Цистанозид Cistanche Herba зменшує репродуктивні пошкодження чоловіків, спричинені гіпоксією, шляхом пригнічення окисного стресу-Ⅰ

вступ

Наразі приблизно 48,5 мільйонів (15%) пар репродуктивного віку в усьому світі страждають від безпліддя, серед яких 40-50% випадків пояснюється чоловічим безпліддям, станом, який тісно пов’язаний з факторами навколишнього середовища та способу життя. Докази свідчать про те, що сприйнятливість яєчок ссавців до низького тиску кисню є причинним фактором деяких форм чоловічого безпліддя. Як було продемонстровано в попередніх дослідженнях, сперматогенез порушується і знижується під впливом гіпобаричної гіпоксії.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПОКРАЩЕННЯ СТАТЕВОЇ ФУНКЦІЇ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Щоб дослідити основний механізм, дослідження показали, що вплив гіпобаричної гіпоксії збільшує виробництво активних форм кисню (АФК). АФК відіграє важливу роль у чоловічій репродуктивній системі. На низьких рівнях вони необхідні для ємності сперми, акросомної реакції та злиття сперматозоїдів і ооцитів [10]. Однак надмірна кількість АФК може спричинити пошкодження ядерної/мітохондріальної ДНК сперматозоїдів і пероксидаційне пошкодження плазматичної мембрани, які, у свою чергу, є основними етіологічними факторами дляпідвищений ризик чоловічого безпліддя. Таким чином, накопичення індукованих гіпоксією АФК може бути однією з причин чоловічого безпліддя.

Cistanches Herba, багаторічна паразитична лікарська рослина, широко поширена в посушливих районах і широко використовується завдяки своїй фармакологічній активності. Серед усіх ефективних змістівCistanches Herba, ФГ розглядалися як основний діючий компонент. На сьогоднішній день виділено 34 PhG зРослини цистанхея. Цистанозид(Cis), активний PhG, виділений зCistanches Herba, привернув увагу завдяки своїм антиоксидантним ефектам.

Враховуючи антиоксидантну дію Цис і роль АФК у чоловічому безплідді, спричиненому гіпоксією, Цис вважається потенційним препаратом-кандидатом для лікуваннячоловіче безпліддя, спричинене гіпоксією. Тим не менш, небагато повідомлень стосуються антиоксидантної дії цис, витягнутої з Cistanches Herba, при лікуванні чоловічого безпліддя, спричиненого гіпоксією, або залучених сигнальних шляхів. У цьому дослідженні були побудовані експериментальні моделі гіпоксії in vitro та in vivo та оцінені компоненти впливу різних цис.

Матеріали та методи

Культура клітин і реактив

Лінія клітин сперматогоній миші GC-1spg (GC-1) була придбана в Американській колекції типових культур (ATCC) і культивована в DMEM (Invitrogen, США) з додаванням 10% фетальної бичачої сироватки, 1% L-глутамін (100 мМ), пеніцилін (100 ОД/мл) і стрептоміцин (100 мкг/мл) при 37 градусах у зволоженому інкубаторі з 5% CO2. Cis (Cis-A, B, C, H) було придбано у Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (Китай).

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПОКРАЩЕННЯ СТАТЕВОЇ ФУНКЦІЇ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Дослідження життєздатності клітин

Життєздатність клітин перевіряли за допомогою набору для підрахунку клітин{{0}} (CCK-8). Коротше кажучи, клітини GC-1 висівали в 96-лункові планшети по 1,5×103 на лунку та культивували при 37 градусах протягом 24 годин. Потім клітини обробляли різними концентраціями (20%, 15%, 10%, 5%) кисню або різними концентраціями (2 мкМ, 0,2 мкМ, 0,02 мкМ) цис (цис-А, цис-В, цис- C, Cis-H) протягом необхідного часу. Потім супернатант видаляли, а життєздатність клітин визначали за допомогою набору CCK-8 (Dojindo Japan). Оптичну густину кожної лунки вимірювали при 450 нм за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів (BioRad USA). Нарешті, життєздатність клітин розраховували за такою формулою: Життєздатність клітин=(ODекспериментальна група - ODпорожня група)/ (ODконтрольна група - ODпорожня група) × 100%.

Вестерн-блот аналіз

Зібрані клітини або тканини гомогенізували в буфері RIPA для екстракції білків (RIPA Beyotime China; Cocktail Roche Швейцарія). Супернатанти збирали, і концентрацію білків перевіряли методом BCA (Beyotime). Приблизно 40 мкг екстрагованих білків з кожного зразка відокремлювали за допомогою SDS-PAGE і електропереносили на нітроцелюлозну (NC) фільтрувальну мембрану (Beyotime China). Мембрани фільтра NC блокували 5% знежиреним молоком протягом 1,5 години та інкубували зі специфічними антитілами (анти-PARP 1:1000, анти-Caspase-3 1:1000, анти-Bcl-2 1:1000, анти-Bax 1 :1000, анти-GAPDH 1:1000; усі антитіла були придбані у Cell Signaling Technology, США) протягом ночі при 4 градусах. Потім усі NC-мембрани інкубували з відповідним вторинним антитілом, кон’югованим з пероксидазою хрону, протягом 1,5 годин при кімнатній температурі та знімали зображення за допомогою системи візуалізації (Tannon, Китай).

