Cistanche tubulosa захищає дофамінергічні нейрони через регуляцію апоптозу та нейротрофічного фактора, отриманого з гліальних клітин: in vivo та in vitro-Ⅰ

ВСТУП

Хвороба Паркінсона (ХП) є поширеним нейродегенеративним захворюванням, що виникає у людей похилого віку з патологічними проявами втрати дофамінергічних нейронів у чорній субстанції (СН) через дегенерацію. Тяжкість захворювання корелює з втратою нейрональних клітин дофаміну (DA) у SN, що узгоджується з думкою, що нейродегенеративний процес прогресує протягом багатьох років до появи будь-яких симптомів (Соул і Майєрс, 1993). Прогресуючий характер захворювання пропонує цікаві можливості для терапевтичного втручання шляхом блокування основного нейродегенеративного процесу. Тому пошук індукованих терапією потужних і специфічних дій нейротрофічних факторів на виживання нейронів DA становить значний інтерес.

НАТУРАЛЬНА CISTANCHE TUBULOSA ДЛЯ ЗАХИСТУ ДОФАМІНЕРГІЧНИХ НЕЙРОНІВ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Нейротрофічні фактори — це важливі білки, включаючи фактор росту нервів (NGF), нейротрофічний фактор мозку (BDNF) і нейротрофічний фактор гліальних клітин (GDNF), які сприяють росту нервів, неврологічному розвитку, керуванню аксонами та функції нейронів. Серед усіх нейротрофічних факторів, які захищають і сприяють відновленню дофамінергічних нейронів, GDNF має найсильніший ефект (Hong та ін., 2008; Rangasamy та ін., 2010; Allen та ін., 2013). Було показано, що GDNF має потужну нейротрофічну дію на нейрони DA in vitro (Lin та ін., 1993) і виявляє нейропротекторну дію in vivo. Було показано, що GDNF рятує нейрони нігрального DA від загибелі клітин, викликаної ураженням, після хірургічної або індукованої токсинами аксотомії у щурів (Beck et al., 1995; Kearns and Gash, 1995; Sauer et al., 1995) і частково також після системне введенняN-метил-4-феніл-1,2,3,6-тетрагідропіридин (MPTP)у мишей (Tomac et al., 1995). Підвищена частота нейронального апоптозу та зниження захисних ефектів нейротрофічних факторів, потенційно викликаних різними патологічними факторами, лежать в основі дегенерації дофамінергічних нейронів (Holden et al., 2006).

C. tubulosa — рослинний лікарський засіб, отриманий з кількох рослин роду Cistanche. Це основний терапевтичний варіант для синдрому ниркової недостатності, який тісно пов’язаний з андрогенними гормонами в традиційній китайській медицині (ТКМ). На сьогодні багато клінічних і фундаментальних досліджень C. tubulosa показали активність нейродегенеративних захворювань. Ідентифікація рецептів ТКМ, що тонізують нирки, у лікуванні ХП може таким чином забезпечити альтернативне клінічне лікування ХП.Ехінакозид (ECH)є основним біоактивним компонентом, який міститься в лікарській траві C. tubulosa. Дослідження показали терапевтичні ефекти глікозидів цистанхе та ЕХГ,вербаскозид(VER) та ікаріїну (ICA) у пацієнтів із хворобою Альцгеймера (AD), PD та іншими пацієнтами з судинною деменцією (Urano та Tohda, 2010; Wang та ін., 2013; Wu та ін., 2014). Ву та ін. (2014) припустили, що екстракти C. tubulosa, які містили достатню кількість ЕХГ і актеозиду, полегшували когнітивну дисфункцію, спричинену A -42, шляхом блокування відкладень амілоїду та реверсії холінергічної та гіпокампальної дофамінергічної нейрональної функції. Тао та ін. (2015) виявили, щофенілетаноїдні глікозидиз C. tubulosa (Ph Gs-Ct) запобігав набряку мозку на великій висоті шляхом зниження експресії білка та мРНК AQP4 у тканині мозку моделей щурів.

