Екстракт Cistanche Deserticola прискорює формування кісткової тканини в остеобластах--Частина I
Mar 15, 2022
Контакти:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Те-Мао Ліaet a
Анотація
Цілі Ми досліджували ефектЦистанхеdeserticolaмама (CD) увімкненокісткаформуваннякультивованими остеобластами. Методи Тест на утворення мінералізованих вузликів використовувався для вивчення ефектів CD in vitro(Цистанхеdeserticola)накісткаформування. Експресію мРНК лужної фосфатази (ALP), кісткових морфогенетичних білків (BMP)-2 і остеопонтину (OPN) аналізували за допомогою кількісної полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі. Механізм дії CD(Цистанхеdeserticola)екстракт досліджували за допомогою Вестерн-блот. Антиостеопоротичний ефект in vivo CD(Цистанхеdeserticola)екстракту оцінювали на мишах з оваріектомією.
Ключові висновки
CD(Цистанхеdeserticola)екстракт не вплинув на проліферацію, міграцію або загоєння ран культивованих остеобластів, але збільшив ALP, BMP-2 і OPN мРНК і мінералізацію кісток. Інгібітори мітоген-активованої протеїнкінази (MAPK) або ядерного фактора (NF)-kB знижують CD(Цистанхеdeserticola)індукований екстрактомформування кістокі вираз ALP, BMP-2 і OPN. Проте CD(Цистанхеdeserticola)екстракт не впливав на остеокластогенез. Крім того, CD(Цистанхеdeserticola)екстракт запобігав втраті кісткової тканини, спричиненій оваріектомією in vivo.
Висновки
CD(Цистанхеdeserticola)може бути романомформування кістокзасіб для лікування остеопорозу.
Ключові словаформування кісток; Цистанхеdeserticola; китайська трава; остеобласти
Cistanche deserticolaдобре дляформування кісток
вступ
Кістка — це складна тканина, що складається з кількох типів клітин, які проходять безперервний процес оновлення та відновлення, що називається «ремоделюванням кістки». Два основних типи клітин, відповідальних за ремоделювання кісток, це остеокласти, які розсмоктують кістку, і остеобласти, які утворюють нову кістку. Ремоделювання кісткової тканини регулюється кількома системними гормонами (наприклад, паратиреоїдним гормоном, 1, 25-дигідроксивітаміном D3, статевими гормонами та кальцитоніном) і місцевими факторами (наприклад, оксидом азоту, простагландинами, факторами росту та цитокінами).[1] Остеопороз виникає, коли резорбція та утворення кісткової тканини не скоординовані, а надлишкове руйнування кістки перевищує побудову кістки.[2] Сучасні методи лікування остеопорозу включають бісфосфонати, кальцитонін і естроген, які є інгібіторами резорбції кісток, які підтримують кісткову масу шляхом пригнічення активності остеокластів.[3] Однак ефект цих препаратів у збільшенні або відновленні кісткової маси відносно невеликий, звичайно не більше 2 відсотків на рік.[3] Таким чином, існує потреба в агентах для побудови кісток, таких як терипаратид, які стимулюють новікісткаформуванняі виправити зміну трабекулярної мікроархітектури, характерну для встановленого остеопорозу [4,5].кісткаформуванняЦе в першу чергу функція остеобластів, агенти, які діють шляхом збільшення проліферації клітин остеобластної лінії або індукування диференціації остеобластів, можуть посилити формування кісток [5,6].
