Дослідження для Cistanche хімічних профілів і метаболітів

Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com

Чже Лі, Лхаасурен Рьєнчіндордж, Бонан Лю, Цзі Ши, Чао Чжан, Юе Хуа, Пенпен Лю, Гуошунь Шан і Тяньчжу Цзя

Анотація

Довідкова інформація: обробка китайської матерії медіки є видатною та унікальною фармацевтичною технікою в традиційній китайській медицині (ТКМ), яка використовується для зменшення побічних ефектів і підвищення або навіть зміни терапевтичної ефективності сирих трав. Зміни в основних компонентах, спричинені оптимізованою процедурою обробки, головним чином відповідають за підвищення ефективності лікарських рослин. Підбадьорливий ефект на нирки-ян відвареного на пару рисового вина Cistancha deserticola (C. deserticola) був сильнішим, ніж сирий C. deserticola (CD). Методи: був проведений порівняльний аналіз за допомогою UPLC-Q-TOF-MSE з інформаційною платформою UNIFI для визначення впливу обробки. Дослідження in vitro були проведені для характеристики компонентів, а такожметаболітив природних умовах. Theхімічнийкомпонентів визначали в CD та продуктах його переробки. Багатофакторний статистичний аналіз проводився для оцінки варіацій між ними, тоді як OPLS-DA використовувався для попарного порівняння. Результати: Результати цього дослідження виявили значні варіації фенілетаноїдних глікозидів (PhG) та іридоїдів після обробки. Всього в екстрактах CD та продуктах його переробки виявлено 97 сполук. PhG, що містять 4'-O-кофеоїльну групу в 8-O- -D-глюкопіранозильній частині, наприклад актеозид, цистанозид C, кампнеозид II, османтузид, зменшилися після обробки, тоді як PhG з 6'-O- кофеїльної групи в 8-O- -D-глюкопіранозиловій частині, таких як ізоацетозид, ізоцистанозид C, ізокампнеозид I, ізомартинозид, збільшено, особливо в групі CD-NP. Також зросла інтенсивність ехінакозиду та цистанозиду B, структура яких містить 6'-O- -D-глюкопіранозильний фрагмент. У дослідженні in vivo 10 прототипів компонентів і 44метаболітибули виявлені в плазмі, фекаліях і сечі щурів. Отримані результати показали, що обробка призводить до значної варіації вхімічнийкомпоненти CD і вплинули на розподіл сполук in vivo, а метаболічні процеси фази II є ключовими каскадами кожної сполуки, і більшістьметаболітипов'язані з ехінакозидом або актеозидом. Висновки: це перше глобальне порівняльне дослідження сирих і оброблених компакт-дисків. Ці висновки доповнюють наше розуміння впливу обробки CD і дають важливі дані для майбутніх досліджень ефективності.

Дослідження цистанх хімічних профілів і метаболіту

вступ

Обробка китайської Materia Medica (CMM) продемонструвала значну застосовність у клінічній практиці традиційної китайської медицини (TCM), і вона вважалася життєздатним лікуванням протягом кількох століть. Це унікальна фармацевтична технологія, яка була похідною від теорії ТКМ. Після обробки значні відмінності у зовнішньому вигляді,хімічнийкомпоненти, характеристики та медичне значення всіх типів ТКМ були визначені, що призводить до припущення, що обробка може підвищити ефективність або зменшити токсичні ефекти ТКМ.

Протягом сотень років,Cistanche deserticola(Roucongrong китайською мовою, CD) зазвичай використовується в клінічній практиці ТКМ для доповнення функцій нирок. Це також допомагає у зволоженні кишечника, що призводить до розслаблення кишечника [1].Цистанхевперше було записано в ShenNongBencaoJing. Він зазвичай зустрічається в посушливих і напівзасушливих місцях існування в Євразії та Північній Африці, включаючи Іран, Китай, Індію та Монголію [2]. Обробку CD проводили шляхом обробки парою з рисовим вином під нормальним тиском, що є методом приготування, задокументованим у китайській фармакопеї (китайською Jiucongrong, надалі називається «CD-NP»). А більш ефективним способом приготування є пропарювання КД з рисовим вином під високим тиском (далі — КД-ГП) [3, 4]. У кількох дослідженнях було виявлено, що фармакологічні ефекти CD відрізняються від його перероблених продуктів [5]. Компакт-диск може тонізувати нирковий ян і розслабити кишечник, тоді як після розпарювання рисовим вином ефект поповнення ниркового ян посилиться. У нашому попередньому дослідженні було виявлено, що CD-NP може посилити тонізацію нирок і підтримувати ян, а також полегшити ефект зволоження кишечника та дефекації [6,7,8]. У клінічній практиці перероблені продукти є найбільш часто використовуваною формою.

