Cistanche Rb1 пом'якшує пов'язані з віком судинні порушення шляхом модуляції Gas6 Pathway

Результати. Rb1 зменшив старіння в аорті старіючих мишей

Щоб ідентифікувати антистарільний ефект Rb1, ми спочатку дослідили клітинне старіння, яке характеризується експресією білків, що беруть участь у інгібуванні клітинного циклу та незворотній зупинці росту (Yang та ін. 2019). Оскільки результати імуногістохімії показані на малюнку 1(A,B), порівняння з результатами в групі Young, миші групи Old þ Vehicle показали, що старіння прискорює регуляцію p21Cip1 і p16INK4a в клітинах грудної аорти. Однак лікування Rb1 пом’якшило клітинне старіння в кровоносних судинах, особливо в групі Old þ Rb1-20. Крім того, результати вестерн-блоту відповідалирезультати імуногістохімії. Як показано на малюнку 1(C), експресія білків p21Cip1 і p16INK4a була значно збільшена приблизно в 2-рази в грудній частині аорти літніх мишей порівняно з молодими мишами. Після лікування 20 мг/кг Rb1 рівні білка p21Cip1 і p16INK4a були лише збільшені на 41,92 відсотка та 37,52 відсотка порівняно з рівнями в групі Young, які були значно нижчими, ніж у групі Old plus Vehicle. Крім того, не було істотної різниці в експресії p21Cip1 або p16INK4a між молодими мишами з лікуванням Rb1 і без нього.

Рисунок 1. Вплив Rb1 на старіння грудної аорти. Зображення імуногістохімічного фарбування (400 ) p21Cip1 (A) і p16INK4a (B) у поперечних зрізах грудної аорти миші. (C) Вестерн-блот аналіз експресії p21Cip1 і p16INK4a грудної аорти миші. Дані виражені як середнє ± SD. p < 0,01 порівняно з групою Young; # p < 0,05 порівняно з групою Oldþ Vehicle.

Rb1 покращив реактивність судин у літніх мишей

Для оцінки ендотелій-залежної вазодилатації використовували експеримент із судинним кільцем. Як показано на малюнку 2, у всіх кільцях грудної аорти мишей введення Ach призвело до розслаблення судин. При максимальних концентраціях (10–5 моль/л) Ach індукував приблизно 88,84% ± 1,20% і 58,35% ± 2,50% вазорелаксацію в групі Young та у групі Old þ Vehicle, відповідно, демонструючи, що старіння пов’язане з порушенням реактивності судин. Проте лікування 10 і 20 мг/кг Rb1 призвело до приблизно 70,48% ± 2,20% і 80,90% ± 3,24% релаксації, відповідно, у старіючих кільцях грудної аорти мишей у відповідь на 10 5 моль/л Ach.

Натисніть тут, щоб отримати Cistanche для боротьби зі старінням

Rb1 знижує експресію молекули клітинної адгезії в грудній частині аорти старіючих мишей

Ми перевірили експресію білка певних молекул клітинної адгезії, щоб визначитизапальнийіпротизапальну діюRb1 на літніх мишах. Результати показали, що експресія білків ICAM-1, VCAM-1 і PAI-1 була значно збільшена приблизно в 2-4 разів у грудній частині аорти літніх мишей порівняно з тими, у молодій групі (рис. 3). Навпаки, лікування Rb1 значно пригнічувало ці зміни в грудній аорті старих мишей, але не мало впливу на групи молодих мишей. Кількісний аналіз показав, що лікування 20 мг/кг Rb1 призвело до приблизно 36,58 відсотка, 46,66 відсотка та 49,34 відсотка зниження експресії білка ICAM-1, VCAM-1 та PAI-1 відповідно, у старінні тканини грудної аорти порівняно з мишами групи Old plus Vehicle.

