Clec12a пом'якшує запалення, одночасно обмежуючи розширення колітогенного коменсалу

РЕЗЮМЕ

Регулювання мікробіоти має вирішальне значення для здоров’я кишечника, але механізми, які використовує вроджений імунітет, залишаються незрозумілими. Тут ми показуємо, що у мишей з дефіцитом лектинового рецептора С-типу Clec12a розвинувся важкий коліт, який залежав від мікробіоти. Дослідження трансплантації фекальної мікробіоти (FMT) на безбактерійних мишах виявили колітогенну мікробіоту, сформовану в мишах Clec12a-/-, яка була відзначена розширенням грампозитивного організму, гризунів Faecalibaculum. Лікування F. rodentium було достатнім для погіршення коліту у мишей дикого типу. Макрофаги в кишечнику експресують найвищі рівні Clec12a. Аналіз цитокінів і секвенування в макрофагах Clec12a-/- виявив посилене запалення, але помітне зменшення кількості генів, пов’язаних з фагоцитозом. Дійсно, здатність макрофагів Clec12a-/- поглинати F. rodentium порушена. Очищений Clec12a мав більш високий рівень зв’язування з грампозитивними організмами, такими як F. rodentium. Таким чином, наші дані ідентифікують Clec12a як вроджений механізм імунного нагляду для контролю за розширенням потенційно шкідливих комменсалів без явного запалення.

Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему

ВСТУП

Склад і функції мікробіоти можуть мати глибокий вплив на здоров’я та захворювання ссавців (Fassarella et al., 2021). Це було добре задокументовано для запальних захворювань кишечника (ВЗК), де більшість мишачих моделей ВЗК чутливі до змін у складі мікробіоти (Gkouskou et al., 2014). Розуміння факторів, які впливають на стабільність мікробіоти, буде важливим у міру розробки методів лікування на основі мікробіоти (Sharma et al., 2020; Sorbara and Pamer, 2022). На мікробіоту впливають численні параметри, включаючи дієту, ліки та імунну систему. В останні роки було показано, що компоненти адаптивного імунітету, особливо IgA, впливають на склад мікробіоти (Nakajima та ін., 2018; Okai та ін., 2016; Yang і Palm, 2020). Однак менше відомо про те, як специфічні вроджені імунні рецептори впливають на гомеостатичний склад мікробіоти.

Генетичні поліморфізми в генах, що регулюють мікробне розпізнавання та імунітет слизової оболонки, є значними алелями ризику для IBD, включаючи білок аутофагії ATG16L1 (Cadwell та ін., 2008; Liu та ін., 2015; Rioux та ін., 2007; Wellcome Trust Case Control, 2007). ). У недавньому дослідженні, присвяченому вивченню змін експресії мієлоїдного гена в осіб із поліморфізмом ATG16L1T300A, було виявлено, що інгібуючий лектиновий рецептор С-типу (CLR), Clec12a, значно пригнічений у цих клітинах (Begun et al., 2015). Це ж дослідження продемонструвало, що Clec12a функціонує для захисту від патогенної інфекції через зв’язок із шляхом аутофагії. Ці дані свідчать про те, що зниження регуляції Clec12a в осіб із ЗЗК може впливати на тяжкість та/або розвиток захворювання. Незважаючи на ці докази, мало відомо про механізми імунної регуляції, що здійснюються Clec12a під час коліту.

Лектини С-типу являють собою різноманітну групу розчинних або зв’язаних з мембраною молекул, здатних зв’язувати ліпіди, білки та вуглеводи, отримані як з організму господаря, так і з мікробів (Brown et al., 2018). Mincle (Clec4e) і Dectin-1 (Clec7a) є двома CLR, які впливають на певних членів мікробіоти для підтримки кишкового гомеостазу (Iliev et al., 2012; Martinez-Lopez et al., 2019). Однак, оскільки існує понад 1 000 різних лектинів С-типу, у цій родині білків ще багато чого належить відкрити. Clec12a належить до сімейства природних рецепторів-кілерів і є одним із лише двох лектинів С-типу, які містять мотив, що інгібує імунний тирозин (ITIM), здатний обмежувати сигнальні шляхи запалення (Brown та ін., 2018; Маршалл та ін., 2004). . Clec12a розпізнає сечову кислоту, яка є сигналом клітинного пошкодження (Neumann et al., 2014). Clec12a найбільш сильно експресується в клітинах вродженого імунітету, а в нейтрофілах він знижує активацію та знижує регуляцію запального цитокінового виробництва після розпізнавання сечової кислоти (Neumann et al., 2014). Навпаки, Clec12a сприяє запаленню, дозволяючи мононуклеарним фагоцитам (MNP) трансмігрувати через гематоенцефалічний бар’єр під час аутоімунної моделі розсіяного склерозу та потенціювати передачу сигналів інтерферону I типу у відповідь на вірусну інфекцію (Li та ін., 2019; Сагар та ін. ., 2017). Clec12a також здатний розпізнавати плазмодіальний продукт, гемозоїн, який, як було показано, збільшує кількість CD8+ Т-клітин у мозку після зараження плазмодіями (Raulf et al., 2019). Таким чином, Clec12a являє собою безладний CLR з різноманітними ролями в імунітеті та унікальними сигнальними можливостями, але його роль у кишечнику залишається невідомою.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Раніше ми продемонстрували, що специфічні кишкові грибки загострюють коліт, індукуючи пуриновий метаболіт, сечову кислоту (Chiaro et al., 2017). Крім того, метаболізм пуринів нещодавно був пов’язаний із кишковими захворюваннями людини (Zhu et al., 2019). Ці дані сукупно свідчать про те, що виявлення сечової кислоти може мати значення для IBD. Виходячи з цього, ми вирішили дослідити функцію Clec12a в кишечнику. Ми виявили, що тварини з дефіцитом Clec12a дуже сприйнятливі до коліту, який залежить від складу мікробіоти, сформованого за відсутності Clec12a. FMT мікробіоти Clec12a-/- у вільних від бактерій WT тварин був достатнім для загострення коліту, а формування колітогенної мікробіоти у тварин Clec12a-/- не залежить від адаптивного імунітету. Для виявлення відповідних мікробів, які можуть загострити коліт, Clec12a-/- тварин лікували різними антибіотиками, а ті, які були націлені на грампозитивні бактерії, полегшували захворювання. Секвенування 16S рДНК виявило, що Faecalibaculum rodentium значно більший у тварин Clec12a-/-, а перорального введення F. rodentium було достатньо для загострення патології захворювання у тварин WT. Імунне профілювання Clec12a-/- тварин виявило помітне зменшення гомеостатичних мієлоїдних клітин у товстій кишці. Секвенування РНК макрофагів, оброблених F. rodentium, показало, що Clec12a сприяє фагоцитозу. Оскільки було показано, що Clec12a зв’язує кілька лігандів, ми запитали, чи буде Clec12a зв’язуватися з різними представниками мікробіоти. Використовуючи злитий білок Clec12a-Fc, ми виявили, що Clec12a найсильніше зв’язується з грампозитивними представниками мікробіоти. Разом ці дані пропонують модель, за якою Clec12a контролює колітогенні члени мікробіоти шляхом прямого зв’язування та фагоцитозу, одночасно запобігаючи запальним реакціям. У сценаріях, коли експресія Clec12a знижена, грампозитивні патобіонти можуть розширюватися та сприяти запаленню. Таким чином, наші дослідження ідентифікують Clec12a як важливий супресор запалення для забезпечення гомеостазу та підтримки здорової мікробіоти.

РЕЗУЛЬТАТИ

Clec12a-/- тварини дуже сприйнятливі до коліту незалежно від адаптивної імунної системи

Повідомлялося про зниження експресії Clec12a в осіб із ЗЗК, і ми продемонстрували, що блокування вироблення одного з лігандів Clec12a, сечової кислоти, може полегшити коліт (Begun та ін., 2015; Chiaro та ін., 2017; Liu та ін. ., 2015). Однак Clec12a ще не вивчався на тваринних моделях коліту. З цією метою мишей WT і Clec12a-/- C57BL/6 заражали гострим колітом DSS. Тварини Clec12a-/- втратили значно більше ваги, показали коротшу товсту кишку та мали значне підвищення запального маркера LCN2 у калі порівняно з тваринами WT, що вказує на погіршення запалення та захворювання (рис. 1A-C). Підтверджуючи це, гістологічний аналіз виявив підвищене пошкодження епітелію, втрату крипт і приплив імунних клітин у Clec12a-/- тварин порівняно з WT (рис. 1D, E). Відповідно до результатів у моделі коліту DSS, перенесення клітин CD4+ CD45RBhi у TCRb-/-; Миші з подвійним нокаутом Clec12a-/- призвели до меншого збільшення ваги з часом і коротшої товстої кишки порівняно з Т-клітинами, перенесеними мишам TCRb-/- (рис. 1F, G). У сукупності ці результати демонструють, що втрата Clec12a призводить до погіршення кишкових захворювань.

Повідомляється, що Clec12a значною мірою експресується в клітинах вродженого імунітету з дуже низькою експресією в CD8+ Т-клітинах. Таким чином, щоб визначити, чи залучений адаптивний імунітет до загострення хвороби, що спостерігається у тварин Clec12a-/-, тварин Clec12a-/- схрестили з тваринами Rag-/- для видалення як Т, так і В-клітин. Знову ж таки, тварини Clec12a-/- розвинули погіршення захворювання порівняно з тваринами WT, оскільки вони втратили більше ваги та мали коротшу товсту кишку, ніж контрольні тварини WT (рис. 1H, I). Подібним чином, Clec12a-/-; У Rag-/- розвинулося погіршення кишкового захворювання порівняно з контрольною групою Rag-/-, і він втратив стільки ж ваги, а кишка була коротшою, ніж WT і Rag-/-, як Clec12a-/- (Малюнок 1H, I). Раніше ми повідомляли, що пероральне лікування S. cerevisiae підвищує рівень сечової кислоти, погіршуючи коліт. Однак не спостерігалося жодних відмінностей у рівнях сечової кислоти в сироватці крові або фекаліях у WT порівняно з тваринами Clec12a-/-, що свідчить про те, що посилене захворювання, яке спостерігається у Clec12A-/-, не є результатом підвищення сечової кислоти (рис. S1). Таким чином, погіршення розвитку коліту, що спостерігається у тварин Clec12a-/-, не залежить від адаптивної імунної системи.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Натисніть тут, щоб переглянути продукти Cistanche Enhance Imunity

【Запитуйте більше】 Електронна пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Загострення коліту у тварин Clec12a-/- залежить від мікробіоти

Відомо, що коліт частково спричинений змінами складу мікробіоти (Kubinak et al., 2015; Ray and Dittel, 2015). Щоб визначити, чи містять тварини Clec12a-/- мікробіоту, яка сприяє загостренню коліту, FMT проводили на мишах WT або Clec12a-/- на вільних від мікробів тваринах WT. Через чотири тижні після трансплантації половину тварин утримували разом, а іншу половину залишали окремо. Потім у кожній групі індукували гострий коліт DSS (рис. 2A). Тварини, які отримували Clec12a-/- FMT і тварини, які утримувалися спільно, втратили значно більше ваги (Малюнок 2B) і мали значно коротшу товсту кишку (Малюнок 2C), ніж тварини, які отримували FMT від мишей WT. Крім того, гістологічний аналіз виявив більше пошкодження епітелію та запальний приплив після трансплантації мікробіоти Clec12a-/- (рис. 2D, E). Встановлені мікробні спільноти відрізнялися серед груп, як визначено секвенуванням гена 16S рРНК за допомогою Брей-Кертіса (PERMANOVA, p=0.0001), незважене (PERMANOVA, p=0.0062) і зважене Відстані Unifrac (PERMANOVA, p=0.0001). Різниця між мікробіотами всередині групи була найбільшою у тварин, які утримувалися спільно, за однаковими показниками, що вказують на придбання мікробів від кожного генотипу FMT (рис. 2 FH). Ці дані вказують на те, що загострення коліту у тварин Clec12a-/- спричинене специфічними мікробами, збагаченими за відсутності Clec12a; і ці мікроби стали домінуючими рушійними силами колітогенного фенотипу, навіть за наявності встановленої мікробіоти WT.