На сьогодні кілька досліджень проаналізувалихімічнийкомпонентів CD з подальшим виділенням та ідентифікацією понад 100 сполук [9,10,11], таких як фенілетаноїдні глікозиди (PhG), іридоїди, лігнани та олігосахариди як його основні хімічні складові. Також повідомлялося, що існує багато фармакологічної активності PhG, включаючи імуномодулюючу, нейропротекторну, гепатопротекторну, протизапальну, антиоксидантну тощо [12,13,14]. Іридоїди мають протизапальну дію [15, 16]. Більш ранні дослідження також показали, що деякі хімічні компоненти змінювалися під час обробки [17,18,19,20]. Виходячи з цих звітів, можна припустити, що після обробки варіації вхімічнийкомпозиція призводить до різних фармакологічних ефектів, які потребують подальшого вивчення.

У поточному дослідженні для порівняльного аналізу було проведено чутливий та ефективний метод, наприклад рідинну хроматографію надвисокої ефективності в поєднанні з TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE), а також дослідження in vitro для якісного аналізу екстрактів. CD, CD-NP і CD-HP для з’ясування їхніх хімічних профілів. Загалом, екзогенніхімікаліїз високою експозицією в органах-мішенях вважалися ефективними компонентами. Таким чином, у щурів CD та продукти його переробки вводили перорально, відповідно, з подальшою їх характеристикою. Існуюче дослідження вперше показує порівняльне дослідження (як in vitro, так і in vivo) сирого та обробленого CD. Отримані результати розширять наше розуміння ефекту обробки CD, що може бути корисним для подальших досліджень.

цистанче хімічних профілів і метаболіту

Матеріали та методи

Матеріали

Стандартні сполуки аджуголу (180120) і 2'-актилацетозиду (M0601AS) були надані Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Ченду, Китай). Цистанозид F (MUST-17022620), ехінакозид (D1105AS), цистанозид A (M0906AS) і ізоактеозид (M0106AS) були надані компанією Must (Сичуань, Китай); актеозид (O0618AS), салідрозид (J0526AS), каталпол (S0728AS), геніпозид (A0407AS) і геніпозидова кислота (MB6001-S) були придбані у Dalian Meilun Bio.Co., Ltd (Далянь, Китай). 8-епідеоксилоганова кислота (B31123) була отримана від Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, Китай. Метанол і ацетонітрил були класу MS і були отримані від Merck KGaA, Дармштадт, Німеччина. Метанова кислота (CH2O2) якості ВЕРХ була надана Merck KGaA (Дармштадт, Німеччина). Вода, яка використовувалася в існуючому дослідженні, була оброблена за допомогою системи Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, Ma, США). Рисове вино було надано компанією Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Чжецзян, Китай).

Cistanch deserticola був зібраний з Neimenggu wangyediцистанчеCo. Ltd. Зразки ідентифікував професор Яньцзюнь Чжай (фармацевтичний факультет Ляонінського університету ТКМ). Зразки були передані до Ляонінського університету традиційної китайської медицини.

Тварини

Щури-самці Sprague–Dawley (клас SPF) загальною масою тіла 180–220 г були надані компанією Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Ресурсний центр лабораторних тварин провінції Ляонін, номер ліцензії: SCXK-2015–0001). Цих щурів містили в кімнаті для розведення з добре підтримуваною температурою та вологістю, тобто 20–26 градусів, 50–70 відсотків протягом одного тижня. Перед експериментом щурів годували звичайною лабораторною їжею та водою. Тварини голодували протягом ночі, однак перед експериментом їм давали воду ad libitum. Щурів стратили 10-відсотковим анестетиком хлоралгідрату. Інституційний комітет з етики тварин провінційної лікарні китайської медицини Ляонін схвалив усі експериментальні протоколи (2019.3.25, 2019015).

Приготування екстракту CD, CD-NP і CD-HP

CD-NP, CD-HP були оброблені з однієї партії Cistanch deserticola. Щоб приготувати CD-NP, сухі шматки CD (товщиною 5 мм, 100 г) зволожували рисовим вином (30 мл) і пропарювали при 100 градусах протягом 16 годин, після чого висушували при 55 градусах за допомогою сушильної печі. У той час як CD-HP готували шляхом інфільтрації сухих шматків CD (товщиною 5 мм, 100 г) рисовим вином (30 мл) з подальшим пропарюванням при 1,25 атмосферного тиску протягом 4 годин. а потім сушать у сушильній шафі при 55 градусах.

У мірну колбу на 100 мл один грам порошку просівають через сито № 4, потім додають 50 відсотків метанолу (50 мл), потім щільно закривають і перемішують. Цю суміш зважували, а потім півгодини. мацерація. Після мацерації суміш обробляли ультразвуком (потужність 250 Вт, частота 35 кГц) протягом 40 хв, потім охолоджували та знову зважували. Втрату маси заповнювали 50% метанолом, належним чином змішували і давали постояти, потім фільтрували супернатант і потім використовували отриманий фільтрат як тестовий розчин.