Хоча механізми остеопорозу залишаються неясними, вони, ймовірно, пов’язані зі зниженою доступністю або дією факторів росту кісток, таких як кісткові морфогенетичні білки (BMP).[7] BMP, які структурно пов'язані з надродиною трансформуючого фактора росту B, спочатку були ідентифіковані за їхньою здатністю індукувати позаматковукістка формуванняу гризунів.[8] BMP відіграють важливу роль укісткаформуванняі диференціювання кісткових клітин шляхом стимуляції активності лужної фосфатази (ALP), а також синтезу протеоглікану, колагену та остеопонтину (OPN). [9] Нещодавнє дослідження виявило зв’язок між остеопорозом і специфічними поліморфізмами в генах BMP-2, ALP і OPN, припускаючи, що вони пов’язані з розвитком остеопорозу.[10]
Цистанхеdeserticolaмама (Orobanchaceae; скорочено CD)(Цистанхеdeserticola)є місцевою травою в Китаї та широко використовується в традиційній медицині як терапевтичний засіб завдяки своїм седативним, болезаспокійливим та імуностимулюючим властивостям.[11] Сучасні фармакологічні дослідження показали, що CD(Цистанхеdeserticola)екстракти можуть стимулювати імунітет [12], поглинати вільні радикали [13] і підвищувати активність супероксиддисмутази [14]. Протизапальні та антиоксидантні агенти мають потенціал для лікування остеопорозу шляхом збільшеннякістка формуваннята/або пригнічення резорбції кісткової тканини [15,16] Однак ефект CD(Цистанхеdeserticola)на функцію кісткових клітин ще не визначено. Тут ми повідомляємо про цей компакт-диск(Цистанхеdeserticola)екстракт не впливав на проліферацію, міграцію або активність загоєння ран культивованих остеобластів, але збільшив експресію ALP, BMP-2 і OPN і мінералізацію кісток. Крім того, ми показуємо, що сигнальні шляхи мітоген-активованої протеїнкінази (MAPK) і ядерного фактора (NF)-kB можуть бути залучені до опосередкованого CD збільшення експресії генів і мінералізації кісток. Навпаки, CD(Цистанхеdeserticola)екстракт не пригнічував остеокластогенез in vitro. Зокрема, лікування мишей з CD(Цистанхеdeserticola)екстракт запобігав втраті кісткової маси, спричиненій оваріектомією in vivo. Отже, наші дані свідчать про те, що CD(Цистанхеdeserticola)можна використовувати для стимуляціїкісткаформуваннядля лікування остеопорозу.
Cistanche deserticolaпідвищити імунітет
Матеріали та методи
Екстракт і матеріали Cistanche deserticola
CD(Цистанхеdeserticola)екстракт був придбаний у Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Каосюн, Тайвань). Вилучення та ізоляція CD(Цистанхеdeserticola)стежили, як описано раніше (на основі спектральних даних вони визначили хімічний склад, включаючи бета-ситостерин, даукостерол, янтарну кислоту, триаконтанол, актеозид, бетаїн і полісахарид).[17] Кролячі поліклональні антитіла, специфічні для p-позаклітинних сигнально-регульованих кіназ (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-термінальних кіназ (JNK), JNK, p-p65 і p65, були придбані в Santa Cruz Biotechnology ( Санта-Крус, США). Набір для аналізу остеокальцину ELISA був придбаний у Biosource Technology (Nivelles, Бельгія). С-кінцеві телопептиди з набору ІФА для колагену I типу були отримані від Cross Laps (Herlev, Данія). Домінантно-негативний мутант p38 був наданий доктором Дж. Ханом (Південно-Західний медичний центр, Даллас, США). Домінантно-негативний мутант JNK надав доктор М. Карін (Каліфорнійський університет, Сан-Дієго, США). Домінантно-негативний мутант ERK2 був наданий доктором М. Коббом (Південно-Західний медичний центр). Усі інші реагенти були отримані від Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, США).
Культура клітин
Мишачу лінію клітин остеобластів MC3T3-E1 було придбано в Американській колекції типових культур (ATCC; Роквіль, США). Клітини культивували в 95% повітря, 5% CO2 з a-MEM, який був доповнений 20 мМ HEPES і 10% термоінактивованої фетальної телячої сироватки, 2 мМ глютаміну, пеніциліну (100 ОД/мл) і стрептоміцину (100 мг). /мл).
Вимірювання утворення мінералізованих вузликів
Утворення мінералізованих вузликів оцінювали, як описано.[18] Коротше кажучи, остеобласти культивували в середовищі, що містить вітамін С (50 мг/мл) і b-гліцерофосфат (10 мМ) протягом двох тижнів, і середовище змінювали кожні три дні. Після інкубації з CD(Цистанхеdeserticola)екстракту протягом 12 днів, клітини двічі промивали 20 мм Трис-буферним фізіологічним розчином, що містить 0,15 М NaCl (рН 7,4), фіксували в крижаному 75% (об’єм/об’єм) етанолі протягом 30 хвилин і повітряно- сушені. Відкладення кальцію визначали за допомогою фарбування алізариновим червоним S. Коротко, клітини та матрицю, фіксовані етанолом, фарбували протягом 1 години 40 мМ алізариновим червоним-S (pH 4,2) і рясно промивали водою. Зв’язану пляму елюювали 10 відсотками (маса/об’єм) цетилпіридинію хлориду, а алізариновий червоний-S у зразках кількісно визначали шляхом вимірювання поглинання при 550 нм і порівнювали зі стандартною кривою. Один моль алізаринового червоного-S вибірково зв'язує приблизно два моля кальцію.