Склад мікробіоти, сформований у Clec12a-/- тварин, не залежить від адаптивного імунітету

Імунна система важлива для визначення складу мікробіоти. Експеримент FMT показав, що Clec12a-/- призводить до зміни складу мікробіоти, що сприяє загостренню розвитку коліту. Спочатку ми хотіли визначити, чи здатний дефіцит Clec12a-/- в імунному відділі змінити форму мікробіоти кишечника. З цією метою кістковий мозок мишей WT або Clec12a-/- переносили в летально опромінених мишей-реципієнтів WT SPF для стандартизації мікробіоти з подальшим 8-тижневим періодом відновлення імунітету (рис. 3A). За цей час імунна система пересадженого органу встигає сформуватися в реципієнта, диференційовано формуючи склад мікробіоти. Щоб визначити, чи були проколітогенні зміни мікробіоти в результаті цього формування імунітету, ми виконали FMT з використанням фекалій химерних мишей WT або Clec12a-/- та індукованого коліту DSS (рис. 3A). Хоча суттєвих змін у втраті ваги не було (Малюнок 3B), товста кишка у тварин, які отримували FMT від химерних мишей Clec12a-/-, була значно коротшою порівняно з тваринами, які отримували FMT від мишей WT (Малюнок 3C), що вказує на загострення захворювання. Крім того, коли реципієнти WT і Clec12a-/- FMT містилися спільно, товсті кишки були значно коротшими порівняно з тваринами, які отримували WT FMT (рис. 3C). Таким чином, дефіцит Clec12a-/- в гемопоетичному відділі призводить до формування домінантної колітогенної мікробіоти.

Щоб додатково підтвердити, що адаптивна імунна система необхідна для формування колітогенної мікробіоти у Clec12a-/- тварин, ми провели FMT з використанням фекалій Rag-/- або Rag-/-; Clec12a-/- -, як описано раніше. Тварини, які отримали Rag-/-; Clec12a-/- FMT втратив більше ваги та мав значно коротшу товсту кишку, ніж у тварин, які отримали FMT від тварин Rag-/-, крім того, у тварин, які перебували у спільному утриманні, також розвинулося загострення захворювання (Рис. 3D, E). Ці дані демонструють, що дефіцит Clec12a у вродженій імунній системі достатній для формування мікробіоти, здатної загострювати коліт.

Clec12a пригнічує розмноження Faecalibaculum rodentium

Ми використали серію різних антибіотиків, щоб ідентифікувати відповідні організми, які викликають захворювання серед тварин Clec12a-/-. По-перше, лікування сильнодіючим коктейлем антибіотиків широкого спектру дії, які включають еритроміцин, ампіцилін, неоміцин і гентаміцин, значно зменшило тяжкість захворювання як у Clec12a-/-, так і у тварин WT, що свідчить про те, що бактеріальна популяція мікробіоти має значення для захворювання ( Рисунок 4A; Рисунок S2). Далі ми додатково звузили коло бактеріальних популяцій, які є найбільш відповідними для захворювання, використовуючи різні антибіотики, націлені на унікальні таксони бактерій. Зокрема, ми вибрали гентаміцин, аміноглікозид, спрямований на грамнегативні бактерії, і цефалотин, цефалоспорин, який в основному націлений на грампозитивні бактерії. Ці препарати вводили тваринам Clec12a-/- під час коліту DSS. Хоча лікування гентаміцином не вплинуло на тяжкість захворювання, тварини, які отримували цефалотин, зберігали свою вагу та мали значно довші товсті кишки, ніж тварини, які отримували імітаційне лікування (рис. 4B, C), що вказує на те, що грампозитивні організми, що мешкають у мікробіоті Clec12a-/-, грають важливу роль у загостренні патології захворювання.

Далі ми виконали секвенування гена 16S рРНК SPF WT і Clec12a-/- фекалій для профілювання змін складу мікробіоти. Тварини WT і Clec12a-/- кластеризувались значно по-різному як за нефілогенетичними, так і за філогенетичними показниками, зваженими на чисельність, Брей-Кертісом і зваженим UniFrac відповідно (рис. S3A-C). Показники альфа-різноманіття не виявили суттєвих відмінностей у багатстві (спостережувані особливості), що вказує на те, що Clec12a-/- не містить більше видів (рис. 4D). Однак індекси рівномірності та різноманітності Шеннона були збільшені за відсутності Clec12a, що вказує на те, що пропорційний розподіл бактерій у Clec12a-/- мишей було змінено (рис. 4E, F) і додатково підтверджує, що Clec12a важливий для регулювання структури мікробіоти в кишечнику.

Аналіз складу мікробіомів (ANCOM) показав, що серед ASV (варіантів послідовності ампліконів), які диференціально поширені, ASV, класифікований у роду Faecalibaculum (сімейство Erysipelotrichaceae), був значно розширений у калі Clec12a-/- порівняно з WT (рис. 4G, H). BLAST з використанням репрезентативної послідовності ASV з нашого аналізу вказав на 100% ідентичність послідовностей бактерій Faecalibaculum rodentium. Ці дані свідчать про те, що грампозитивні бактерії у тварині Clec12a-/- відповідають за колітогенний фенотип і вказують на причетність грампозитивних мікроорганізмів, F. rodentium, до погіршення хвороби.

Виходячи з цього, ми перевірили гіпотезу про те, що F. rodentium може загострити коліт. Ми попередньо обробили тварин WT SPF 1 x 108 КУО живого або фіксованого F. rodentium за допомогою ротового зонду та продовжували лікування щодня під час гострої моделі DSS, щоб забезпечити високий рівень колонізації F. rodentium. Тварини, які отримували як живий, так і фіксований F. rodentium, втратили більше ваги та мали значно коротшу товсту кишку, ніж тварини, які отримували носій (рис. 4I, J), що вказує на те, що підвищення рівня F. rodentium може погіршити захворювання.

Clec12a обмежує запальну реакцію макрофагів, одночасно посилюючи фагоцитоз

Щоб визначити клітинну експресію Clec12a за відсутності захворювання, ми профілювали вроджені та адаптивні імунні клітини у власній пластинці (LP) за допомогою багатоколірної проточної цитометрії. Відповідно до попередніх звітів, Clec12a переважно обмежений мієлоїдною лінією з невеликою або повною відсутністю експресії на лімфоцитах (Рис. 5A) (Han et al., 2004; Pyz et al., 2008; Sobanov et al., 2001). Кишкові нейтрофіли, макрофаги та дендритні клітини демонстрували подібні рівні експресії Clec12a (рис. S4A), тоді як макрофаги мали найбільший відсоток клітин у кишковій тканині, що експресують Clec12a (рис. 5A). Враховуючи подвійну роль макрофагів у стимулюванні запалення через класичну активацію, а також у ініціації репаративних механізмів у відповідь на пошкодження тканин, ми запитали, як Clec12a може вплинути на цю дихотомію під час коліту. Хоча макрофаги досить різноманітні, їх можна в цілому розділити на M1 запальні та M2 репаративні макрофаги за експресією CD38 та EGR2 відповідно. Ми показуємо, що тварини Clec12a-/- мають підвищену кількість макрофагів M1 і зменшену кількість макрофагів M2 у ЛП товстої кишки під час коліту (Рис. 5 B, C, Рис. S4B). Ці дані вказують на те, що Clec12a регулює реакції макрофагів у кишечнику.

Щоб краще зрозуміти, як Clec12a впливає на біологію макрофагів у відповідь на мікробні ліганди, макрофаги, отримані з кісткового мозку (BMDM), виділені з WT або Clec12a-/- тварин, обробляли різними поширеними мікробними лігандами, включаючи LPS, Pam3CysK і Flagellin. На всіх цих зразках проводили аналіз цитокінів. Багато досліджених цитокінів не були індуковані в цих умовах, однак MCP-1, IL-27, IFN-b, TNF-a та IL-6 були послідовно виявлені в цих культурах ( малюнок 5D). Clec12a-/- BMDM мали значно вищу експресію цих цитокінів у відповідь на багато мікробних лігандів, і найбільші диференціальні відповіді спостерігалися у відповідь на агоніст TLR2 Pam3CysK. Ці дані узгоджуються з відомою роллю Clec12a у послабленні запальних реакцій під час стерильного запалення (Neumann et al., 2014).

цистанхе рослина, що підвищує імунну систему

RNA-seq проводили на BMDM з WT або Clec12a-/-, оброблених F. rodentium, щоб визначити, як Clec12a регулює відповіді цих клітин на цей специфічний бактеріальний організм. Ми оцінили диференціальну реакцію, порівнявши Clec12a-/- BMDMs під впливом F. rodentium над транспортним засобом контролю з відповіддю WT BMDMs. Аналіз збагачення диференціально експресованих генів показав, що макрофаги з дефіцитом Clec12a мали значне збільшення генів, залучених до контролю клітинного циклу, під час зараження F. rodentium (рис. S5A). Клітинний цикл невід'ємно пов'язаний з фагоцитозом, і також спостерігалося значне зниження генів, пов'язаних з фагоцитозом і запальною відповіддю (Рис. 5E) (Luo et al., 2005). Згідно з нещодавнім дослідженням Clec12a та Salmonella, ці дані свідчать про те, що фагоцитоз є дефектним за відсутності Clec12a у відповідь на нормальний резидент кишечника F. rodentium (Begun et al., 2015). Щоб перевірити це, перитонеальні макрофаги були зібрані у тварин WT і Clec12a-/- та спільно культивовані з міченим Sybr®-green F. rodentium. Макрофаги Clec12a-/- мали значно менше мікробів на клітину (рис. 5F, G; рис. S5B), що вказує на те, що дефіцит Clec12a призводить до поглинання меншої кількості організмів і узгоджується зі зниженим фагоцитозом у наборі даних RNA-seq. У сукупності ці дані показують, що Clec12a відіграє подвійну роль, пом’якшуючи явні запальні реакції на звичайні мікробні ліганди, одночасно сприяючи поглинанню бактеріями макрофагами.

Clec12a переважно зв’язується з грампозитивними коменсалами

Оскільки фагоцитоз ініціюється зв’язуванням мікробів з подальшою інтерналізацією та знищенням, ми припустили, що Clec12a здатний зв’язуватися з конкретними представниками мікробіоти, такими як F. rodentium. Щоб розглянути цю можливість, було створено злитий білок, що містить позаклітинний зв’язувальний домен мишачого Clec12a та Fc-частину людського IgG1 (Clec12a-Fc) (Малюнок 6A) (Maglinao та ін., 2014; Neumann та ін., 2014; Raulf). та ін., 2019). Білок був очищений і перевірений на зв’язування з групою різноманітних грампозитивних і грамнегативних бактерій, які, як відомо, присутні в гомеостатичному кишечнику, включаючи F. rodentium, Roseburia spp., Bifidobacteria animalis, Akkermansia muciniphila, Bacteriodes uniformis, та грибкового коменсалу Candida albicans за допомогою проточної цитометрії. Salmonella enterica також була включена, оскільки попередні дослідження показали, що Clec12a може асоціюватися з проникненням S. enterica в клітину (Begun et al., 2015). Clec12a різною мірою зв’язувався з кількома філогенетично відмінними бактеріями, включаючи F. rodentium, але не з грибами C. albicans (рис. 6B). Clec12a найбільше зв’язувався з грампозитивними організмами F. rodentium і представником родини Lachnospiraceae Roseburia sp., і найменше взаємодіяв з B. animalis, B. uniformis і S. enterica (рис. 6B), що вказує на те, що Clec12a може зв’язуються з певними представниками мікробіоти, віддаючи перевагу грампозитивним організмам. У сукупності наші дані ідентифікують Clec12a як механізм, який використовується імунною системою для дослідження спільноти кишкових мікробів і скорочення мікробіоти шляхом прямого зв’язування та фагоцитозу, одночасно запобігаючи явним запальним реакціям на велику кількість грампозитивних мікробів, що є критичним для підтримки здоров’я кишечника.