НАТУРАЛЬНИЙ ЕКСТРАКТ ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗНОЇ ЗАКУСКИ ПОКРАЩУЮТЬ ПАМ'ЯТЬ PHGS75% ECH 30% ДІЮТЬ 12%

Попередні дослідження показали, що китайські рослинні сполуки, включаючи три інгредієнти C. tubulosa, epimedium і rhizoma polygonati, полегшували пошкодження дофамінергічних нейронів і підвищували рівень дофаміну шляхом регулювання експресії нейротрофічних факторів (Wu et al., 2013). Таким чином, поки що невідомо, чи індуковані C. tubulosa нейропротекторні ефекти є тривалими і якою мірою порятунок нігральних нейронів DA за допомогою введення GDNF може забезпечити суттєве збереження моторної поведінки, важливої ​​для симптоматики тварин з хворобою Паркінсона. У цьому дослідженні використовувався рецепт TCM для тонізування нирок, нанопорошок C. tubulosa, який отримав національний патент (номер патенту: 2011103028541) у Китаї та раніше показав певний терапевтичний ефект при ХП. Таким чином, це дослідження було розроблено для вивчення нейропротекторних і регенеративних ефектів лікування C. tubulosa та для вивчення апоптозу клітин MES23.5 і поведінкових дефінітивних щурів, а також регуляції GDNF, як виміряно за допомогою батареї цільових тестів. .

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Матеріали, реактиви та обладнання

C. tubulosa було придбано у Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., Пекін, Китай. ECH, VER і ICA надійшли від Національних інститутів контролю харчових продуктів і ліків Китаю. Клітинна лінія дофамінергічних нейронів MES23.5 була подарунком від професора Бяо Чена з лабораторії нейробіології Столичного медичного університету, Пекін, Китай. П’ятдесят мишей-самців C57BL/6 (вагою 20–25 г кожна) були придбані у Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (номер ліцензії: SCXK2012-0002), Шанхай, Китай.

MPP+, MTT і глутамін були придбані у Sigma-Aldrich (Карлсбад, Каліфорнія, США); Середовище DMEM/F12 і фетальну бичачу сироватку придбали у Gibco Co. (Life Technologies, Карлсбад, Каліфорнія, США); стандарт MPTP, DA та стандарт гомованілової кислоти (HVA) були придбані у Sigma-Aldrich (Карлсбад, Каліфорнія, США). - антитіла до актину, Bax, Bcl2, GDNF, рецептора сімейства GDNF альфа (GFR 1) і Ret були придбані в Cell Signaling Technology, Inc. (Беверлі, Массачусетс, США); Набір реагентів для фарбування 3,3'-діамінобензидину (DAB) був придбаний у Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Фуцзянь, Китай); і набір для підготовки зразків гелю SDS-PAGE, набір для виявлення ультрачутливої ​​хемілюмінесценції (ECL) і аналіз біцинхонінової кислоти (BCA) були придбані в Інституті біотехнології Beyotime (Пекін, Китай).

У цьому дослідженні використовувалися наступні прилади: ELX800 зчитувач мікропланшетів (Bio Tek Winooski, VT, США); CO2 інкубатор (Heraeus, Hanau, Німеччина); Система аналізу гелевих зображень Gel DOC 2000, клітина для електрофорезу та резервуар для електрофорезу (Bio-Rad, Hercules, CA, США); аналізатор білка DU-650 (Beckman Coulter, Inc., Фуллертон, Каліфорнія, США); високошвидкісна рефрижераторна центрифуга 5417R (Eppendorf, Гамбург, Німеччина); подвійний планетарний кульовий млин SXQM (Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Хунань, Китай); Млин-міксер MM400 (Retsch GmbH, Haan, Німеччина); високоефективна рідинна хроматографія Agilent 1200 (HPLC; Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія, США); Електрофорез PowerPac Basic, система трансмембранного переносу PowerPac Basic, хемілюмінесцентний візуалер Universal Hood II, система зворотної транскрипції РНК Thermal Cycler S1000 (Bio-Rad); Система аналізу зображень тканин і клітин Motic Med 6.0 (Motic China Group, Co., Ltd, Сямень, Китай).