Виявлення клітинного циклу

Для аналізу клітинного циклу було проведено проточний цитометричний аналіз (FCM). Клітини обробляли в різних умовах протягом 72 годин і збирали. Потім клітини промивали PBS, фіксували в 75% етанолі та фарбували йодидом пропідію (PI). Для кожного зразка було зібрано 1×104 клітин і проаналізовано методом проточної цитометрії (FACS Calibur, BD Biosciences). Потім розраховували частку клітин фази G1/S/G2 та індекс проліферації [Фаза(S+G2)/Фаза(G1+S+G2) × 100%].

Фарбування Ki-67

Клітини культивували в конфокальній чашці та обробляли гіпоксією або різними підтипами Cis протягом 72 годин. Після фіксації всіх клітин 4% параформальдегідом їх інкубували з антитілом до Ki-67 (1:200, Cell Signaling Technology). Потім усі клітини інкубували з відповідним CY-3-кон’югованим антитілом IgG кролика (1:200, Boster, Китай) і розчином DAPI (1,0 мкг/мл, Beyotime). Флуоресценцію спостерігали за допомогою конфокального мікроскопа Fluoview FV1000 (Olympus, Японія).

ВИЩИЙ РІВЕНЬ ЕКСТРАКТ CISTANCHE TUBULOSA ДЛЯ ПІДВИЩЕННЯ ТЕСТОСТЕРОНУ PHGS75% ECH 30% ДІЯ 12%

Виявлення АФК

FCM був представлений для вимірювання внутрішньоклітинних рівнів ROS за допомогою DCFH-DA. Суспендовані клітини висівали в 6-лункові планшети та піддавали різним обробкам. Після 72 годин обробки клітини суспендували в безсироватковій DMEM з 10 мкМ DCFH-DA (Beyotime). Потім вміст АФК визначали за допомогою флуоресцентного сортування клітин на системі проточної цитометрії Beckman Coulter з довжиною хвилі збудження 488 нм і довжиною хвилі випромінювання 525 нм [18].

Визначення перекисного окислення ліпідів (ПОЛ)

Для виявлення ПОЛ був проведений аналіз реактивних речовин тіобарбітурової кислоти (TBARS). Усі робочі етапи виконувалися відповідно до інструкцій (Sigma USA). Концентрації були розраховані з використанням молярного коефіцієнта екстинкції 1,56×105/(М · см), який був отриманий з використанням малонового діальдегіду як стандарту. Результати виражені в нмоль еквівалентів MDA/мг білка.

Визначення активності ферментів

Активність ферментів перевіряли за допомогою наборів для аналізу, включаючи глутатіонредуктазу (GR), глутатіонпероксидазу (GPx) і супероксиддисмутазу (SOD). Усі операційні етапи виконувалися відповідно до наданих інструкцій (Нан Цзін Цзянь Ченг Інститут біоінженерії Китаю).

Тварини та протокол експерименту

Статевозрілих самців щурів Wistar (180-220 г, 8 ват) було отримано з тваринницького центру Четвертого військово-медичного університету, Сіань, Китай. Дозвіл на використання тварин було отримано від Комітету з етики університету (довідковий номер: 20190506). Експеримент на тваринах проводився відповідно до університетських інструкцій щодо догляду та використання лабораторних тварин.

Усім щурам дозволили адаптуватися протягом приблизно 1 тижня до початку експерименту. Після акліматизації щурів випадковим чином розподілили на 6 груп по 5 тварин у кожній. Щурів у контрольній групі вирощували при нормальному тиску (PO2: 20%; тиск повітря: 101,3 кПа), тоді як щурів у модельній групі та групах, які отримували цис, вирощували в кисневій камері низького тиску (внутрішній тиск 61,6 кПа). , що еквівалентно висоті 4000 метрів над рівнем моря; PO2: 14,55%) для імітації гіпоксичного середовища на великій висоті. Усі щури мали вільний доступ до їжі та води в пластикових клітках при температурі 22 ± 2 градуси та вологості з автоматичним 12--годинним циклом світла/темряви. Щури в модельній групі та групах, які отримували цис, залишалися в гіпобаричних умовах, але їх переводили в нормобаричні умови кожні 96 годин, у цей час їм давали їжу та воду, а клітини очищали. Тривалість переходу від гіпобарики до гіпобарики становила приблизно 2 години. Усі групи лікування отримували відповідний цис (8 мг/кг/день) через пероральний зонд протягом 8 тижнів, тоді як контрольних і модельних щурів лікували рівним об’ємом води.