Cistanche deserticolaдобре дляформування кісток
Кількісна полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі
Загальну РНК екстрагували з остеобластів за допомогою набору TRIzol (MDBio Inc., Тайбей, Тайвань). Зворотну транскрипцію проводили з використанням 2 мг сумарної РНК і оліго(dT) праймера [19,20]. Кількісну полімеразну ланцюгову реакцію в режимі реального часу (кПЛР) проводили за допомогою TaqMan® одноетапної ПЛР Master Mix (Applied Biosystems, Карлсбад, США). Додавали загальну кДНК (100 нг на 25-мл реакції) із специфічними для послідовності праймерами та зондами Taqman®. Усі праймери та зонди цільового гена були придбані комерційно, включаючи b-актин як внутрішній контроль (Applied Biosystems). Аналіз qPCR проводили в трьох примірниках на системі визначення послідовності StepOnePlus (Applied Biosystems). Умовами циклу були 10-хв. активація полімерази при 95 градусах, а потім 40 циклів 95 градусів протягом 15 секунд і 60 градусів протягом 60 секунд. Порогове значення встановлювалося вище контрольного фону без шаблону та в межах лінійної фази ампліфікації цільового гена, щоб обчислити номер циклу, за якого було виявлено транскрипт (позначається CT).
Вестерн-блот аналіз
Клітинні лізати готували, як описано раніше [21, 22]. Білки розділяли за допомогою SDS-PAGE і переносили на полівінілдифторидні мембрани Immobilon (Millipore, Billerica, США). Блоти блокували 4% бичачим сироватковим альбуміном протягом 1 години при кімнатній температурі, а потім досліджували кролячими антитілами людини проти p-65 або p-p65 (1:1000) протягом 1 години при кімнатній температурі. Після трьох промивань блоти інкубували з кон’югованим з пероксидазою ослячим антикролячим вторинним антитілом (1:1000) протягом 1 години при кімнатній температурі. Блоти візуалізували за допомогою посиленої хемілюмінесценції з використанням плівки X-OMAT LS (Eastman Kodak, Рочестер, США).
Остеопороз, викликаний оваріектомією
Для цього дослідження використовували самок мишей ICR віком чотири тижні, вагою 22-28 г. Мишам проводили двобічну оваріектомію під анестезією трихлорацетальдегідом (100 мг/кг), а контрольним мишам проводили фіктивну операцію (Sham) для порівняння. Мінеральну щільність кісткової тканини та мінеральний вміст кісткової тканини вимірювали після перорального введення різних концентрацій CD(Цистанхеdeserticola)екстракт кожні два дні протягом чотирьох тижнів. Загальну мінеральну щільність кісткової тканини тіла та мінеральний вміст кісткової тканини визначали двоенергетичним рентгенівським абсорбціометром (DEXA; XR-26; Норланд, Форт-Аткінсон, США), використовуючи режим для невеликих суб’єктів, як описано раніше.[18, 23] Усі протоколи відповідали інституційним рекомендаціям і були схвалені Комітетом з догляду за тваринами Китайського медичного університету.