ДИСКУСІЯ

Для гомеостазу в кишечнику потрібні механізми для обмеження комменсальних мікробів без ініціювання пошкодження запалення (Macpherson et al., 2000). В останні роки IgA став одним із найважливіших способів, за допомогою яких кишковий імунітет може здійснювати контроль над мікробіотою (Pabst and Slack, 2020). Дійсно, IgA здатний безпосередньо зв’язуватися з мікробами та/або їх продуктами та виводити їх із кишечника без індукції прототипового запалення. Інші імунні молекули, які володіють цими подвійними властивостями, на сьогоднішній день не вивчені. Лектини С-типу включають різноманітний клас білків, які можуть розпізнавати різноманітні білкові, вуглеводні та ліпідні молекули з мікробних продуктів і продуктів господаря (Brown et al., 2018; Drouin et al., 2020). Однак мало досліджено в контексті кишкового імунітету та мікробіоти (Iliev et al., 2012; Martinez-Lopez et al., 2019). Таким чином, наскільки нам відомо, це перша демонстрація того, що дефіцит Clec12a змінює склад мікробіоти, що сприяє тяжкості захворювання.

Cistanche корисний для зміцнення імунної системи

Clec12a значною мірою вивчався в контексті розпізнавання урату натрію (MSU) або сечової кислоти, що часто є ознакою клітинної смерті (Kono та ін., 2010; Neumann та ін., 2014). Сечова кислота здатна активувати запальні реакції через інфламмасому NLRP3, тому, щоб запобігти руйнуванню тканин під час клітинної смерті, це запалення необхідно контролювати (Martinon et al., 2006). Показано, що Clec12a врівноважує цю запальну реакцію через зниження регуляції передачі сигналів Syk (Marshall et al., 2004). Відповідно до цього, делеція Clec12a в моделі стерильного запалення та аутозапальній моделі артриту викликає посилену активацію нейтрофілів і погіршення захворювання, що робить Clec12a важливим гальмом запалення (Redelinghuys et al., 2016). Однак нещодавно було також продемонстровано, що Clec12a посилює передачу сигналів інтерферону типу I у відповідь на вірусну інфекцію та опосередковує поглинання сальмонели через шлях антибактеріальної аутофагії (Begun та ін., 2015; Li та ін., 2019). Це демонструє, що Clec12a функціонує не лише для обмеження запалення, а може відігравати різні ролі залежно від контексту. Кишечник відрізняється тим, що в ньому знаходиться велика кількість імунних клітин навіть при відсутності захворювань. Це пов’язано з наявністю мікробіоти, яка відіграє важливу роль у формуванні імунітету та запобіганні колонізації патогенних організмів. Мікробіота має ті самі структури поверхні, які виявляються TLR, які також розпізнають патогени, і тому імунна система кишечника повинна мати суворі регуляторні механізми, щоб стримувати запалення цих чужорідних організмів (Blander et al., 2017).

Спочатку ми зацікавилися Clec12a, оскільки визначили, що кишкові гриби Saccharomyces cerevisiae індукують сечову кислоту для погіршення коліту (Chiaro та ін., 2017). Крім того, інші дослідження показали, що мікробіота може впливати на захворювання кишечника через індукцію метаболізму пуринів, кінцевим продуктом якого у ссавців є сечова кислота (Zhu et al., 2019). Ці дані свідчать про те, що механізми визначення сечової кислоти, такі як Clec12a, можуть впливати на гомеостаз кишечника. Однак ми не спостерігали жодних змін рівнів сечової кислоти в сироватці крові або фекаліях, що вказує на те, що посилення тяжкості захворювання у тварин Clec12a-/- не було спричинене підвищенням сечової кислоти. Однак підвищена тяжкість коліту в Clec12a-/- зумовлена ​​складом мікробіоти. Таким чином, виходячи з наших даних, знижена експресія Clec12a-/- може впливати на склад мікробіоти у пацієнтів із ЗЗК (Jason L. Kubinak, 2015; Rehman et al., 2011; Vijay Kumar et al., 2010). Цікаво, що ми виявили, що антибіотики, націлені на грампозитивні мікроорганізми, здатні зменшити тяжкість коліту у тварин Clec12a-/-. Це відрізняється від кількох повідомлень, які ідентифікували розширення грамнегативних Enterobacteriaceae під час кишкового запалення, таким чином, це одне з небагатьох досліджень, яке виявило розширення грампозитивних мікроорганізмів, які пов’язані з розвитком коліту. Хоча це, ймовірно, не єдиний організм, який впливає на тяжкість коліту в цій моделі, різке розширення F. rodentium спостерігалося у тварин Clec12a-/-. F. rodentium є грампозитивним, оксидазним і каталазонегативним представником типу Firmicutes (Bacillota) (Chang et al., 2015). Щоденне введення F. rodentium навіть мишам WT посилює коліт, підтверджуючи те, що підвищені рівні F. rodentium у кишечнику шкідливі та, ймовірно, призводять до тяжкості коліту в Clec12a-/-. Недавній звіт продемонстрував, що F. rodentium може збільшувати епітеліальний оборот і пригнічувати експресію ферментів всередині епітелію, які пригнічують запальні реакції, що відповідає загостренню захворювання, яке ми спостерігаємо, коли F. rodentium розмножується в кишечнику (Cao et al., 2022). Оскільки люди колонізовані організмом, схожим на F. rodentium (Zagato та ін., 2020), подальші дослідження повинні з’ясувати вплив цих F. rodentium-подібних бактерій на аспекти фізіології людини, пов’язані з колітом.

Підтримуючи роль Clec12a серед клітин вродженого імунітету, ми спостерігали, що колітогенна мікробіота все ще формується у Clec12a-/- тварин, які не мають адаптивної імунної системи. Найвищий відсоток клітин у кишечнику, які експресують Clec12a, були макрофагами, що змусило нас зосередитися на функції Clec12a в цих клітинах. Попередні дослідження показали, що Clec12a є важливим посередником вироблення інтерферону типу I у відповідь на вірусну інфекцію (Li et al., 2019). Однак не було оцінено, як Clec12a впливає на реакцію на широкий спектр бактеріальних лігандів; це дуже актуально в кишечнику, де існує велика кількість лігандів TLR. Тут ми показуємо, що Clec12a служить для стримування реакцій макрофагів у кишечнику та, ймовірно, функціонує для забезпечення гомеостазу у відповідь на мікробіоту. RNA-seq макрофагів, інкубованих з F. rodentium, підкреслив, що дефіцит Clec12a призводить до дефектів клітинного циклу та фагоцитозу у відповідь на ці комменсальні бактерії. Недавнє дослідження показало, що макрофаги Clec12a-/- зменшили аутофагію у відповідь на Salmonella (Begun et al., 2015). Наші дані доповнюють і розширюють ці висновки, включаючи те, що Clec12a також функціонує для контролю неінвазивних комменсальних організмів. Інші дослідники показали, що F. rodentium впливає на епітеліальну біологію, що свідчить про те, що F. rodentium знаходиться в безпосередній близькості від хазяїна і, отже, має жорстко контролюватися імунною системою. Наші дані підтверджують, що Clec12a контролює F. rodentium через регуляцію фагоцитозу. Фагоцитоз ініціюється фізичним зв’язуванням ліганду або мікроба, і лектини С-типу можуть асоціюватися з кількома лігандами, що змусило нас перевірити, чи може Clec12a асоціюватися безпосередньо з кишковими бактеріями. Цікаво, що Clec12a найбільше зв’язувався з грампозитивними організмами F. rodentium і Roseburia і набагато менше з грамнегативними організмами A. muciniphila і B. uniformis і зовсім не зв’язувався з C. albicans. Ці дані показують, що Clec12a має схильність зв’язувати певних членів мікробіоти. Це дозволяє нам побудувати модель, за допомогою якої залучення Clec12a та подальший фагоцитоз можуть контролювати певних членів мікробіоти та запобігати потенційно шкідливим наслідкам їхнього розширення. Це підкреслює подвійну функцію Clec12a, яка може стримувати запалення проти мікробних лігандів, а також розпізнавати та контролювати певних членів мікробіоти. Таким чином, Clec12a являє собою унікальний спосіб, який використовує вроджена імунна система для забезпечення гомеостазу в шлунково-кишковому тракті.

ЛЕГЕНДИ ФІГУР

Рисунок 1. Clec12a стримує кишкові захворювання незалежно від адаптивної імунної системи

(A) Щоб оцінити тяжкість коліту WT або Clec12a-/- C57BL/6, вільних від специфічних патогенів (SPF), мишей лікували 2,5% декстрану сульфату натрію (DSS) ad libitum протягом 7 днів у питній воді. Відсоток втрати ваги оцінювався щодня. Середнє значення +/- SEM, дані об’єднані з трьох незалежних експериментів із використанням двофакторного дисперсійного аналізу та тесту множинного порівняння Шідака.

(B) Довжину товстої кишки (см) зазначених тварин вимірювали під час умертвіння. Діаграма розсіювання – це середнє значення +/- SEM, дані об’єднані з трьох незалежних експериментів за допомогою непарного t-критерію. Кожна точка представляє одну мишу

(C) Фекальний ліпокалін-2 (нг/мл) зазначених тварин вимірювали як показник запалення. Гістограма – це середнє значення +/- SEM, дані об’єднані з двох незалежних експериментів за допомогою непарного t-критерію. Кожна точка представляє одну мишу

(D) Репрезентативні пофарбовані H&E зрізи товстої кишки від зазначених тварин після коліту, індукованого DSS.

(E) Гістологічні оцінки для вказаних тварин були отримані зі зрізів товстої кишки в

(D). Гістограма є середнім значенням +/- SEM, порівняним за допомогою непарного t-критерію. Кожна точка представляє одну мишу.

(F) Для оцінки хронічного коліту була виконана модель Т-клітинного перенесення коліту. Вага тварин TCRb-/- і Clec12a-/-; TCRb-/- вимірювалася щотижня. На графіку показано відсоток втрати ваги зазначених тварин протягом експерименту. Середнє +/- SEM порівняно з 2-way ANOVA.

(G) Довжину колонії вказаних тварин з (I) вимірювали під час умертвіння. Гістограма є середнім значенням +/- SEM, порівняним за допомогою непарного t-критерію. Кожна точка представляє одну мишу.

(H) Мишей WT, Clec12a-/-, Rag-/- або Rag-/-; Clec12a-/- C57BL/6 SPF оцінювали на наявність гострого коліту. Зазначеним тваринам вводили 2,5% DSS ad libitum протягом 7 днів. Відсоток втрати ваги оцінювався щодня. Середнє +/- SEM, дані репрезентативні для двох незалежних експериментів. Двосторонній дисперсійний аналіз і тест множинного порівняння Шідака.

(I) Довжину товстої кишки (см) зазначених тварин вимірювали під час умертвіння. Гістограма є середнім +/- SEM, дані репрезентативні для двох незалежних експериментів із використанням непарних t-тестів. Кожна точка представляє одну мишу * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

Рисунок 2. Мікробіота, що утворилася у тварин Clec12a-/-, викликає загострення коліту

A) Трансплантацію фекальної мікробіоти (FMT) проводили шляхом перенесення фекальних супернатантів від тварин WT або Clec12a у вільних від мікробів мишей WT. Мікробіотам дозволили гомогенізуватися протягом чотирьох тижнів, після чого половину мишей WTFMT і половину мишей Clec12a-/-FMT помістили разом і дали змішатися ще чотири тижні. Потім усі групи отримували 2,5% DSS ad libitum у питній воді та були забиті на 7-й день.