ПідготовкаC. tubulosaНанопорошок

C. tubulosa зважили, потім очистили та зневоднили. Після звичайного подрібнення дрібний порошок C. tubulosa пропускали через 200-сітчасте сито та ліофілізували. Для приготування нанопорошку C. tubulosa використовували вакуумну та високоенергетичну кульову млин із контрольованою температурою. Спочатку необроблений нанопорошок C. tubulosa поміщали в резервуар для вакуумного кульового млину, який завантажували карбідними кульками. Співвідношення між розмелювальними кулями та нанопорошком C. tubulosa коливалося від 15:1 до 5:1. Для отримання дрібного порошку швидкість і тривалість високоенергетичної кульової млини встановлювали відповідно 300 об/хв і 20 хв. Тонкий порошок зважували для обробки нанорозмірних матеріалів і обробляли в змішувачі з частотою 25/с і коливанням 20 с протягом трьох повторів. PBS використовувався для розчинення та приготування основного розчину 25 мг/мл з наступною 30-хвилинною обробкою ультразвуком, автоклавуванням і, нарешті, зберіганням при -20 ◦C.

Контроль якості активних компонентівC. tubulosaметодом ВЕРХ

ECH і VER містили градієнтне елюювання з оксидом кремнію, зв’язаним октадецилсиланом, як наповнювач, метанолом як рухомою фазою A та 0.1% розчином мурашиної кислоти як рухомою фазою B. Довжина хвилі виявлення становила 330 нм. ICA містила градієнтне елюювання з оксидом кремнію, зв’язаним октадецилсиланом, як наповнювач і ацетонітрил-вода (30:70) як рухома фаза. Довжина хвилі детектування становила 270 нм. Зразок, контроль і негативний контроль вимірювали по 10 мкл кожен для тесту.

Клітинна культура та аналіз МТТ для вимірювання життєздатності MPP+- Оброблені клітини

Клітини MES23.5 інокулювали 5% фетальної телячої сироватки, 1% глутаміну, 2% 50× розчину Сато та середовища DMEM/F12 з 2% пеніциліну/стрептоміцину. Їх інкубували при 37 ◦C в інкубаторі 5% CO2 з насиченою вологістю. Клітини виділяли і пасували з 0,25% трипсином, а клітинну суспензію збирали в логарифмічній фазі росту. Ізольовані клітини з щільністю 1 × 105 висівали в покриті полілізином 96-лункові планшети з подальшим додаванням різних кінцевих концентрацій (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 і 800 мкмоль/л). ) носіїв MPP+. Клітини MES23.5, які інкубували з нормальним культуральним середовищем протягом 24 годин і 48 годин, використовували як негативні контролі в експериментах in vitro. Клітини з різних груп лікування інкубували з реагентом MTT протягом 4 годин. Згодом розчин у лунках видаляли, додавали 150 мкл ДМСО та коливали протягом 10 хв. Оптичну густину кожного зразка при довжині хвилі 570 нм вимірювали за допомогою автоматичного пристрою для зчитування мікропланшетів. Відсоток життєздатності клітин (%)=середнє поглинання експериментальної групи/середнє поглинання групи негативного контролю × 100%.

Відповідні концентрації середовища MPP+ додавали для 24-годинної обробки в клітинах MES23.5, використовуючи той самий підхід, що й для культури in vitro. Після обробки розчин у лунці викидали. Середовище, що містить різні концентрації (10, 50, 100, 200, 250, 500 та 1000 мкг/мл) нанопорошку C. tubulosa, додавали до клітин MES23.5 у різні лунки та залишали для інкубації протягом 24 та 48 годин. Клітини MES23.5, які інкубували з нормальним культуральним середовищем протягом 24 годин і 48 годин, використовували як негативний контроль. Клітини MES23.5, які інкубували з середовищем MPP+, використовували як носій. Вимірювання проводили в трьох повторах для кожного зразка. Для обчислення життєздатності клітин вимірювали поглинання відповідних оброблених і контрольних груп.