Статистичний аналіз
Статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення Prism 4.01. (GraphPad Software Inc., Сан-Дієго, США). Наведені значення є середнім значенням SEM. Статистичний аналіз між двома зразками проводили за допомогою t-критерію Стьюдента. Статистичні порівняння більш ніж двох груп проводили з використанням одностороннього дисперсійного аналізу з постфактум-тестом Бонферроні. У всіх випадках P <0,05 вважалося="">
Cistanche deserticolaдобре дляформування кісток
Результати
Цистанхе deserticolaекстракт збільшує мінералізацію кісток остеобластами Додавання CD(Цистанхеdeserticola)екстракт протягом 24 або 48 годин не впливав на проліферацію мишачих остеобластів MC3T3-E1 клітин у аналізі MTT (дані не показані). Оскільки диференціація остеобластів є складним процесом, що включає проліферацію та міграцію клітин, ми також перевірили міграційну здатність клітин MC3T3-E1 після лікування CD(Цистанхеdeserticola)екстракт. Використовуючи Трансвелл і тести на загоєння ран, ми виявили цей CD(Цистанхеdeserticola)екстракт не впливав на міграцію остеобластів (дані не показані). Утворення мінералізованих вузликів є одним із маркерів дозрівання остеобластів. Фарбування алізарином червоним S показало, що мінералізовані вузлики утворилися, коли остеобласти культивували протягом двох тижнів у середовищі, що містить вітамін С (50 мкг/мл) і гліцерофосфат (10 мМ), залежно від концентрації шляхом додавання CD.(Цистанхеdeserticola)(Малюнок 1а). Тому CD(Цистанхеdeserticola)витягти індуковане утворення кісткових вузликів культивованими остеобластами, але не їх проліферацію або міграцію. Ми також розглянули роль CD(Цистанхеdeserticola)екстракт у RANKL-індукованому остеокластогенезі, але не виявив ефекту (дані не показані).
Екстракт Cistanche deserticola підвищує експресію лужної фосфатази, кісткового морфогенетичного білка-2 та остеопонтину в культивованих остеобластах
Диференційовані остеобласти виявляють підвищену активність ЩФ, що корелює з високим рівнем експресії ферменту.[18] Ми виявили, що лікування CD(Цистанхеdeserticola)екстракт протягом 72 годин значно підвищив активність ЩФ остеобластів (рис. 1b). Враховуючи вирішальну роль BMP-2, ALP і OPN у диференціації остеобластів, ми перевірили, чи CD(Цистанхеdeserticola)екстракт впливає на диференціацію остеобластів, регулюючи експресію BMP-2, ALP і OPN. Обробка клітин з CD(Цистанхеdeserticola)витягує підвищену експресію мРНК ALP, BMP-2 і OPN залежно від концентрації (рис. 1c), демонструючи, що CD(Цистанхеdeserticola)витягують індуковану диференціацію остеобластів шляхом посилення експресії ALP, BMP-2 і OPN.
Екстракт Cistanche deserticola збільшує утворення кісткових вузликів через мітоген-активований протеїнкіназний шлях
Повідомлялося, що MAPK відіграє важливу роль укісткаформування[24, 25], тому ми потім перевірили, чи цей сигнальний шлях задіяний у CD(Цистанхеdeserticola)індукована екстрактом мінералізація кісток. Попередня обробка клітин інгібітором ERK U0126, інгібітором p38 SB203580 або інгібітором JNK SP600125 зменшувала CD(Цистанхеdeserticola)посилення мінералізації кісток за допомогою екстракту (рис. 2a, 3a і 4a). Крім того, інгібітори також блокували CD(Цистанхеdeserticola)індукована екстрактом експресія ALP, BMP-2 і OPN (рис. 2b–4c). Трансфекція клітин ERK2, p38 або JNK мутантним редукованим CD(Цистанхеdeserticola)екстракт-збільшення експресії мРНК ALP, BMP-2 і OPN (рис. 2c, 3c і 4c). Далі ми безпосередньо перевірили активацію ERK, p38 і JNK після CD(Цистанхеdeserticola)лікування екстрактом. Інкубація клітин з CD(Цистанхеdeserticola)індуковане екстрактом фосфорилювання ERK, p38 і JNK (рис. 2d, 3d і 4d). Отже, ERK, p38 і JNK опосередковують підвищеннякісткаформуванняіндукований CD(Цистанхеdeserticola)лікування остеобластів.
Екстракт Cistanche deserticola збільшує утворення кісткових вузликів через шлях ядерного фактора kB
Як згадувалося раніше, активація NF-kB необхідна длякісткаформування[26,27] Далі ми обробили остеобласти інгібіторами NF-kB піролідин дитіокарбаматом (PDTC) і N-тозил-L-фенілаланін хлорметилкетоном (TPCK), придбаними у Calbiochem (Дармштадт, Німеччина), щоб визначити, чи є активація NF-kB. бере участь у кр(Цистанхеdeserticola)індукована екстрактом мінералізація кісток. На малюнку 5а показано, що попередня обробка остеобластів PDTC або TPCK інгібувала CD(Цистанхеdeserticola)індуковане екстрактом утворення кісткових вузликів, а також зменшило збільшення експресії ALP, BMP-2 і OPN (рис. 5b і 5c). Фосфорилювання субодиниці NF-kB p65 є індикатором активації NF-kB [28] відповідно до цього ми виявили, що CD(Цистанхеdeserticola)витягують підвищене фосфорилювання p65 в остеобластах (рис. 5d). Ці результати показали, що активація NF-kB важлива для індукованої екстрактом CD ALP, BMP-2 і OPN експресії та утворення кісткових вузликів.