B) Відсоток втрати ваги зазначених тварин оцінювали щодня. На графіку зображено середнє +/- SEM, дані об’єднані з двох незалежних експериментів із використанням двофакторного дисперсійного аналізу та тесту множинного порівняння Шідака.

C) Довжину товстої кишки (см) у зазначених тварин вимірювали під час умертвіння. Діаграма розсіювання – це середнє +/- SEM, порівняне за допомогою звичайного одностороннього дисперсійного аналізу з тестом багаторазових порівнянь Даннета. Кожна точка представляє одну мишу.

D) Репрезентативні пофарбовані H&E зрізи товстої кишки зазначених тварин після коліту, індукованого FMT та DSS.

E) Гістологічні оцінки були отримані зі зрізів товстої кишки в (D). Гістограма є середнім значенням +/- SEM, порівняним за допомогою непарного t-критерію. Кожна точка представляє одну мишу.

F) Зважені відстані Unifrac від секвенування гена 16S рРНК WTFMT, Clec12a-/- FMT або тварин, які утримуються спільно. Коробчасті та вусисті графіки, що показують усі точки (попарне порівняння відстаней) і порівнюються за допомогою тесту Краскела-Уолліса.

G) Незважені відстані Unifrac від секвенування гена 16S рРНК WTFMT, Clec12a-/- FMT або тварин, які утримуються спільно. Коробчасті та вусисті графіки, що показують усі точки (попарне порівняння відстаней) і порівнюються за допомогою тесту Краскела-Уолліса.

H) Відстань Брей-Кертіса від секвенування гена 16S рРНК WTFMT, Clec12a-/- FMT або тварин, які утримуються спільно. Коробчасті та вусисті графіки, що показують усі точки (попарне порівняння відстаней) і порівнюються за допомогою тесту Краскела-Уолліса.

Рисунок 3: Склад мікробіоти, сформований у тварин Clec12a-/-, не залежить від адаптивного імунітету

A) Схематична діаграма, що демонструє відновлення кісткового мозку з наступним FMT. Мишей C57Bl/6 WT смертельно опромінили та відновили за допомогою WT або Clec12a-/- кісткового мозку. Через 8 тижнів у цих мишей брали фекалії та переносили в мишей без мікробів WT, як пояснюється в (A). Спочатку відновленим химерним тваринам потім додавали 2,5% DSS ad libitum у їхній питній воді.

B) Відсоток втрати ваги мишей FMT з (F) оцінювався щодня. Середнє значення +/- SEM, використовуючи двосторонній дисперсійний аналіз і тест множинного порівняння Тьюкі.

C) Довжину товстої кишки (см) у зазначених тварин вимірювали під час умертвіння. Діаграма розсіювання – це середнє +/- SEM, непарний t-тест. Кожна точка представляє одну мишу

D) FMT для оцінки ролі адаптивної імунної системи у формуванні мікроорганізмів і тяжкості коліту проводили шляхом перенесення супернатантів калу з Rag-/- або Rag-/-; Тварин Clec12a-/- SPF на безбактерійних мишей WT, як описано в (A). Мишей обробляли 2,5% DSS протягом 7 днів. Відсоток втрати ваги оцінювався щодня. На графіку представлено середнє значення +/- SEM з використанням двофакторного дисперсійного аналізу та тесту множинного порівняння Тьюкі.

E) Довжину товстої кишки (см) у зазначених тварин у (F) вимірювали під час умертвіння. Середнє +/-, SEM порівнювали за допомогою звичайного одностороннього дисперсійного аналізу та множинного порівняльного тесту Данне. Кожна точка представляє одну мишу. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

Малюнок 4. Clec12a обмежує поширення гризунів Faecalibaculum, мікроба, який погіршує коліт

A) Мишам WT або Clec12a-/- C57BL/6 SPF давали антибіотичний коктейль (A) (неоміцин, гентаміцин, ампіцилін, еритроміцин), цефалотин або гентаміцин (B, C) у концентрації 0. 5 г/л протягом чотирнадцяти днів. Через сім днів тваринам давали 2,5% DSS у питній воді до моменту забиття. Довжину товстої кишки (см) у вказаних тварин вимірювали під час умертвіння. Діаграма розсіювання – це середнє +/- SEM, непарний t-тест. Кожна точка представляє одну мишу.

B) Відсоток втрати ваги зазначених тварин оцінювали щодня. Графік являє собою середнє +/- SEM з використанням двофакторного дисперсійного аналізу та тесту множинного порівняння Тьюкі

C) Довжина товстої кишки (см) зазначених тварин, виміряна під час умертвіння. Діаграма розсіювання – це середнє +/- SEM, непарний t-тест. Кожна точка представляє одну мишу.

D) Спостережувані ознаки WT або Clec12a-/- фекалій, альфа-різноманіття секвенування 16S рРНК. Середнє значення +/- SEM, порівняно за допомогою тесту Манна-Уітні.

E) Рівність Pielou з WT або Clec12a-/- фекалій, альфа-різноманіття секвенування 16S рРНК. Середнє значення +/- SEM, порівняно за допомогою тесту Манна-Уітні.

F) Середнє значення ентропії Шеннона +/- SEM, порівняно за допомогою тесту Манна-Уітні.

G) ANCOM аналіз WT і Clec12a-/- фекалій. Таксономічні назви є найкращою класифікацією ASV з використанням таксономічної бази даних геному (GTDB).

H) Відносна чисельність ASV Faecalibaculum rodentium. Порівняно за допомогою Mann Whitney * p < {{0}}.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

I) Мишей C57Bl/6 WT SPF попередньо обробляли 1x108 КУО F. rodentium перорально протягом трьох днів. Потім тварини отримували 2,5% DSS у питній воді протягом 7 днів, продовжуючи щоденне введення через зонд F. rodentium. Відсоток втрати ваги оцінювався щодня. Середнє +/- SEM, Дані об’єднані з чотирьох окремих експериментів із застосуванням двофакторного дисперсійного аналізу та тесту множинного порівняння Тьюкі.

J) Довжину товстої кишки (см) зазначених тварин вимірювали під час умертвіння. Гістограма є середнім значенням +/- SEM. Дані об’єднані з чотирьох окремих експериментів, порівнюваних за допомогою звичайного одностороннього дисперсійного аналізу з тестом багаторазової корекції Данне. Кожна точка представляє одну мишу. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

Рисунок 5. Clec12a обмежує запалення та сприяє фагоцитозу в макрофагах.

A) Імунофенотипування проводили за допомогою проточної цитометрії на клітинах, виділених із власної пластинки товстої кишки (cLP) на тваринах WT і Clec12a-/-. Теплова карта показує частоту експресії Clec12a на клітинах вродженого та адаптованого імунітету

B) Гістограма показує частоту передворітних клітин CD38+ (макрофагів M1) із cLP зазначених тварин. Середнє значення +/- SEM, порівняно за допомогою непарного t-тесту. Кожна точка представляє одну мишу.

C) Стовпчаста діаграма показує частоту передворітних клітин EGR2+ (макрофагів M2) із cLP зазначених тварин. Середнє значення +/- SEM, порівняно за допомогою непарного t-тесту. Кожна точка представляє одну мишу.

D) BMDM збирали з довгих кісток WT і Clec12a-/- і культивували в присутності M-CSF (20 нг/мл) протягом 7 днів. На 8-й день BMDM обробляли LPS (100 нг/мл), MDP (10 мг/мл), Pam3cysk (1 мг/мл) або Flagellin (1 мг/мл) протягом 24 годин. Середовища збирали та аналізували на продукцію цитокінів. Теплова карта показує Log2-кратну зміну вказаних цитокінів від Clec12a-/- порівняно з WT.

E) BMDM мишей WT і Clec12a-/- виділяли та культивували, як у (A), а потім спільно культивували з F. rodentium при MOI 10 протягом 24 годин. Після промивання BMDM РНК збирали та готували для секвенування РНК. 10 найкращих спрощених категорій термінів GO (біологічний процес) збагачено серед Clec12a-/- зниженого регулювання

F) Перитонеальні макрофаги були виділені з WT і Clec12a-/- мишей, а потім спільно культивовані з F. rodentium, пофарбованими в зелений колір Sybr, для оцінки фагоцитозу. Зліва: макрофаги WT. Справа: Clec12a-/- макрофаги. Зображені репрезентативні зображення зі світлого поля (ліві стовпці), флуоресценції (середні стовпці) і об’єднані (праві стовпці). Жовті стрілки позначають приклади клітин F. rodentium, поглинених макрофагами. шкала=20 мкм. Зображення є репрезентативними для двох окремих експериментів.

G) Гістограма показує організми на клітину, як показано на (F). Для кількісного визначення кількості F. rodentium на клітину було підраховано 250 клітин WT і 269 клітин Clec12a-/-.

Рисунок 6: Clec12a безпосередньо зв’язується з конкретними членами мікробіоти.

A) Схематична діаграма, що зображує злитий білок Clec12a-IgG1-Fc людини або порожній вектор (тільки частина Fc) B) Гістограми проточної цитометрії, що представляють диференціальне зв’язування Clec12a-Fc з різними бактеріями або C. albicans.

ЛЕГЕНДИ ДОДАТКОВИХ МИСЮКІВ

Додатковий малюнок 1. Відсутність Clec12a не порушує рівні сечової кислоти.

A) Сечову кислоту в сироватці (мкМ) зазначених тварин вимірювали для оцінки метаболізму пуринів між мишами WT і Clec12a-/- C57Bl/6. Діаграма розсіювання – це середнє значення +/- SEM, дані об’єднані з трьох незалежних експериментів за допомогою непарного t-тесту. Кожна точка представляє одну мишу.

B) Фекальну сечову кислоту (мкМ) зазначених тварин вимірювали для оцінки кишкової екскреції сечової кислоти між мишами WT і Clec12a-/- C57Bl/6. Діаграма розсіювання – це середнє значення +/- SEM, дані об’єднані з трьох незалежних експериментів за допомогою непарного t-тесту. Кожна точка представляє одну мишу.

Додатковий малюнок 2. Мікробіоти WT і Clec12a-/- викликають диференціальне захворювання

Відсоток втрати ваги тварин WT і Clec12a-/-, які отримували антибіотичний коктейль, що складається з неоміцину, гентаміцину, ампіциліну та еритроміцину.

Додатковий малюнок 3. На склад мікробіоти впливає Clec12a.

A) Графіки PCoA перших 3 осей на основі відстаней Брея-Кертіса, що показують загальні зв’язки між мікробіотами, і відповідні діаграми коробки та вусів, що кількісно визначають відмінності в кожній групі та порівнюються з тестом Манна-Уітні.

B) Діаграми PCoA на основі зважених відстаней Unifrac і відповідних графіків коробки та вусів, що кількісно визначають внутрішньогрупову відмінність у порівнянні з використанням непарного тесту Манна-Уітні.

C) Таблиця, що показує результати тесту PERMANOVA для WT проти Clec12a-/- фекальної мікробіоти з Bray-Curtis та зваженими відстанями Unifrac.

Додатковий малюнок 4: Clec12a в макрофагах обмежує запалення.

A) Скрипкові графіки зображують середньогеометричну інтенсивність флуоресценції (MFI) імунних клітин, показаних на (A). Середнє значення +/- SEM, тест Крускала-Уолліса з поправкою Данна для кількох порівнянь. Букви позначають групи, які істотно відрізняються.

B) Репрезентативні графіки проточної цитометрії макрофагів M1 і M2 з cLP мишей WT або Clec12a-/- після коліту DSS. Клітини попередньо піддано гейту на live, CD45+, Ly6C-, CD11b+, MHCII+ і CD64+. З малюнка 5A

Додатковий малюнок 5. Clec12a стабілізує контроль клітинного циклу та регулює фагоцитоз у макрофагах.