Rb1 пригнічує вікову кальцифікацію судин і фіброз

Ми виконали фарбування HE та фарбування алізариновим червоним S для оцінки структури тканини аорти та медіальної кальцифікації судин у старіючих мишей відповідно. Фарбування HE показало, що спричинені старінням потовщені стінки грудної аорти та дезорганізація позаклітинного матриксу аорти можуть бути усунені за допомогою лікування Rb1 (рис. 4(A)). Як показано на малюнку 4(B), у старіючих мишей розвинулася більш серйозна медіальна кальцифікація (червона зона), ніж у молодих мишей, тоді як втручання Rb1 зменшило цю патологічну зміну. Потім ми досліджували поперечні зрізи грудної аорти за допомогою трихромного фарбування за Массоном, щоб оцінити судинний медіальний фіброз у старіючих мишей. Результати показали, що спостерігалося помітне збільшення відкладення колагену (блакитна зона) у групі Old þ Vehicle порівняно з групою Young (Малюнок 4(C)), і цей ефект був значно пригнічений втручанням Rb1. Крім того, вестерн-блоттинг показав, що експресія колагену I і колагену III значно зросла в 4.34- і 2.62-рази у мишей групи Old þ Vehicle порівняно з молодими мишами; однак лікування Rb1 знижувало експресію колагену I та колагену III у літніх мишей (рис. 4(D)). Крім того, лікування Rb1 не мало впливу на ступінь кальцифікації грудної аорти та фіброзу у молодих мишей (рис. 4(A–D)).

Rb1 регулював сигнальний шлях Gas6

Ми далі досліджували, чи функціонує Rb1 через сигнальний шлях Gas6/Axl для полегшення пов’язаного з віком порушення грудної аорти у мишей. Зниження експресії білка Gas6 на 41,72 відсотка та експресії мРНК на 52,73 відсотка у літніх мишей порівняно з молодими мишами було скасовано лікуванням Rb1 (рис. 5 (A, B)). Ми також визначили експресію білка Axl методом Вестерн-блот. Цікаво, що не було істотної різниці в експресії білка Axl серед п’яти експериментальних груп (рис. 5(A)). Ми також не виявили значної різниці в рівнях мРНК Axl між групами (рис. 5(B)).

Рисунок 2. Лікування Rb1 послабило пов’язане з віком ендотелій-залежне порушення вазорелаксації судинних кілець грудної аорти. Малюнки результатів аналізу. Дані виражені як середнє ± SD. p < 0.05, p < 0.01 проти групи Young; # p < 0,05, ##p < 0,01 проти групи Old þ Vehicle.

Рисунок 3. Rb1 знижує експресію молекули клітинної адгезії в грудній аорті старих мишей. Вестерн-блот аналіз експресії ICAM-1, VCAM-1 і PAI-1 у тканинах грудної аорти. Дані виражені як середнє ± SD. p < 0.01 проти групи Young; # p < 0.05, ##p < 0,01 порівняно з групою Oldþ Vehicle.

Обговорення

У цьому дослідженні ми продемонстрували, що Rb1 покращивсявікові порушення роботи судиншляхом пригнічення кальцифікації та фіброзу через регуляцію експресії Gas6, але не експресії Axl, що забезпечує потенційну терапевтичну стратегію для запобігання віковим захворюванням судин. Загальноприйнято, що старіння судинних клітин, яке характеризується ендотеліальною дисфункцією та фенотипічним переходом клітин гладких м’язів, може призвести до збільшення жорсткості судин і збільшення товщини стінок судин (Liu et al. 2019). Старіння судинних клітин є загальною ознакою різних складних вікових захворювань, зокрема серцево-судинних захворювань (O'Rourke et al. 2010). З розвитком старіння судинних клітин функція судин порушується (Gong et al. 2014). Прикладом вікової судинної дисфункції є патофізіологічні зміни, включаючи прогресуюче зниження ендотелій-залежної вазодилатації (Herrera та ін. 2010; Gong та ін. 2014). У нашому дослідженні ми підтвердили клітинне старіння в грудній частині аорти літніх мишей, на що вказувала підвищена експресія вікових білків p21Cip1 і p16INK4a, а також зниження ендотелій-залежної вазодилатації. Узгодженість наших результатів із вищезазначеними дослідженнями свідчить про те, що існували деякі важливі молекулярні механізми, пов’язані зі змінами патофізіології судинних клітин під час старіння. Агенти, які діють на ці механізми, ймовірно, значно зменшать і затримають старіння судинних клітин.

Рисунок 4. Лікування Rb1 полегшило кальцифікацію судин і фіброз, спричинені старінням. (A) Фарбування гематоксиліном і еозином (HE) (400), (B) Фарбування алізариновим червоним S (400) і (C) Трихромне фарбування за Массоном (400 ) репрезентативних відділів грудної аорти в кожній групі. (D) Вестерн-блот аналіз експресії колагену I та колагену III у тканинах грудної аорти. Дані виражені як середнє ± SD. p < 0,01 порівняно з групою Young; # p < 0,05, # # p < 0,01 порівняно з групою автомобілів Oldþ

Рисунок 5. Вплив Rb1 на сигнальний шлях Gas6/Axl. (A) Було проведено вестерн-блоттинг, щоб перевірити експресію білка Gas6 і Axl. (B) КПЦР проводили для дослідження експресії мРНК Gas6 і Axl. Дані виражені як середнє ± SD. p < 0.05, p < 0.01 проти групи Young; # p < 0,05 проти групи Old þ Vehicle.

