США); EnSpire

Рідер для мікропланшетів (PerkinElmer Company, США); інкубатор постійної температури (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); Повнотемпературний генератор великої ємності DHZ-D (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Осцилятор постійної температури на водяній бані (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); Ультрачистий верстак AIRTECH (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); паровий стерилізатор високого тиску (компанія TOMY, Японія); Прилад для чистої води Milli Q (Millipore, США); LC-20Високоефективний рідинно-фазний хроматограф (Shimadzu Company, Японія); Мас-спектрометрія високої роздільної здатності UPLC-Q-Exactive-Orbitrap (Thermo Fisher Company, США); Лазерний конфокальний мікроскоп FV1200 (компанія Olympus, Японія).

2 Експериментальні методи

2.1 Екстракція РНК і синтез кДНК. Квітки Cistanche deserticola подрібнювали в рідкому азоті, а потім піддавали аналізу екстракції РНК.

Загальну РНК екстрагували за допомогою набору (Norgen, Cat 17200), концентрацію та якість РНК визначали за допомогою NanoDrop 2000C, а зразки РНК із співвідношенням A260/A280 між 1,8 і 2,1 відбирали для синтезу кДНК шляхом зворотної транскрипції. Зворотну транскриптазу M-MLV (Promega, M170B) використовували для зворотної транскрипції кваліфікованої загальної РНК у кДНК. Експериментальні роботи проводили відповідно до інструкції.

2.2 Клонування гена CtCHS

На основі даних транскриптома квітки Cistanche deserticola нашої дослідницької групи [16] було відібрано CtCHS із повною відкритою рамкою зчитування, а програмне забезпечення SnapGene було використано для розробки специфічних праймерів на основі послідовності гена (таблиця 1). ПЛР-ампліфікацію проводили з використанням кДНК квітки Cistanche deserticola як матриці. Система ампліфікації: 2 × буфер Phanta Max 25 мкл, dNTP Mix (10 ммоль/л) 1 мкл, праймери вище та нижче за течією (10 мкмоль/л) по 2 мкл кожен, кДНК 2 мкл, Phanta Max SuperFidelity

ДНК-полімераза 1 мкл, ddH2O 17 мкл. Умови реакції були: попередня денатурація при 95 градусах протягом 3 хвилин; 25 циклів денатурації при 95 градусах протягом 15 секунд, відпалу при 55 градусах протягом 15 секунд і подовження при 72 градусах протягом 1 хвилини; і продовження реакції при 72 градусах протягом 5 хв. Продукт ПЛР виявляли за допомогою електрофорезу в 1% агарозному гелі, і набір для очищення ДНК (Novizan, Cat DC301-01) використовували для виділення гелю, а потім відновлену ДНК очищали за допомогою набору для швидкого клонування (Novizan, Cat C601-01). Фрагмент ДНК лігували з вектором pCE2 TA/Blunt-Zero, трансформували в компетентні клітини Escherichia coli DH5, і після культивування протягом ночі при 37°C окремі штами клонів відбирали та відправляли на компанію для секвенування.

Таблиця 1 Послідовності праймерів

2.3 Біоінформаційний аналіз

Використовуйте онлайн-програмне забезпечення ProtParam для аналізу фізичних і хімічних властивостей білка; використовувати онлайн-інструмент Prot Scale для аналізу гідрофільності/гідрофобності білка; використовувати онлайн-інструмент SOPMA для прогнозування вторинної структури білка; використовувати програмне забезпечення онлайн-аналізу SWISS-MODEL для прогнозування третинної структури білка; використовувати онлайн програмне забезпечення TMHMM Передбачити трансмембранну структуру білка; використовувати програмне забезпечення DNAMAN для порівняння гомології CtCHS з амінокислотними послідовностями CHS інших видів; використовуйте програмне забезпечення MEGA-X для побудови філогенетичного дерева, використовуючи об’єднання сусідів (NJ) і поправку Пуассона. Еволюційна відстань обчислюється за допомогою методу Bootstrap, а кількість повторень Bootstrap становить 1000 разів.

Для подальшого виявлення використовували UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Умови рідкої фази: колонка Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 (100 мм × 3.0 мм, 1,7 мкм), температура колонки 40 градуси, нарингенін , халкон і нарингенин. Об’єм завантаження контрольної речовини становить 4 мкл, а об’єм завантаження продукту ферментативної реакції – 7 мкл. В якості рухомої фази використовується вода (А)-ацетонітрил (В). Градієнт елюції: від 0 до 5 хв, 30% В; 5-15 хв. , 30%~60% B; 15~20 хв, 60%~100% B; 20~25 хв, 100% B; 25~31 хв, 100%~30% B. Об’ємна швидкість потоку 0,3 мл/хв. Умови мас-спектрометрії: електророзпилювальне джерело іонів, азот як газ-носій, тиск оболонкового газу 3,5 МПа, тиск допоміжного газу 1,0 МПа, тиск розпилення 3500 В, температура капіляра 350 градусів, температура нагріву допоміжного газу 200 градусів, режими позитивних і негативних іонів, сканування діапазон іонів m/z становить 100-1500, повна роздільна здатність MS становить 35 000, роздільна здатність dd-MS2 становить 17 500, (N)

CE/stepped nce встановлено на 35, 60.

2.6 Субклітинна локалізація білка CtCHS

На основі послідовності CtCHS і принципу безшовного клонування були сконструйовані праймери з сайтами різання ферментів Kpn Ⅰ і BamH Ⅰ, а відповідні цільові фрагменти ампліфіковані за допомогою ПЛР. Плазміду pCAMBIA1300-35S-GFP розщеплювали ендонуклеазами рестрикції Kpn Ⅰ і BamH Ⅰ, а цільовий фрагмент і вектор з’єднували за допомогою набору для безшовного клонування (Novizan, Cat C115-01), а потім переносили у компетентні клітини E. coli DH5. , виберіть окремі штами-клони для секвенування та витягніть плазміди з правильних штамів. Плазміди pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS і pCAMBIA 1300-35S-GFP трансформували в протопласти Arabidopsis thaliana за допомогою PEG4000 і культивували при слабкому освітленні протягом 8-10 годин. Субклітинну локалізацію білка CtCHS спостерігали під лазерним конфокальним мікроскопом.

2.7 Аналіз шаблону експресії CtCHS

На основі послідовності CtCHS DNAMAN використовувався для розробки кількісних праймерів флуоресценції в реальному часі з F-box як внутрішнім еталонним геном. Послідовності праймерів наведені в таблиці 1. Відносна експресія CtCHS у квітках Cistanche deserticola різних кольорів була виявлена ​​за допомогою флуоресцентної кількісної ПЛР у реальному часі. Використовуйте TransStart Green qPCR SuperMix (повне золото, AQ101-02) для вимірювання методом флуоресцентного барвника SYBR Green, реакційна система: 2 × TransStart Green qPCR SuperMix 5 мкл, праймери вище та нижче за течією (10

мкмоль/л) {{0}}.2 мкл кожна, матриця кДНК 0,5 мкл, вода без нуклеотидази 4,1 мкл, для реакції використовувався двоетапний метод, а процедура реакції базувалася на методі Dong Xianjuan та ін. [18]. Кожен зразок містив 3 біологічні повтори, і експеримент повторювався тричі. Експериментальні дані аналізували за допомогою Excel до 2

Відносне вираження CtCHS було розраховано за допомогою методу −ΔΔCt, а GraphPad Prism 8 використовувався для виконання аналізу значущості та малювання гістограм.