A) Топ-10 спрощених категорій GO (біологічний процес), збагачених генами Clec12a-/- з підвищеною регуляцією порівняно з WT у відповідь на F. rodentium. BMDM мишей WT і Clec12a-/-, культивованих спільно з F. rodentium, виділяли та аналізували, як показано на малюнку 7A.

B) Peritoneal macrophages were prepared as described and co-cultured with Sybr®-green stained F. rodentium. Bacteria cells were counted inside macrophages. >Було підраховано 200 макрофагів. Гістограма показує середню кількість F. rodentium з 4 окремих лунок, щоб показати узгодженість підрахунку та ефект у лунках. Середнє значення +/- SEM порівняно за допомогою непарного t-критерію.

ПОДЯКА

Ми хотіли б подякувати Гордону Брауну за надання тварин Clec12a-/- для цього проекту. Ця робота була підтримана Фондом Хелен Хей Вітні (KSO), Університетом штату Юта NRSA Microbial Pathogenesis T32 Training Grant (KSO), премією CCFA Senior Research Award (JLR), NIDDK R01DK124336, NIDDK R01124317 і NCCAM R01AT011423 (JLR), Едвард Маллінкродт Jr. Foundation (JLR), NSF CAREER Award (IOS-1253278) (JLR), Packard Fellowship in Science and Engineering (JLR), Burroughs Welcome Investigator in Pathogenesis Award (JLR), American Asthma Foundation (JLR), Margolis Foundation (JLR), грант MS Society Center (JLR) і WM Keck Foundation (JLR) NIH New Innovator Award DP2GM111099-01 (RMO), NHLBI R00HL102228-05 ( RMO), грант на дослідження Американського онкологічного товариства (RMO), премія Kimmel Scholar Award (RMO), R01AG047956 (RMO) та NIAID R01AI141202 (ASI). Ця робота була підтримана Центром проточної цитометрії Університету Юти на додаток до Національного інституту раку через нагороду № 5P30CA042014-24. Висловлюємо вдячність за підтримку та ресурси Центру високопродуктивних обчислень Університету Юти.

АВТОРСЬКИЙ ВНЕСОК

TRC допоміг задумати дослідження, виконав більшість експериментів з мишами та імунології, об’єднав дані в цифри та допоміг написати рукопис. RB поставив безбактеріальні експерименти та утримував усіх вільних від мікробів тварин. ESV допоміг з імунологічними експериментами з власною пластинкою кишечника. KSO допоміг з мишачим урожаєм і надав розуміння та напрямок. КМБ допомогло зі збором мишей і проточною цитометрією. MCN допоміг з мишачими врожаями. WV надав допомогу у створенні конструкції для злитого білка та очищення. TJ надав допомогу з аналізами фагоцитозу. JH проаналізував мікроскопічні препарати фагоцитозу. MH надала допомогу в очищенні та використанні злитого білка. КАК надає бактеріальні ізоляти. ROC надала імунологічну експертизу та розуміння. WZS допоміг задумати дослідження, виконав біоінформаційний аналіз, допоміг у підготовці фігур і статистики, а також допоміг написати рукопис. JLR допоміг задумати та скерувати дослідження, наглядав за дизайном експерименту та результатами, організував співавторів та реагенти, залучив фінансування для дослідження та допоміг написати рукопис.

МЕТОДИ

Штами мишей

Усі лінії миші, використані тут, були на фоні C57BL/6. Миші Clec12a-/- були люб'язно надані Гордоном Брауном (Медичний науково-дослідний центр медичної мікології, Університет Ексетера) і були генотиповані згідно з раніше описаним протоколом (Redelinghuys, et al. 2016). Rag2-/- і TCRb-/- (Jackson Laboratories, 002118) були отримані від Jackson Laboratories і зберігалися в нашій колонії мишей протягом кількох поколінь. Для всіх експериментів з колітом in vivo використовувалися миші однакової статі віком від 8 до 12- тижнів. Використовували як самців, так і самок мишей. Мишей утримували в умовах, вільних від патогенів.

Бактеріальні та грибкові штами

Наступні організми були отримані з DSMZ-German Collection of Microorganism and Cell Cultures GmbH: Faecalibaculum rodentium (DSM# 103405); Akkermansia mucinophilia DSMZ (DSM# 26127); Bifidobacterium animalis DSMZ (DSM# 26074). Bacteroides uniformis було отримано з Американської колекції типових культур (ATCC® 8492™). Roseburia sp (позначення штаму JLR.KK002) було виділено на агарі Шедлера від мишей C57BL/6, які містили мікробіоту, збагачену спорами. Збагачення спорами проводили, як описано раніше, і мишей підтримували протягом кількох поколінь із цією мікробіотою в нашому гнотобіотичному закладі до того, як JLR.KK002 було виділено з фекалій (Browne et al., 2016). Ми провели ПЛР-ампліфікацію, і Сенгер секвенував ген 16S рРНК, а потім класифікував його за допомогою служби SILVA ACT і бази даних SILVA (Pruesse et al., 2012). Використовували штам Salmonella typhimurimum ST2. Використовували штам Candida albicans sc5314. Штами бактерій, які використовуються в синтетичній спільноті PhyLo11b, описані нижче.

DSS-індукований експериментальний коліт

Коліт індукували додаванням 2,5% або 3% (мас./об.) 36,000-50,000MW декстрану сульфату натрію (DSS) (MP Biomedicals) у питну воду протягом 7 днів. Тяжкість коліту контролювали щоденно за зміною маси тіла, консистенції випорожнень та крові у калу. Для експерименту зі збереження моноцитів усі миші отримували 2,5% DSS протягом 5 днів, після чого давали звичайну воду; моніторинг ваги продовжувався до 10-го дня, коли тварин збирали. Обмеження тяжкості більше ніж 20% втрати ваги були встановлені як поріг тяжкості. У кінцевих точках експерименту MLN і товсту кишку видаляли. Для визначення довжини товсту кишку вимірювали від сліпої кишки до прямої кишки. Потім тканини обробляли для гістології, екстракції РНК або проточної цитометрії.

Гістологія товстої кишки та оцінка

Colons were fixed within histology cassettes O/N at RT in 10% buffered formalin phosphate solution after removal of fecal contents and then transferred to 70% EtOH at 4 C until staining. Sectioning and H&E staining were done at the HCI Biorepository and Molecular Pathology Resource core in the ARUP-operated Research Histology division. Colon scoring was done in a blinded manner with the following rubric scales: percentage of colon crypt loss (0.5 (5%) - 7 (>75%)), crypt loss severity (1 (partial loss) – 5 (full loss)) and inflammatory aggregates (1 (1-3) – 3 (>7)).

Ліпокалін-2 (LCN-2) ІФА

Протокол було виконано згідно з протоколом виробника (Fischer Scientific DY1857-05). Коротко кажучи, фекалії збирали, зважували та розтирали в HBSS 1X у концентрації 100 мг/мл. Потім зразки обертали при 50 xg протягом 5 хвилин, щоб видалити великі залишки. Потім супернатант видаляли, поміщали в нову пробірку і обертали при 8000 xg протягом 5 хвилин, щоб осадити бактерії. Цей супернатант потім розбавляли відповідно до захворювання тварин, але загалом варіювався від 1:100- 500 (здорові) до 1:500-1000 (оброблені DSS). Вимірювання сечової кислоти. Концентрацію сечової кислоти проводили згідно з інструкціями виробника (набір для аналізу активності сечі/урікази Invitrogen™ Amplex™ Red, кат. № A22181). Коротко, кров збирали у мишей WT або Clec12a-/- шляхом пункції серця в пробірки сепаратора сироватки із золотим верхом. Пробірки залишали для згортання протягом 30 хвилин, а потім обертали при 1300 x g протягом 10 хвилин. Сироватку вилучили та помістили в пробірки Eppendorf об’ємом 1,5 мл, швидко заморозили та зберігали при -80 градусах Цельсія до тестування. Фекальну сечову кислоту досліджували шляхом отримання свіжих фекальних гранул від мишей WT і Clec12-/-. Гранули зважували і записували, а потім розтирали в 1 мл 1x реакційного буфера. Після фізичного затирання пробірки обертали при 50 xg протягом 5 хвилин, щоб видалити великі залишки. Залишки калової рідини досліджували на сечову кислоту.

Експериментальний коліт з перенесенням Т-клітин

Селезінки WT виділяли і розтирали в RPMI, що містить 10% фетальної бичачої сироватки, пеніцилін і стрептоміцин. Для виділення клітин клітини центрифугували при 367 xg. Отриманий осад потім суспендували в 1x буфері для лізису RBC протягом 5 хвилин у темряві при кімнатній температурі. Потім отримані лейкоцити пропускали через колонку Miltenyi CD4+ MACS для виділення CD4+ Т-клітин. Потім Т-клітини фарбували CD4 і CDRB і сортували на FACS Aria Fusion (BD Biosciences). CD4+ CDRBhi клітини збирали та вводили в TCRb-/- або TCRb-/-; Clec12a-/- мишам внутрішньочеревно (IP). Кожна миша отримала 5 х 105 клітин. Тяжкість і розвиток коліту контролювали щотижня шляхом оцінки втрати ваги. У кінцевій точці експерименту MLN і товсту кишку видаляли, а товсту кишку вимірювали від сліпої кишки до прямої кишки для оцінки тяжкості захворювання.

Виділення лейкоцитів з власної пластинки товстої кишки

Мишачу кишку з прикріпленими сліпими кишками збирали та поміщали в 1X PBS у 6-лункові планшети на льоду. Будь-які видимі залишки жиру та сполучної тканини видаляли, а сліпу кишку вирізали з товстої кишки. Товсту кишку розкривали, а слиз і фекалії обережно видаляли з товстої кишки перед тим, як знову поміщати в 6-лунковий планшет. Після того, як усі кишки були розправлені та зіскоблені, кожну кишку нарізали кубиками на кришці чашки Петрі за допомогою леза бритви та помістили в окрему пробірку на 50 мл. Додавали 10 мл попередньо нагрітого розчину для дисоціації (1X HBSS без Ca+ і Mg+, 1,5 мМ DTT, 10 мМ HEPES і 30 мМ EDTA) і пробірки коротко перемішували. Кишки інкубували приблизно 25 хв. при 37 градусах зі струшуванням при 150 об/хв, доки розчини не стануть каламутними від розділення IEC. Зразки струшували 3 рази та перемішували протягом 15 секунд, потім виливали через 100 мМ фільтр на 50 мл конічний, щоб видалити неімунні клітини, такі як IEC, і фільтри коротко промивали 2 мл охолодженого 1 X PBS. Залишок тканини збирали на фільтрі за допомогою щипців і переміщували в нову конічну ємність на 50 мл. 15 мл попередньо підігрітого розчину для розщеплення (1X HBSS з Ca+ і Mg, 5% FBS, 50 Од/мл Dispase II [Millipore-Sigma, кат. № 4942078001], 0,5 мг/мл ДНКаза I [Worthington Biochemical, кат. № LS002139] і 0,5 мг/мл колагенази D [Millipore-Sigma, кат. № 11088866001]), зразки коротко перемішували, а потім інкубували протягом 45 хв. при 37 градусах зі струшуванням при 150 об/хв, або поки розчин не помутніє. Потім зразки струшували 3 рази та перемішували протягом 15 секунд. Щоб зібрати решту імунних клітин cLP, перетравлену тканину потім виливали через 40 мМ фільтр на 50 мл конічну пробірку, що містить 10 мл 1X PBS. Потім зразки промивають і фільтрують 2 мл охолодженого 1X PBS і обертають при 800 xg протягом 10 хвилин при 4 градусах. Потім супернатант видаляли та відкидали за допомогою вакууму. Потім клітини ресуспендували в 500 мл повного RPMI і підраховували за допомогою ексклюзивного фарбування трипановим синім.