Накопичення доказів показало, що Rb1 вважається перспективним препаратом для запобігання пошкодженню судин (Zhou та ін. 2017, 2019a, 2019b; Zheng та ін. 2020). Попередні дослідження показали, що Rb1 запобігає старінню клітин судин і пригнічує кальцифікацію судин (Nanao-Hamai та ін. 2019; Zhou та ін. 2019b; Zheng та ін. 2020). Однак досі невідомо, чи може Rb1 захистити артеріальні функції від старіння та відповідний молекулярний механізм. Тут ми виявили, що Rb1 знижує та уповільнює артеріальне старіння у літніх мишей, як продемонстровано зниженням експресії споріднених білків і покращенням судинної вазодилатації, що вказує на те, що Rb1 може ефективно блокувати надмірне старіння в старіючій грудній аорті мишей і може використовуватися як ефективний засіб для лікування або профілактика артеріальної недостатності, пов'язаної з віком.

Попередні дані продемонстрували накопичення хронічного артеріального запалення низького ступеня з віком, що сприяє віковим структурним і функціональним змінам судин (Wang et al. 2014). Додаткові дослідження показали, що мікрооточення, збагачене запальними профілями, індукує фенотипічний зсув у VSMC від скоротливого до синтетичного типу. Цей фенотипічний зсув характеризується ослабленою експресією SMC-специфічних скорочувальних білків і секрецією додаткових прозапальних цитокінів, хемокінів, білків ECM і молекул клітинної адгезії, таких як колаген, ICAM-1, VCAM-1 та PAI-1 (Ванг та ін. 2011; Лаколлі та ін. 2018). Крім того, молекули адгезії сприяють індукованому запаленням ремоделюванню артерій, зокрема шляхом реорганізації взаємодії ECM-VSMC і впливу на фенотипову модуляцію VSMC (Intengan et al. 1999). Крім того, дослідження показали, що Rb1 має протизапальну дію in vivo та in vitro (Miao та ін. 2017; Zhou та ін. 2017). У цьому дослідженні ми виявили, що лікування Rb1 може значно знизити рівні експресії молекул клітинної адгезії, пов’язаних із запальними процесами у літніх мишей, що свідчить про те, що Rb1 може діяти як протизапальний препарат і захищати судинну систему під час старіння.

Крім запального ураженняремоделювання артеріальної стінки, що характеризується кальцифікацією та фіброзом, є іншою основною патофізіологічною зміною у вікових безсудинних модифікаціях і викликає жорсткість судин, що сприяє зменшенню вазодилатації (McEniery та ін. 2005; Iyemere та ін. 2006; Kovacic та ін. 2011). Масштабні дослідження показали, що коронарна атеросклеротична кальцифікація зростає з віком (Tesauro et al. 2017). Інші дослідження також продемонстрували наявність посиленого кальцифікації в області сонної артерії зі старінням (Wendorff et al. 2015). Подібним чином, наші результати показали, що старіючі миші розвинули більш серйозну медіальну кальцифікацію судин, ніж молоді миші. Втручання Rb1 суттєво пригнічувало ці зміни. Цей результат свідчить про те, що введення Rb1 зменшує ступінь вікової кальцифікації судин in vivo. Достатні докази показали, що кальцифікація судин включає різноманітні патобіологічні процеси, а не просте відкладення кальцію, серед яких перехід VSMC у клітини, подібні до остеобластів, відіграє вирішальну роль (Zhou et al. 2019b). Одним з обмежень нашого дослідження є те, що, незважаючи на виявлення того, що втручання Rb1 значно пригнічує кальцифікацію судин у грудній аорті старіючих мишей, скоротливі маркери VSMC (такі як гладком’язовий актин A і кальпонін) і остеогенні маркери VSMC (такі як транскрипційний фактор 2, пов’язаний з рантом). ) вимагають подальшого дослідження.