НАТУРАЛЬНИЙ ЕКСТРАКТ ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗНОЇ ПРОТИ ВТОМИ PHGS75% ECH 30% ДІЯ 12%

Експресія TH, виміряна імуноцитохімічним методом

Коли нанопорошок C. tubulosa був у концентраціях 100, 200 і 250 мкг/мл, рівень виживання клітин значно зріс (Малюнок 2G). Таким чином, у подальших експериментах ми протестували три концентрації: низькі дози, середні дози та групи високих доз. Для кожної з груп C. tubulosa було протестовано три повтори. Стерилізовані покривні скельця, покриті полілізином, поміщали в 6-лункові планшети. Далі 5 × 104 клітин висівали в кожну лунку та інкубували протягом 24 годин. У нормальній контрольній групі було замінено звичайне свіже середовище, а в інших групах лікування було замінено середовище кінцевої концентрації 100 мкмоль/л MPP+ для інкубації протягом 24 годин. Звичайні свіжі середовища потім замінювали в групах нормального контролю та наповнювача, і кінцеві концентрації 100, 200 та 250 мкг/мл нанопорошку C. tubulosa інкубували з клітинами протягом 24 годин у низькій, середній та високій дозах. групи лікування C. tubulosa відповідно. Клітини MES23.5 у різних групах тричі промивали PBS для видалення супернатанту та додатково фіксували в 4% параформальдегіді протягом 15 хвилин. Після промивання PBS клітини інкубували з блокатором пероксидази при 37 °C протягом 30 хвилин, а потім знову промивали PBS. Для пермеабілізації клітин використовували 0,2% розчин Triton X-100 протягом 10 хв з подальшим промиванням PBS. Нормальну козячу сироватку додавали до кожного зразка та інкубували при кімнатній температурі протягом 30 хв. Потім нормальну козячу сироватку видаляли, а первинне антитіло, розведене 1:400 у PBS, додавали до кожного зразка та інкубували при 4°C протягом ночі. Клітини в групі негативного контролю інкубували з PBS при 4°C протягом ночі. Після промивання PBS клітини інкубували з міченими біотином вторинними антитілами у вологій камері при 37 °C протягом 20 хвилин. Потім кожен зразок промивали PBS і мічили кон’югатами пероксидаза хрону-стрептавідин (робочий розчин C) при 37 °C протягом 20 хвилин. Після промивання PBS клітини фарбували реагентом DAB у темряві протягом приблизно 1–10 хвилин і спостерігали за появою коричневого кольору під світловим мікроскопом. Потім кожен зразок двічі промивали дистильованою водою протягом 1–2 хв, а ядра контрастно фарбували розчином гематоксиліну протягом 0,5–1 хв. Після ретельного промивання кожного зразка у воді клітини занурювали в 1% розчин соляної кислоти для диференціювання та 1% водний розчин аміаку з подальшим ретельним промиванням клітин у воді. Потім клітини з кожного зразка зневоднювали в 70% етанолі протягом 2 хвилин, 80% етанолі протягом 2 хвилин, 90% етанолі протягом 2 хвилин двічі, 95% етанолі протягом 2 хвилин двічі і 100% етанолі протягом 2 хвилин двічі. Потім клітини двічі занурювали в розчин ксилолу на 2 хв і встановлювали на предметне скло з нейтральними смолами. Під світловою мікроскопією кожен зразок пройшов захоплення зображення та випадковий вибір 5–10 ефективних полів зору для визначення експресії вибраних білків у дофамінергічних нейронах, що вказується інтенсивністю коричневих частинок, і для напівкількісної оцінки вмісту білка за його середнім значенням сірого .