Проточна цитометрія

Лейкоцити, виділені з cLP, фарбували на життєздатність за допомогою зомбі-барвника 510 (AmCyan) протягом 10 хвилин при кімнатній температурі в темряві. Потім зразки блокували Fc-рецептор за допомогою CD-16/32 протягом 20 хвилин при 4 градусах у темряві. Після обертання при 367 x g протягом 5 хвилин декантовані клітини фарбували протягом 30 хвилин у темряві при 4 градусах. Усі антитіла використовували у розведенні 1:250, якщо не зазначено інше. Мілелоїдна панель складалася з CD45-BV421, CD11b-PerCpCy5.5, MHCII-BV605, CD64-BV711, CX3CR1-BV785, Ly6C-FITC, CD38-PE- Cy7, Ly6G-CF-594, Clec12a-PE (1:500), EGR2-APC (внутрішньоклітинний, 1:50). Т-клітини розрізнялися за: Zombie dye 510 (AmCyan), CD45-BV421, CD3e-BV711, CD4-FITC, Foxp3-APC (внутрішньоклітинний 1:50), IL{{ 50}}PE (внутрішньоклітинний 1:50), IFN-g (BV605) (внутрішньоклітинний 1:50), RORgt-PE610 (внутрішньоклітинний 1:50), IL-17A-BV785 (внутрішньоклітинний 1:50). Після фарбування клітини промивали 2 рази по 5 хвилин буфером колонки (1X HBSS без Ca2+, Mg2+ і HEPES, EDTA, FBS). Клітини фіксували O/N 2% PFA, якщо не було потреби у внутрішньоклітинному фарбуванні, а потім промивали колонковим буфером 2X перед тим, як запускати на проточний цитометр. Якщо внутрішньоклітинне фарбування було необхідним, дотримувались набору FoxP3 / Transcription Factor Staining Buffer (Tonbo Biosciences) і протоколу. Потім усі зразки ресуспендували в 300 мкл буфера для колонки та досліджували на BD LSR Fortessa після компенсації за допомогою UltraComp eBeads (ThermoFisher Scientific) і використання контрольних зразків з одним фарбуванням.

Бактерії, що фарбують IgA

Бактерії виділяли з фекалій шляхом розтирання в HBSS з Ca2+ і Mg2+ у концентрації 100 мг фекалій на мл HBSS. Потім розтерті фекалії обертали при 50 х г протягом 5 хвилин, щоб видалити великі залишки. Супернатант видаляли і поміщали в нову пробірку. Потім його обертали при 8000 x g протягом 5 хвилин, щоб осадити бактерії. Супернатант видаляли, а гранули промивали HBSS з Ca2+ і Mg2+. Нарешті, гранули ресуспендували в HBSS у концентрації 100 мг/мл, і 10 мкл цього поміщали в 96-лунковий планшет і блокували HBSS з Ca2+ і Mg2+, що містить 10% FBS протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Потім 100 мкл анти-IgA (PE) додавали безпосередньо до зразка та інкубували протягом 30 хвилин при 4°C у темряві. Потім клітини промивали розчином HBSS+FBS 2x і нарешті ресуспендували в HBSS+1x Sybr®-green і залишали інкубувати протягом 20 хвилин у темряві при кімнатній температурі. Потім зразки безпосередньо зчитували на проточному цитометрі.

Виділення кісткового мозку

Кістковий мозок виділяли, як описано раніше. Коротко кажучи, довгі кістки тварин дикого типу C57Bl/6 або Clec12a-/- були витягнуті та обережно очищені паперовим рушником. Чисті кістки зберігали на льоду, поки тварин обробляли. Кінці кісток були злегка обрізані, щоб відкрити кістковий мозок. Кістку вставляли (відкритим кінцем вниз) у пробірку Eppendorf 0.5 мл, яку прокололи голкою на 18 г. Потім цю пробірку Епендорфа 0.5 мл помістили всередину пробірки Епендорфа об’ємом 1,5 мл і обертали при 13,000 x g протягом 1 хв. Потім кістковий мозок був лізований еритроцитами, використовуючи буфер для лізису еритроцитів (Biolegend) відповідно до рекомендацій виробника. Після лізису еритроцитів клітини ресуспендували в повному середовищі Дульбекко, модифікованому Іглу (DMEM), що містило: 10% FBS, 1 мг/мл Pen/Strep, HEPES 10 мМ, 1 x незамінну амінокислоту, 1 мМ піруват натрію. Потім клітини обертали при 367 xg протягом п'яти хвилин для осадження клітин. Ізольовані клітини потім використовували для розробки BMDM або для подальшої ізоляції моноцитів.

Макрофаги кісткового мозку

Лейкоцити виділяли з ізоляції кісткового мозку, суспендували в повній DMEM і підраховували за допомогою ексклюзивного фарбування трипановим синім на гемоцитометрі. Клітини висівали на 10-сантиметрові чашки, оброблені культурою тканин, у концентрації 5-8 x 106 клітин/планшет у 10 мл повного середовища + M-CSF (20 нг/мл). Свіжі середовища, включаючи M-CSF, додавали до існуючих середовищ на 4-й і 7-й дні. Повністю диференційовані BMDM використовували для експериментального використання між днями 7-9.

Виділення моноцитів

Кістковий мозок збирали у тварин WT і Clec12a-/-, як описано раніше. Моноцити виділяли за допомогою набору Monocyte Isolation Kit (BM), миші (Miltenyi Biotec) і колонки LS MACS відповідно до інструкцій виробника.

Спільне культивування F. rodentium BMDM і RNAseq

Культури F. rodentium кількісно визначали за OD 600 нм (з використанням 1 OD 600 нм=1 x 10^8 клітин/мл), промивали 2 рази в стерильному PBS і спільно культивували з 1 x 106 клітин/мл повністю диференційованих BMDMs при MOI 10 у 6-лункових планшетах для культури тканин. Після 24 годин спільного культивування середовища збирали та зберігали при -20 C до подальшого використання. BMDM промивали холодним стерильним PBS 2 рази. Qiazol (Qiagen cat# 79306) РНК-стабілізуючий реагент потім додавали безпосередньо до кожної лунки. Лунки зіскрібали скребком для клітин, зібраних у 1,5-пробірки Епендорфа та заморожували при -20° до екстракції РНК. Екстракцію РНК проводили за допомогою мініпреп-набору Direct-zol RNA (Zymo Research cat# R2070) відповідно до інструкцій виробника, а бібліотеки секвенування були підготовлені основним центром високопродуктивної геноміки Інституту раку Хантсмана. Тотальну РНК спочатку гібридизували з набором NEBNext rRNA Depletion kit v2 (NEB, кат. № E7400), щоб зменшити кількість рРНК у зразках. Бібліотеки секвенування ланцюгової РНК були підготовлені за допомогою набору для підготовки бібліотеки направленої РНК NEBNext Ultra II для Illumina (NEB, кат. № E7760L). Очищені бібліотеки були кваліфіковані на Agilent Technologies 4150 TapeStation за допомогою аналізу D1000 ScreenTape (Agilent, кат. № 5067-5582 і 5067-5583). Молярність модифікованих адаптером молекул визначали за допомогою кількісної ПЛР з використанням набору Kapa Biosystems Kapa Library Quant Kit (Roche, кат. № 07960140001). Окремі бібліотеки нормалізували до 5 нМ під час підготовки до аналізу послідовності Illumina та секвенували на NovaSeq 6000 за допомогою 150- циклу секвенування в парних кінцях.

Аналіз цитокінів

BMDM виділяли та вирощували, як описано раніше. Повністю диференційовані BMDM посівали по 1 x 105 клітин/лунку в 12-лункові планшети для культури тканин. BMDM стимулювали 100 нг/мл LPS; 1 мкг/мл Pam3Cysk; або 1 мкг/мл флагеліну. Клітини стимулювали протягом 24 годин, середовища збирали та зберігали при -20 C для аналізу. Цитокіни аналізували за допомогою LEGENDplex™ Mouse Inflammation Panel (13-plex) (Biolegend, кат. № 740150). Дані аналізували за допомогою програмного забезпечення для аналізу даних LEGENDplex™.

Секвенування гена 16s рРНК

Фекальні гранули або вміст клубової кишки збирали в окремих мишей і негайно заморожували при {{0}} градусах у пробірках з гвинтовими кришками об’ємом 2 мл, що містили 250 мг гранатових кульок розміром 0,15 мм (MoBio, кат. № {{5). }}). ДНК було виділено за допомогою Power Fecal DNA Isolation Kit (MoBio або QIAGEN), відповідно до інструкцій до набору, і включало 2 цикли по 1 хвилині збивання кульок при 4 градусах на Mini-Bead-Beater 16 (BioSpec Products). Області V3 і V4 гена 16S рРНК ампліфікували за допомогою одного раунду ПЛР з використанням праймерів, які містили (описані від 3' до 5') націлену послідовність гена 16S рРНК області V3/4, а потім 2-нуклеотидну площадку за допомогою послідовностей праймерів Illumina, послідовності нуклеотидного індексу 8- та решти послідовності адаптера Illumina. V3/4 16S-націлені послідовності були взяті з Такахаші (Takahashi та ін., 2014), а індекси були взяті з Козіча (Kozich та ін., 2013). Використані повні олігонуклеотидні послідовності (індекси позначено Xs): Prok16SV34_Для: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCTACACGACGCTC TTCCGATCTTGCCTACGGGNBGCASCAG; Prok16SV34_Ред: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATCTGCGACTACNVGGGTATCTAATCC. Умови циклу ПЛР були такими: початкова денатурація 98 градусів протягом 2 хвилин; 26 циклів по 20 секунд денатурації 98 градусів, 20 секунд відпалу 51,5 градусів, 20 секунд розширення 72 градусів; і одне остаточне розгинання на 72 градуси протягом 2 хвилин. Кожну ПЛР (виконувану в трьох повторах для кожного зразка) проводили в об’ємі 25 мкл з використанням Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (NEB, кат. № M0492L), 5 пмоль кожного праймера та 50 нг матричної ДНК. Після ампліфікації потрійні ПЛР з кожного зразка об’єднували, 5 мкл пропускали на агарозний гель для підтвердження ампліфікації, а об’єм, що залишився, очищали за допомогою очищувальних кульок Axygen AxyPrep MAG PCR (Corning, кат. № MAG-PCR-CL{{53). }}), розведений до 62,5% у воді для ефективного видалення будь-якого димеру праймера, який буде переважно секвенований. Розведені кульки додавали до 1,8-кратного об’єму реакцій ПЛР, очищали відповідно до вказівок виробника, а очищені амплікони елюювали 25 мкл 10 мМ трис-Cl, pH 8,0. Амплікони потім кількісно визначали за допомогою аналізу піко-зеленої dsDNA (ThermoFisher, кат. № P11495) на пристрої для зчитування мікропланшетів, а потім очищені та проіндексовані окремі бібліотеки секвенування рівномірно мультиплексували (за ng ДНК) і секвенували на приладі Illumina MiSeq у парному кінці. 300-цикловий режим у центрі спільних ресурсів High-Throughput Genomics Інституту раку Хантсмана.

Біоінформаційна обробка даних послідовності

Необроблені зчитування гена 16S рРНК були демультиплексовані, дозволяючи 0 невідповідності в індексах, потім оброблені та проаналізовані в рамках QIIME2 (Bolyen та ін., 2019), як ми описали раніше (Stephens та ін., 2021). Коротше кажучи, демультиплексовані та якісно відфільтровані послідовності спочатку були обрізані з послідовностей праймера та лінкера за допомогою плагіна Cutadapt, а потім усунені за допомогою DADA2 (Callahan та ін., 2016; Martin, 2011). Потім таксономії були призначені ASV за допомогою методу classifysklearn у плагіні класифікатора функцій, порівняно з еталонним набором GTDB (release89), урізаним до ампліфікованої області V3/4 і навченим методом fit-classifier-naive-bayes (Bokulich et al. , 2018; Parks та ін., 2018; Pedregosa та ін., 2011). Показники різноманітності, відстані та статистична значущість угруповань бета-різноманіття за permanova були розраховані в QIIME2 (Anderson, 2001).