Крім того, у цьому дослідженні ми також спостерігали зниження рівня інтерстиціального колагену та зниження експресії спорідненого білка у старих мишей, які отримували Rb1-, порівняно з літніми мишами, які отримували носій, що свідчить про те, що Rb1 може мати сприятливий вплив на функцію судин у старінні грудної аорти шляхом полегшення спричиненого віком фіброзу судин. Harvey та ін. (2016) повідомили, що посилення артерій, викликане надмірним фіброзом і збільшенням відкладення колагену, може призвести до підвищення вазомоторного тонусу та зміни перфузії тканин. Вважається, що агенти, які послаблюють фіброз, захищають від захворювань судин, пов’язаних із віком (Kim et al. 2018).

Можна зробити висновок, щовікові порушення роботи судинце складний процес, який включає різні аномальні зміни, включаючи запалення, кальцифікацію та фіброз. Що ще важливіше, ми виявили, що Rb1 здатний інгібувати ці відомі аномальні зміни в грудній частині аорти старих мишей. Однак основний механізм досі невідомий. Gas6 було ідентифіковано як lig і для сімейства рецепторів TAM, особливо рецепторів тирозинкінази Axl (Rothlin et al. 2015). Попереднє дослідження продемонструвало роль Gas6/Axl у регулюванні багатьох клітинних функцій (Chen et al. 2019). Нещодавнє дослідження показало, що Gas6/Axl відіграє вирішальну роль у кальцифікації судин (Son et al. 2010; Kaesler et al. 2016; Nanao-Hamai et al. 2019), а також може брати участь у індукованому лікуванням зниженні регуляції синтезу колагену в VSMC і старіння серцевої тканини (Chen et al. 2016; 2019). Крім того, попередні дослідження показали, що Rb1 активує транскрипцію Gas6 у специфічному місці ARE в промоторній області (Son та ін. 2010; Nanao-Hamai та ін. 2019). Тут ми продемонстрували, що експресія білка Gas6 знижувалася у старіючих мишей, але була скасована лікуванням Rb1, що вказує на те, що Gas6 може брати участь у Rb1-опосередкованій регуляції артеріальних порушень у літніх мишей. Проте наші результати показують, що не було жодних змін у експресії протеїну Axl та мРНК, що не узгоджується з попереднім дослідженням (Chen та ін. 2019). Сімейство рецепторів TAM включає Tyro3, ​​Axl і MerTK. Хоча Gas6 демонструє найбільшу спорідненість з Axl серед трьох учасників (Rothlin та ін. 2015), Sun та ін. (2019) виявили, що активація Gas6 послабила запальне пошкодження та апоптоз у мишей, але в експериментальних групах не відбулося жодних змін в активації Axl. Інші дослідження показали, що експресія Axl, яка пригнічує апоптоз і, отже, кальцифікацію судин, також не змінювалася у мишей Gas6–/– (Kaesler et al. 2016). Наші результати чітко показали, що Rb1 спеціально послаблював вікову регуляцію Gas6, але не впливав на експресію Axl, яка, як повідомляється, є основною подією, відповідальною за кальцифікацію судин і фіброз, для покращення вікового судинного запалення та ендотелій-залежної вазодилатації . Стабільна експресія Axl може бути результатом достатньої кількості до активації Gas6 або вказувати на те, що Gas6 функціонує через інші рецептори. Потрібне подальше дослідження впливу Rb1 на інші TAM, які також можуть бути активовані Gas6, такі як Tyro3 і MerTK.

Висновки

У цьому дослідженні ми підтвердили, що Rb1 пригнічує кальцифікацію судин і фіброз і знижує експресію молекул клітинної адгезії, що згодом покращує пов’язану з віком судинну ендотелій-залежну вазодилатацію, принаймні частково, регулюючи експресію Gas6, але не експресію Axl. У зв’язку з неконтрольованим старінням пошук агентів, які можуть запобігти або лікувати вікове ураження судинних клітин, має велике значення. Наше дослідження надає докази, що підтверджують вплив Rb1 на ураження судин у старіючих мишей.

Заява про розкриття інформації

Автор(и) не повідомили про потенційний конфлікт інтересів.

Фінансування Ця робота була підтримана грантами Національного фонду природничих наук Китаю [81370447], Проекту науково-технологічного планування провінції Гуандун Китаю [2016A050502014], Шеньчженського фонду побудови ключових медичних дисциплін [SZXK002] та Науково-медичних досліджень Заснування провінції Гуандун Китаю [A2019079].

Заява про наявність даних

Дані та матеріали надаються за запитом автору.