Рисунок 4. Залучення N-кінцевих кіназ c-Jun (JNK) уЦистанхеdeserticola(CD) індукована екстрактом мінералізація кістки в остеобластах. (a) Клітини поміщали в 24-лункові планшети та культивували в середовищі, що містить вітамін С (50 мг/мл) і b-гліцерофосфат (10 мМ) протягом двох тижнів. Клітини одночасно обробляли CD(Цистанхеdeserticola)екстракт (26 мг/мл) плюс SP600125 (3 мМ). Утворення мінералізованих вузликів оцінювали за допомогою фарбування алізариновим червоним S (n=5). (b, c) Клітини попередньо обробляли SP600125 протягом 30 хвилин або трансфікували мутантом JNK або 24 години з подальшою стимуляцією екстрактом CD, активністю лужної фосфатази (ALP) і ALP, кістковим морфогенетичним білком (BMP) -2 і Експресію мРНК остеопонтину (OPN) вимірювали за допомогою набору ALP і кількісної полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі. (d) Клітини обробляли екстрактом CD протягом зазначених інтервалів часу, і експресію p-JNK досліджували Вестерн-блоттингом. *П< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(Цистанхеdeserticola)група, оброблена екстрактом.
Інгібування втрати кісткової тканини екстрактом Cistanche deserticola у мишей з оваріектомією
Вивчити дію CD(Цистанхеdeserticola)екстракту про втрату кісткової маси, остеопороз був індукований у самок мишей за допомогою оваріектомії. Як і очікувалося, у мишей з видаленою яєчником спостерігалося зниження загальної мінеральної щільності кісткової тканини тіла та мінерального вмісту кісткової тканини (рис. 6а та 6b). Лікування CD(Цистанхеdeserticola)екстракту протягом чотирьох тижнів пригнічував втрату мінеральної щільності кісткової тканини та вмісту мінеральних речовин у кістковій тканині залежно від дози (рис. 6a та 6b). Концентрації ЩФ в крові можуть відображати активність остеобластів.[29] Як показано на малюнку 6c, CD(Цистанхеdeserticola)екстракт інгібував зниження активності ALP у сироватці крові, викликане оваріектомією. Крім того, CD(Цистанхеdeserticola)екстракт також підвищив рівень остеокальцину, маркеракісткаформування, і знизив рівень С-кінцевих телопептидів колагену типу I, маркера резорбції кісткової тканини (рис. 6d і 6e). Таким чином, ці результати підтверджують силу та ефективність CD(Цистанхеdeserticola)екстракт для запобігання втрати кісткової маси in vivo.
Рисунок 6 Інгібування індукованого оваріоектомією зниження мінеральної щільності кісткової тканини та мінерального вмісту кісткової тканини шляхомЦистанхеdeserticola(CD) витяг. Самкам мишей ICR зробили фіктивну операцію або видалили яєчники. Оваріектомованим мишам вводили зазначені концентрації CD(Цистанхеdeserticola)екстракт шляхом перорального годування. Загальна мінеральна щільність кісткової тканини тіла (a), мінеральний вміст кісткової тканини (b), активність лужної фосфатази (ALP) у сироватці крові (c), остеокальцин у сироватці (d) і С-кінцеві телопептиди в сироватці крові колагену I типу (e) були визначені чотири тижнів після операції. Дані представлені як середнє SE, n=8–10 мишей/групу. *P < 0.05,="" порівняно="" з="" фіктивним;="" #p=""><0,05 порівняно="" з="" групою="" з="">
ДИСКУСІЯ
Клацніть тут, щоб отримати інформацію про частину II (Обговорення та висновок) цієї статті.
Від: 'Цистанхеdeserticolaекстракт збільшуєтьсякісткаформуванняв остеобластахТе-Мао Ліaта ін
---© 2012 Автори. JPP © 2012 Королівське фармацевтичне товариство 2012Журнал фармації та фармакології, 64, стор. 897–907