Для RNA-seq BMDM необроблені зчитування були першої якості та обрізані за допомогою адаптера за допомогою trim galore, потім кількість транскриптів була кількісно визначена за допомогою Salmon проти транскриптома зі збірки GRCm38 (mm10) (Patro et al., 2{{ 16}}17). Кількісні показники рівня транскриптів зчитувалися в R за допомогою пакету часу та підсумовувалися до підрахунків рівня генів перед диференціальним аналізом експресії за допомогою DESeq2 із застосуванням формули «~ Генотип + Лікування + Генотип: Лікування» (Love et al., 2014; Love et al., 2020). Диференціальні реакції на F. rodentium представляли різницю між реакцією кожного генотипу на обробку живими F. rodentium порівняно з клітинами, обробленими контролем-носієм. Значно диференційовано експресовані гени були визначені як гени зі скоригованим p-значенням < 0,05 і log2-кратною зміною > |0,58| (1,5-кратна зміна). Потім були використані списки генів зі значним зниженням і підвищенням регуляції для перевірки збагачення термінів генної онтології (GO) за допомогою пакета clusterProfiler, включаючи функцію спрощення для зменшення надмірності термінів GO та ідентифікації ключових біологічних процесів (S, 2020; Wu et al. ., 2021).

F. rodentium DSS виклик

F. rodentium вирощували, як описано раніше, і кількісно визначали до 1 x 109 КУО/мл у стерильному PBS. F. rodentium фіксували, спочатку промиваючи 2 рази в стерильному PBS, а потім ресуспендуючи в 1 мл 10% Fomalin-PBS протягом 10 хвилин. Потім клітини промивали ще двічі в 10 мл стерильного PBS для підготовки до перорального введення через зонд. Нефіксовані клітини промивали, як і фіксовані клітини, і зберігали на льоду до зондування. Мишам WT C57BL/6 SPF перорально вимірювали 100 мкл розчину, що містив лише PBS (носій), F. rodentium (живий) або F. rodentium (фіксований) з -3 до 10 днів. Тваринам давали 3,0% DSS у дні 0-7; свіжу DSS воду замінювали через день. Обмеження тяжкості більше ніж 20% втрати ваги були встановлені як поріг тяжкості. У кінцевих точках експерименту MLN і товсту кишку видаляли. Для визначення довжини товсту кишку вимірювали від сліпої кишки до прямої кишки. Потім тканини обробляли для гістології, екстракції РНК або проточної цитометрії.

Тест на фагоцитоз

Перитонеальні макрофаги виділяли введенням 5 мл стерильного PBS в черевну порожнину. PBS обережно перемішували в порожнині кожні кілька секунд. Через 2 хвилини PBS відбирали за допомогою голки 28 калібру та розподіляли в холодну DMEM. Клітини центрифугували при 367 xg і промивали повним середовищем. Потім клітини підраховували за допомогою гемоцитометра та висівали в 12-лункові планшети для культури тканин у концентрації 2,5 × 105 клітин/мл. Клітини залишали прилипати протягом ночі. Наступного дня лунки обережно перемішували шляхом закручування та аспірували середовище. Потім прикріплені клітини двічі промивали 500 мкл холодного стерильного PBS. Попередньо нагрітий повний DMEM, що містить F. rodentium з MOI 10, потім додавали до адгезиву (макрофагів). Потім планшети обережно обертали при 200 xg при кімнатній температурі протягом трьох хвилин, а потім інкубували в стандартних умовах культури клітин (37°C, 5% CO2) протягом 90 хвилин. F. rodentium готували, як описано для спільного культивування BMDM лише для секвенування РНК, після промивання клітини ресуспендували в 1x Sybr® green (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3) при кімнатній температурі протягом 20 хвилин. Потім бактеріальні клітини осаджували при 4000 об/хв протягом 5 хв, ресуспендували з повним DMEM і попередньо нагрівали для перитонеальних макрофагів. Після 90 хв спільного культивування середовище відсмоктували, а клітини двічі промивали холодним стерильним PBS. Прилиплі клітини, що містять F. rodentium, пофарбовані в зелений колір Sybr®, фіксували 2% параформальдегідом (PFA) протягом 10 хвилин. PFA аспірували і на клітини поміщали стерильний PBS. Потім клітини візуалізували для фагоцитозу F. rodentium

Аналіз зображення макрофагів

Світлопольні та флуоресцентні зображення культур макрофагів, оброблених F. rodentium, були отримані за допомогою системи обробки зображень EVOS m7000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Для кожної культури було зроблено від трьох до п’яти окремих рандомізованих зображень, які були виконані в трьох примірниках.

Images were blinded and quantified using the software Fiji (Schindelin et al., 2012). Individual bacteria and macrophages were easily distinguished based on size. The total number of bacteria that were associated with (touching or overlapping with) single macrophages was quantified for a randomized subset of cells within the image. Equal numbers of cells were quantified between genotypes (n>200).

Конструкція злитого білка CLEC12A-Fc and purificatiна

кДНК, що кодують позаклітинні домени мишачого Clec12a, ампліфікували за допомогою ПЛР з лейкоцитів, виділених із кісткового мозку C57Bl/6 WT SPF, і підтвердили секвенуванням. кДНК зливали з C-кінцем людського IgG1-Fc у векторі експресії pFuse-hIgG1- Fc2 (InvivoGen). Конструкції, що містять Clec12a або порожній вектор, трансфікували в клітини Lx293, культивовані з DMEM +10% FBS і Pen/strep (1 мг/мл). Секретовані злиті білки збирали з середовища 24-48 після трансфекції. Середовище обертали при 367 x g протягом 5 хвилин для видалення залишків/мертвих клітин, а супернатант заморожували при -20 C до використання. Злиті білки Clec12a-Fc або тільки Fc виділяли за допомогою набору Pierce™ Classic Magnetic IP/Co-IP Kit (Thermo Fisher Scientific, номер за каталогом: 88804), кількісно визначали за допомогою набору Pierce™ BCA Protein Assay Kit (номер за каталогом Thermo Fisher Scientific: 23227) і підтверджено Вестерн-блоттингом з використанням антитіла antiClec12a (Novus Biologicals NBP2-27346SS).

Аналіз зв'язування Clec12a-Fc

Очищені конструкції розбавляли до 0,4 мг/мл у HBSS з вмістом Ca2+ і Mg2+. Бактерії вирощували у відповідних середовищах та аеробних умовах і нормалізували за OD 600 нм. Бактерії промивали HBSS з Ca2+ і Mg2+ і блокували HBSS з Ca2+ і Mg2+ +10% FBS протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Всі процедури фарбування проходили в атмосферних умовах. 1 x 107 клітин бактерій поміщали в круглодонний 96-лунковий планшет, обертали при 3,000 xg і декантували. 50 мкл конструктів поміщали на бактеріальні клітини, обережно перемішували та інкубували при 4°С протягом 1 години. Клітини бактерій промивали HBSS w/Ca2+ і Mg2+ + 10% FBS, 2x. 50 мкл козячого анти-людського Fc (PE) (каталог ebioscience № 12-4998-82) додавали до клітин та інкубували при 4°C протягом 1 години в темряві. Потім клітини промивали, як і раніше, і поміщали в HBSS з Ca2+ і Mg2+, що містить 1x Sybr® зелений (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3). Клітини інкубували при кімнатній температурі протягом 20 хвилин у темряві та одразу зчитували на проточному цитометрі BD LSR Fortessa.

Опромінення та відновлення кісткового мозку

Кістковий мозок збирали у тварин WT і Clec12a-/-, як описано раніше. Отриманих мишей-реципієнтів смертельно опромінили 500 Рад в день -1, а потім 400 Рад в день 0. Через чотири години після останнього опромінення мишей-реципієнтів помістили під анестезію ізофлураном і 100 мкл ізольованого Клітини кісткового мозку, суспендовані в стерильному PBS (1 x 108 клітин/мл), доставляли за допомогою голки калібру 28,5 у ретроорбітальний простір. Нас цікавила мікробіота, тому тваринам не давали антибіотики, а через 8 тижнів збирали фекальні гранули для перенесення мікробіоти тваринам GF.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

Андерсон, MJ (2001). Новий метод непараметричного багатофакторного дисперсійного аналізу. Austral Ecol. 26, 32-46. DOI 10.1111/j.1442-9993.2001.01070.pp.x.

Бігун, Дж., Лассен, К.Г., Джіджон, Х.Б., Бакст, Л.А., Гоел, Г., Хіт, Р.Ж., Нг, А., Там, Дж.М., Куо, С.Й., Віллабланка, Е.Д., та ін. (2015). Інтегрована геноміка варіанту ризику хвороби Крона

визначає роль CLEC12A в антибактеріальній аутофагії. Cell Rep. 11, 1905-1918. 10.1016/j.celrep.2015.05.045.

Бландер, Дж. М., Лонгман, Р. С., Ілієв, І. Д., Зонненберг, Г. Ф., та Артіс, Д. (2017). Регуляція запалення шляхом взаємодії мікробіоти з господарем. Нац. Immunol. 18, 851-860. 10.1038/ni.3780.

Бокуліч, Н.А., Кейлер, Б.Д., Райдаут, Дж.Р., Діллон, М., Болієн, Е., Найт, Р., Хаттлі, Г.А., і Капорасо, Дж.Г. (2018). Оптимізація таксономічної класифікації послідовностей ампліконів маркерного гена за допомогою плагіна QIIME 2 ''sq2-feature-classifier. Мікробіом 6. ARTN 90 10.1186/s40168-018-0470-z.

Боліен, Е., Райдаут, Дж. Р., Діллон, М. Р., Бокуліч, Н., Абнет, Ч. І., Аль-Галіт, GA, Олександр, Х., Алм, Е. Дж., Арумугам, М., Аснікар, Ф. та ін. (2019). Відтворювана, інтерактивна, масштабована та розширювана мікробіомна наука з використанням QIIME 2. Нац. Біотехнологія. 37, 852-857. 10,1038/с41587-019-0209-9.

Браун, Г.Д., Віллмент, Д.А., і Вайтхед, Л. (2018). Лектини С-типу в імунітеті та гомеостазі. Нац. Rev. Immunol. 18, 374-389. 10,1038/с41577-018-0004-8.

Browne, HP, Forster, SC, Anonye, ​​BO, Kumar, N., Neville, BA, Stares, MD, Goulding, D., and Lawley, TD (2016). Культивування «некультивованої» мікробіоти людини відкриває нові таксони та широке спороношення. Природа 533, 543-+. 10.1038/nature17645.

Кедвелл, К., Лю, Дж. Й., Браун, С. Л., Мійоші, Х., Лох, Дж., Леннерц, Дж. К., Кіші, К., К. С., В., Карреро, Д. А., Хант, С. та ін. (2008). Ключова роль аутофагії та гена аутофагії Atg16l1 у кишкових клітинах Панета миші та людини. Nature 456, 259-263. 10.1038/nature07416.

Каллахан, Б.Дж., Макмерді, П.Дж., Розен, М.Дж., Хан, А.В., Джонсон, А.Я., і Холмс, С.П. (2016). DADA2: вибірка з високою роздільною здатністю на основі даних ампліконів Illumina. Нац. Методи 13, 581-+. 10.1038/Nmeth.3869.

Cao, YG, Bae, S., Villarreal, J., Moy, M., Chun, E., Michaud, M., Lang, JK, Glickman, JN, Lobel, L., and Garrett, WS (2022). Faecalibaculum rodentium реконструює передачу сигналів ретиноєвої кислоти, щоб регулювати залежний від еозинофілів епітеліальний гомеостаз кишечника. Клітина-господар і мікроб 30, 1295- 1310 e1298. 10.1016/j.chom.2022.07.015.