Швидкість апоптозу клітин MES23.5, виміряна проточною цитометрією

Прилиплі клітини один раз промивали PBS. Для ізоляції клітин додавали відповідну кількість розчину трипсину, що не містить EDTA, при кімнатній температурі, і розчин обережно перебирали піпеткою, щоб дати можливість прикріпленим клітинам від’єднатися. Потім додавали середовище для культивування клітин, щоб зупинити трипсинізацію. Суміш переносили в нову центрифужну пробірку, а потім центрифугували протягом 5 хвилин при 1500 об/хв, щоб зібрати ізольовані клітини. Після видалення супернатанту клітинний осад обережно ресуспендували з використанням PBS і клітини підраховували. Приблизно від 1 × 105 до 5 × 105 ресуспендованих клітин центрифугували протягом 5 хвилин при 1500 об/хв, а супернатант відкидали. П’ять мікролітрів зв’язуючого розчину Annexin V-FITC додавали до осаду клітин, щоб обережно ресуспендувати клітини. Додали ще 5 мкл Annexin V-FITC і ретельно перемішали. П'ять мікролітрів розчину пропідію йодиду використовували для фарбування клітин шляхом інкубації при кімнатній температурі протягом 10 хвилин незадовго до проточної цитометрії.

Вестерн-блот аналіз дляin vitro

Клітини були розділені на звичайну групу, групу лікування MPP+, низькі дозиC. tubulosaгрупа лікування, група лікування середньою дозою C. tubulosa та група лікування високою дозою C. tubulosa. Експресію Bcl2 і Bax вимірювали в кожному. Загалом 1 × 105 клітин на лунку в 6-лунковому планшеті використовували для моделювання та лікування в кожній групі перед збором клітин. Змішаний лізат, що містить буфер RIPA, інгібітор протеази та інгібітор фосфатази, додавали для лізису клітин протягом 30 хвилин на льоду. Після центрифугування супернатант використовували для аналізу білка. Загальний білок кількісно визначали за допомогою аналізу BCA і розділяли за допомогою 10% SDS-PAGE. Відокремлені білки переносили на мембрану та інкубували з 5% буфером, що блокує знежирене молоко, при кімнатній температурі протягом 2 годин. Потім мембрану інкубували в первинному антитілі (Bcl-2 0.34 мг/мл, Bax 0,11 мг/мл, розведення 1:200) при 4°C протягом ночі. Після етапу промивання мембрану інкубували у вторинному антитілі (0,5 мг/мл, розведення 1:5000) при 4 °C протягом 1 години, а потім у проявнику ECL протягом 2 хвилин для звичайного прояву. Для напівкількісного аналізу експресії білка використовували програмне забезпечення Quantity One.

НАТУРАЛЬНА CISTANCHE TUBULOSA ДЛЯ ЗАХИСТУ ПЕЧІНКИ ПРОТИ ВТОМИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Експериментальне моделювання тварин і введення ліків

П’ятдесят 8-тижневих мишей-самців, вільних від специфічних патогенів, випадковим чином розділили на п’ять груп: нормальна група, група лікування MPTP (носій), група лікування низькою дозою C. tubulosa, група лікування середньою дозою C. tubulosa групу та групу лікування високою дозою C. tubulosa. Тварин утримували при температурі 20–22°С із вільним доступом до їжі та води. Мишам у нормальній групі протягом семи днів поспіль внутрішньоочеревинно вводили рівний об’єм фізіологічного розчину. Мишам в інших групах лікування внутрішньоочеревинно вводили MPTP (30 мг/кг/день) протягом семи днів поспіль для встановлення носіїв.

Під час моделювання PD мишам у групах лікування низькими, середніми та високими дозами C. tubulosa внутрішньошлунково вводили еквівалентні клінічні об’єми 4 г/кг/день, 8 г/кг/день та 16 г/день. кг/добуНанопорошок C. tubulosa, відповідно, протягом 14 днів поспіль. Мишам у контрольній групі та групі носія внутрішньошлунково вводили еквівалентні об’єми нормального фізіологічного розчину протягом 14 днів поспіль. Усі експериментальні процедури були схвалені Комітетом з етики Фуцзяньського університету ТКМ і виконані відповідно до міжнародно прийнятих принципів використання та догляду за лабораторними тваринами. У цьому дослідженні були зроблені всі зусилля, щоб мінімізувати страждання тварин.