Авторські внески

SYK, DHL та XXQ зробили внесок у концепцію та дизайн цієї роботи. LW, GYS та MW сприяли аналізу даних. SYK, LW та JMZ написали рукопис. Усі автори прочитали та схвалили остаточний варіант.

Список літератури

Акоста Дж. К., О'Логлен А., Баніто А., Гіхарро М. В., Огерт А., Рагуз С., Фумагаллі М., Да Коста М., Браун С., Попов Н. та ін. 2008. Передача сигналів хемокінів через рецептор CXCR2 підсилює старіння. Стільниковий. 133(6): 1006–1018.

Brandes RP, Fleming I, Busse R. 2005. Ендотеліальне старіння. Cardiovasc Res. 66(2):286–294.

Chen FF, Song FQ, Chen YQ, Wang ZH, Li YH, Liu MH, Li Y, Song M, Zhang W, Zhao J та ін. 2019. Екзогенний тестостерон полегшує серцевий фіброз і апоптоз через шлях Gas6/Axl у старіючих мишей. Експерт Геронтол. 119:128–137.

Chen YQ, Zhao J, Jin CW, Li YH, Tang MX, Wang ZH, Zhang W, Zhang Y, Li L, Zhong M. 2016. Тестостерон затримує старіння клітин гладкої мускулатури судин і пригнічує синтез колагену через сигнальний шлях Gas6/Axl . Вік 38(3):60.

Fridell YW, Villa J, Attar EC, Liu ET. 1998. GAS6 індукує Axl-опосередкований хемотаксис гладком'язових клітин судин. J Biol Chem. 273 (12): 7123–7126.

Gong X, Ma Y, Ruan Y, Fu G, Wu S. 2014. Довготривале застосування аторвастатину покращує вікову ендотеліальну дисфункцію шляхом зменшення окислювального стресу та нормалізації дисбалансу eNOS/iNOS в аорті щурів. Експерт Геронтол. 52:9–17.

Харві А., Монтезано А.С., Лопес Р.А., Ріос Ф., Туїз Р.М. 2016. Судинний фіброз при старінні та гіпертензії: молекулярні механізми та клінічні наслідки. Може J Кардіол. 32(5):659–668.

Herrera MD, Mingorance C, Rodriguez-Rodriguez R, Alvarez de Sotomayor M. 2010. Ендотеліальна дисфункція та старіння: оновлення. Aging Res Rev. 9(2):142–152.

Hsu JJ, Lu J, Umar S, Lee JT, Kulkarni RP, Ding Y, Chang CC, Hsiai TK, Hokugo A, Gkouveris I, Tetradis S та ін. 2018. Вплив терипаратиду на морфологію кальцифікації аорти у літніх мишей з гіперліпідемією. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 314(6):H1203–H1213.

Hurtado B, Abasolo N, Munoz X, Garcia N, Benavente Y, Rubio F, Garcia de Frutos P, Krupinski J, Sala N. 2010. Дослідження асоціації між поліморфізмами в генах GAS6-TAM і каротидним атеросклерозом. Тромб Гемост. 104(3):592–598.

Інтенган HD, Thibault G, Li JS, Schiffrin EL. 1999. Механіка, структура та позаклітинні компоненти артерій опору у щурів зі спонтанною гіпертензією: ефекти антагонізму рецепторів ангіотензину та інгібування перетворюючого ферменту. Тираж. 100(22):2267–2275.

Айемер В.П., Праудфут Д., Вайсберг П.Л., Шанахан К.М. 2006. Фенотипова пластичність гладком’язових клітин судин і регуляція кальцифікації судин. J Intern Med. 260(3):192–210.

Kaesler N, Immendorf S, Ouyang C, Herfs M, Drummen N, Carmeliet P, Vermeer C, Floege J, Kruger T, Schlieper G. 2016. Білок Gas6: його роль у серцево-судинній кальцифікації. BMC Нефрол. 17(1):52. Кім Е.Н., Кім М.Й., Лім Дж.Х., Кім І., Шин С.Дж., Парк С.В., Кім Ю.С., Чанг Ю.С., Юн Х.Е., Чой Б.С. 2018. Захисний ефект ресвератролу на старіння судин шляхом модуляції ренін-ангіотензинової системи. атеросклероз. 270: 123–131. Коршунов В.А., Мохан А.М., Джорджер М.А., Берк BC. 2006. Axl, рецепторна тирозинкіназа, опосередковує індуковане потоком ремоделювання судин. Circ Res. 98(11):1446–1452.