Чанг, Д.Х., Рі, М.С., Ан, С., Бенг, Б.Х., О, JE, Лі, Х.К., та Кім, Б.К. (2015). Faecalibaculum rodentium gen. нов., зр. nov., виділений з фекалій лабораторної миші. Антоні Ван Левенгук 108, 1309-1318. 10,1007/с10482-015-0583-3.

Чіаро Т.Р., Сото Р., Стівенс В.З., Кубінак Дж.Л., Петерсен К., Гогохія Л., Белл Р., Дельгадо Дж.К., Кокс Дж., Вот В. та ін. (2017). Член мікобіоти кишечника модулює метаболізм пуринів господаря, загострюючи коліт у мишей. Sci. переклад Мед. 9, .

Drouin, M., Saenz, J., and Chiffoleau, E. (2020). Лектиноподібні рецептори С-типу: голова або хвіст імунітету до клітинної смерті. Фронт. Immunol. 11. ARTN 251 10.3389/fimmu.2020.00251.

Фассарелла, М., Блак, Е.Е., Пендерс, Дж., Наута, А., Смідт, Х., і Зетендаль, Е.Г. (2021). Стабільність і стійкість кишкового мікробіому: з’ясування реакції на збурення для модулювання здоров’я кишечника. Кишка 70, 595-605. 10.1136/gutjnl-2020-321747.

Gkouskou, KK, Deligianni, C., Tsatsanis, C., and Eliopoulos, AG (2014). Мікробіота кишечника в мишачих моделях запального захворювання кишечника. Кордони в клітинній та інфекційній мікробіології 4. ARTN 28 10.3389/fcimb.2014.00028.

Хан, Ю.М., Чжан, М.Х., Лі, Н., Чен, ТЮ, Чжан, Ю., Ван, Т., і Цао, XT (2004). KLRL1, новий лектиноподібний рецептор клітин-кілерів, пригнічує цитотоксичність природних клітин-кілерів. Кров 104, 2858-2866. DOI 10.1182/кров-2004-03-0878.

Ілієв І. Д., Фунарі В. А., Тейлор К. Д., Нгуєн К., Рейес К. Н., Стром С. П., Браун Дж., Беккер К. А., Флешнер П. Р., Дубінскі М. та ін. (2012). Взаємодія між комменсальними грибами та лектиновим рецептором С-типу дектином-1 впливає на коліт. Наука 336, 1314-1317. 10.1126/наук.1221789.

Джейсон Л. Кубінак, WZS, Рей Сото, Чарісс Петерсен, Тайсон Чіаро, Лаша Гогохія, Ріккеша Бел1, Надім Дж. Аджамі, Джозеф Ф. Петросіно, Лінда Моррісон4, Вейн К. Поттс, Пітер Е. Дженсен, Райан М. О' Коннелл і Джун Л. Раунд (2015). Варіація MHC формує індивідуальні мікробні спільноти, які контролюють сприйнятливість до кишкової інфекції. Спілкування природи. 0,1038/ncomms9642.

Kono, H., Chen, CJ, Ontiveros, F., and Rock, KL (2010). Сечова кислота сприяє гострій запальній реакції на загибель стерильних клітин у мишей. Дж. Клін. Інвестувати. 120, 1939-1949. 10.1172/Jci40124.

Козіч, Дж.Дж., Весткотт, С.Л., Бакстер, Н.Т., Хайлендер, С.К., і Шлосс, П.Д. (2013). Розробка стратегії секвенування з подвійним індексом і каналу контролю для аналізу даних послідовності ампліконів на платформі секвенування MiSeq Illumina. Прикладна та екологічна мікробіологія 79, 5112-5120. 10.1128/Aem.01043-13.

Кубінак, Дж. Л., Петерсен, К., Стівенс, В. З., Сото, Р., Бейк, Е., О'Коннелл, Р. М., і Раунд, Дж. Л. (2015). Передача сигналів MyD88 у Т-клітинах спрямовує IgA-опосередкований контроль мікробіоти для зміцнення здоров’я. Клітинний мікроб-господар 17, 153-163. 10.1016/j.chom.2014.12.009.

Лі, К., Нойман, К., Духан, В., Намінені, С., Хансен, А.Л., Вартевіг, Т., Кургіс, З., Холм, К.К., Хейкенвальдер, М., Ланг, К.С., і Руланд, Дж. (2019). Рецептор кристалів сечової кислоти Clec12A посилює реакцію інтерферону I типу. Proc Natl Acad Sci USA 116, 18544-18549. 10.1073/pnas.1821351116.

Лю, Дж. З., ван Соммерен, С., Хуан, Х., Нг, С. К., Альбертс, Р., Такахаші, А., Ріпке, С., Лі, Дж. К., Джостінс, Л., Шах, Т. та ін. . (2015). Аналіз асоціації визначає 38 локусів сприйнятливості до запальних захворювань кишечника та підкреслює спільний генетичний ризик для різних популяцій. Нац. Жене. 47, 979-986. 10.1038/ng.3359.

Лав М.І., Хубер В. та Андерс С. (2014). Модерована оцінка зміни кратності та дисперсії для даних RNA-seq за допомогою DESeq2. Genome Biol. 15. ARTN 550 10.1186/с13059-014-0550-8.

Лав М.І., Сонесон К., Хікі П.Ф., Джонсон Л.К., Пірс Н.Т., Шеперд Л., Морган М. та Патро Р. (2020). Tximeta: Контрольні суми еталонної послідовності для ідентифікації походження в РНК-послідовності. Plos Computational Biology 16. ARTN e1007664 10.1371/journal.pcbi.1007664.

Луо, Ю., Такер, С.К., і Касадевал, А. (2005). Активація Fc-рецепторів і рецепторів комплементу стимулює прогресування клітинного циклу клітин макрофагів від G1 до SJ Immunol. 174, 7226- 7233. 10.4049/jimmunol.174.11.7226.

Макферсон, А. Дж., Гатто, Д., Сейнсбері, Е., Гарріман, Г. Р., Генгартнер, Х., і Зінкернагель, Р. М. (2000). Примітивний Т-клітинно-незалежний механізм IgA-відповідей слизової оболонки кишечника на комменсальні бактерії. Наука 288, 2222-+. DOI 10.1126/science.288.5474.2222.

Maglinao, M., Eriksson, M., Schlegel, MK, Zimmermann, S., Johannssen, T., Gotze, S., Seeberger, PH, and Lepenies, B. (2014). Платформа для скринінгу вуглеводів, що зв’язують рецептори лектину С-типу, і їхнього потенціалу для клітинно-специфічного націлювання та імунної модуляції. Журнал контрольованого випуску 175, 36-42. 10.1016/j.jconrel.2013.12.011.

Маршалл, ASJ, Willment, JA, Лін, HH, Вільямс, DL, Гордон, S., і Браун, GD (2004). Ідентифікація та характеристика нового мієлоїдного інгібуючого лектиноподібного рецептора c-типу людини (MICL), який переважно експресується на гранулоцитах і моноцитах. J. Biol. Chem. 279, 14792-14802. 10.1074/jbc.M313127200.

Мартін, М. (2011). Cutadapt видаляє послідовності адаптера з високопродуктивних зчитувань секвенування. EMBNet.journal 17. Мартінес-Лопес, М., Іборра, С., Конде-Гарроса, Р., Мастранжело, А., Данн, К., Манн, ЕР, Рейд, Д.М., Габоріо-Рутіо, В., Чапарро , М., Лоренцо, М. П. та ін. (2019). Розпізнавання мікробіоти за допомогою осі Мінкл-Сіка в дендритних клітинах регулює вироблення інтерлейкіну-17 та -22 та сприяє цілісності кишкового бар’єру. Імунітет 50, 446-461 e449. 10.1016/j.immuni.2018.12.020.

Мартінон, Ф., Петріллі, В., Мер, А., Тардівель, А., Чопп, Дж. (2006). Кристали сечової кислоти, пов’язані з подагрою, активують інфламмасому NALP3. Nature 440, 237-241. 10.1038/nature04516.

Накадзіма, А., Фогельзанг, А., Маруя, М., Міядзіма, М., Мурата, М., Сон, А., Кувахара, Т., Цуруяма, Т., Ямада, С., Мацуура, М., та ін. (2018). IgA регулює склад і метаболічну функцію кишкової мікробіоти, сприяючи симбіозу між бактеріями. J. Exp. Мед. 215, 2019-2034. 10.1084/jem.20180427.

Нойман, К., Кастінейрас-Віларіно, М., Хокендорф, У., Ганнесшлагер, Н., Лемер, С., Купка, Д., Меєрман, С., Лех, М., Андерс, Х.Дж., Кустер, Б. , та ін. (2014). Clec12a є інгібуючим рецептором для кристалів сечової кислоти, який регулює запалення у відповідь на загибель клітин. Імунітет 40, 389-399. 10.1016/j.immuni.2013.12.015.

Окай С., Усуї Ф., Йокота С., Хорі І.Й., Хасегава М., Накамура Т., Куросава М., Окада С., Ямамото К., Нісіяма Е. та ін. al. (2016). Високоафінний моноклональний IgA регулює мікробіоту кишечника та запобігає коліту у мишей. Nat Microbiol 1, 16103. 10.1038/nmicrobiol.2016.103.

Пабст, О. та Слек, Е. (2020). IgA та кишкова мікробіота: важливість специфічності. Мукозальний імунол. 13, 12-21. 10,1038/с41385-019-0227-4.

Паркс, Д.Х., Чувочина, М., Уейт, Д.В., Рінке, К., Скаршевскі, А., Шомей, П.А., і Гугенгольц, П. (2018). Стандартизована таксономія бактерій, заснована на філогенії геному, суттєво переглядає дерево життя. Нац. Біотехнологія. 36, 996-+. 10.1038/nbt.4229.

Патро, Р., Даггал, Г., Лав, М.І., Ірізаррі, Р.А., і Кінгсфорд, К. (2017). Salmon забезпечує швидку кількісну оцінку експресії транскрипту з урахуванням упереджень. Нац. Методи 14, 417-+. 10.1038/nmeth.4197.

Педрегоза, Ф., Варокво, Г., Грамфор, А., Мішель, В., Тіріон, Б., Грізель, О., Блондель, М., Преттенхофер, П., Вайс, Р., Дюбург, В., та ін. (2011). Scikit-learn: машинне навчання на Python. J Mach Learn Res 12, 2825-2830.

Pyz, E., Huysamen, C., Marshall, AS, Gordon, S., Taylor, PR, and Brown, GD (2008). Характеристика мишачого MICL (CLEC12A) і докази наявності ендогенного ліганду. Євро. J. Immunol. 38, 1157-1163. 10.1002/eji.200738057.

Раульф, М.К., Йоганнссен, Т., Маттізен, С., Нойман, К., Хаченберг, С., Майєр-Ламбертц, С., Штайнбайс, Ф., Хегерманн, Дж., Зебергер, П.Х., Баумгартнер, В., та ін. (2019). Рецептор лектину C-типу CLEC12A розпізнає плазмодіальний гемозоїн і сприяє розвитку церебральної малярії. Cell Rep. 28, 30-38 e35. 10.1016/j.celrep.2019.06.015.

Рей, А., і Діттел, Б.Н. (2015). Взаємозв'язок між дисбактеріозом мікробіоти кишечника внаслідок імунодефіциту та пенетрацією коліту. Імунологія 146, 359-368. 10.1111/імм.12511.

Ределінгюйс П., Вайтхед Л., Аугелло А., Драммонд Р.А., Левеск Дж.М., Вотьє С., Рейд Д.М., Кершер Б., Тейлор Д.А., Нігрович П.А. та ін. (2016). MICL контролює запалення при ревматоїдному артриті. Енн Rheum. дис. 75, 1386-1391. 10.1136/annrheumdis-2014-206644.