Через 8 тижнів щурів умертвляли під наркозом. Сім’яники, придаток яєчка та сім’яні бульбашки відокремлювали та зважували, а індекс органу розраховували за такою формулою: (маса органу/маса тварини) × 100 %. Згодом було зібрано сперматозоїди в придатку яєчка та перевірено їх рухливість і активність акросомного ферменту. Подібним чином, тканини яєчок були зібрані для гістопатологічних досліджень і визначення АФК, ПОЛ і активності антиоксидантного ферменту.

ЕКСТРАКТ ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗНОЇ ТРАВИ ЦИСТАНКЕ ПІДВИЩУЄ СЕКСУАЛЬНУ СИЛУ PHGS75% ECH 30% ДІЄ 12%

Оцінка норми живої сперми

Придаток яєчка розрізали хірургічними ножицями, а суспензію сперми готували у фізіологічному розчині. Щоб оцінити кількість живих сперматозоїдів, 5 мкл суспензії сперми обережно змішали з рівним об’ємом фарби еозином-Y. Потім сперматозоїди підраховували під світловим мікроскопом. Показники живої сперми оцінювали шляхом розрахунку як забарвленої (мертва сперма), так і незабарвленої (жива сперма).

Визначення активності ферментів акросом сперматозоїдів

Аналіз ферментної активності акросоми сперми використовувався для оцінки ферментів акросоми сперми [19]. Результати в кожній групі обчислювали за такою формулою: активність акросомного ферменту (мкМО)=(група експерименту ODB - група холостого зразка ODB)/(247,5×10) × 106.

Результати

Вплив гіпоксії на клітини GC-1

Щоб визначити вплив гіпоксії на статеві клітини, ми спочатку дослідили зміни життєздатності клітин після лікування гіпоксією різними концентраціями кисню (20%, 15%, 10% і 5%) для 1, 3, 5 , та 7 днів відповідно. Результати аналізу CCK-8 показали, що порівняно з контрольною групою (концентрація кисню 20%) клітини, які зазнали дії гіпоксії, показали значне зниження життєздатності (P <0,01; рис. 1A). Крім того, рівень їх виживання був обернено пропорційний концентрації кисню і ще більше знижувався з часом індукції. Щоб уникнути надмірного цитотоксичного ефекту, 10% концентрація кисню та 3-денний час індукції були обрані як критерії гіпоксичної моделі для подальших експериментів in vitro.

Згодом було проведено FCM та імунофлуоресцентне фарбування для подальшої оцінки зміни проліферації клітин GC{{0}} під дією гіпоксії. Результати показали, що гіпоксія може індукувати зупинку клітин GC-1 у фазі G1, тим самим зменшуючи вхід клітини у фазу S та пригнічуючи реплікацію ДНК. Таким чином, гіпоксія значно знижувала індекс проліферації клітин GC-1 (P <0,01; рис. 1B). Позитивне фарбування Ki-67 є ще одним специфічним біомаркером проліферуючих клітин. Таким чином, ми також перевірили співвідношення Ki-67-позитивних клітин з або без лікування гіпоксією. Порівняно з контрольною групою лікування гіпоксією значно зменшило кількість Ki-67-позитивних клітин, як показано на малюнку 1C.

Далі ми мали на меті дослідити спосіб інгібування життєздатності клітин GC{{0}}, викликаного гіпоксією. Як повідомляється в літературі, рівень АФК підвищувався, коли щури були піддані гіпобаричному гіпоксичному середовищу [8, 20]. Отже, рівні ендогенних АФК у клітинах GC-1 вимірювали за допомогою аналізу FCM. Результати показали більш високі рівні ROS в умовах гіпоксії порівняно з групою нормального кисню (P <0,01; рис. 1D). Накопичені АФК викликають помітне порушення ДНК, що, у свою чергу, спричиняє активацію шляху апоптозу клітин і може бути основним етіологічним фактором підвищення ризику чоловічого безпліддя [21, 22]. Далі ми виявили ефект апоптотичної активації гіпоксії на клітини GC-1 за допомогою фарбування TUNEL. Як показано на малюнку 1E, лікування гіпоксією призвело до збільшення флуоресценції TUNEL порівняно з контрольною групою, що вказує на збільшення апоптозу в модельній групі.

Оскільки пошкодження клітин, спричинене АФК, зазвичай спричинене ОС, ми додатково протестували ОС клітин GC-1. Як показано на малюнку 1F, рівні LPO клітин GC-1 у модельній групі були помітно підвищені порівняно з рівнями LPO клітин GC-1 у контрольній групі. Ці висновки свідчать про те, що пошкодження клітин GC-1, спричинене гіпоксією, може бути пов’язане з OS, яка спричинена накопиченням АФК.