MSE аналіз активних компонентів

Приготування стандартних речовин: тубулозид-А (3.02 мг), ехінакозид (3.00 мг), 2'-ацетилактеозид (2,34 мг), актеозид (2,45 мг), ізоактеозид (0,61 мг). мг), цистанозид-F (2,14 мг), салідрозид (3,39 мг), геніпозид (2,84 мг), аджугол (1,58 мг), каталпол (2,39 мг), геніпозидова кислота (2,56 мг) і 8-епідеоксилоганова кислота (2,34 мг) додавали в мірну колбу на 10 мл, додавали постійний об’єм метанолу до масштабу, конфігурували у відповідний еталонний розчин концентрації. Кожен із 100 мкл був налаштований на змішаний розчин порівняння.

Умова аналізу MS: значення маси було скориговано перед експериментом, і використовувався режим негативних іонів. Діапазон мас становив 50–1200 Да, і зразок вводили через проточний інжекційний насос. Швидкість конуса становила 100 л/год, швидкість потоку розчинника була встановлена ​​на 800 л/год. Напруги на капілярі та на конусі фіксувалися на рівні 2500 та 40 В відповідно. Температура джерела іонів і газу-розчинника становила 100 градусів і 400 градусів відповідно, а частота отримання сигналу становила 0,5 С-1.

цистанче хімічних профілів і метаболіту

UPLC-Q-TOF-MSE аналіз екстракту CD

Хроматографічні оцінки проводили в системі Waters ACQUITY I-CLASS UPLC (Waters Corporation, Мілфорд, Массачусетс, США). Включно з колонкою ACQUITY UPLC® BEH C18 (50 × 2,1 мм, 1,7 мкм, Waters). Рухома фаза складалася з води, що містить 0,1 відсотка мурашиної кислоти (A), і ацетонітрилу, що містить 0,1 відсотка мурашиної кислоти (B), умови елюції були такими: від 97 до 85 відсотків A (0–5 хв), від 85 відсотків до 75 відсотків A (5–15 хвилин), від 75 відсотків до 65 відсотків A (15–16 хвилин), від 65 відсотків до 55 відсотків A (16–18 хвилин) . Швидкість потоку становила 0.3 мл/хв, тоді як температура в кімнаті автоматичного пробовідбірника та колонці становила 30 градусів і 8 градусів окремо. Об'єм ін'єкції становив 1,0 мкл.

Мас-спектрометричну оцінку проводили за допомогою Waters XEVO G{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Мілфорд, Массачусетс, США), що містить джерело ESI. Швидкість потоку газоподібного азоту була зафіксована на рівні 800 л·год-1 при температурі 400 градусів, температура джерела була зафіксована на рівні 100 градусів, а конусний газ був встановлений на рівні 50 л на годину-1. Напругу на конусі та капілярі регулювали на 40 та 2000 В відповідно. Енергію зіткнення рампи використовували в діапазоні 20–30 В. Центроїдні дані для всіх зразків були отримані від 50 до 1200 Да з 5-часом сканування 0,5 с протягом часу аналізу 10 хв. . LockSpray TM використовувався для перевірки точності маси. Іон [M–H]– лейциненкефаліну (200 пг·мкл–1 швидкість інфузії 10 мкл/хв) при m/z 554,2615 використовували як масу блокування. Для точного визначення маси, складу іонів-попередників та розрахунку іонів-фрагментів використовували програмне забезпечення MassLynx V4.1 (Waters Co., Мілфорд, США).

Аналіз даних на платформі Masslynx

Крім того, на основі літератури була створена внутрішня бібліотека, що містить назву сполуки, її структуру та молекулярну формулу (у мол.). Усі сполуки занотували у спеціальний шаблон, виготовлений у Excel. Крім того, файли mol (Chemdraw Ultra 8.0, Cambridge soft, США) і файли Excel усіх окремих складових структур також були збережені на локальному ПК. Створений аркуш Excel із важливими даними був безпосередньо імпортований до наукової бібліотеки в UNIFI.

UNIFI 1.8.2, Waters, Манчестер, Великобританія використовувався для оцінки структурних характеристик, зокрема для характерних фрагментів і фрагментації MS. Мінімальна площа піку 500 була встановлена ​​для 2D виявлення піку. Під час виявлення 3D-піків було обрано пікову інтенсивність низької енергії понад 300 інтенсивності піку енергії та пікову інтенсивність підвищеної енергії понад 80 індикаторів. Було встановлено, що похибка маси становить до ± 10 ppm для відомих сполук, а допуск часу утримування встановлено в діапазоні ± 0,1 хв. Ми вибрали негативні аддукти, що містять –H плюс HCOOH. Обробка необроблених даних, отриманих від MS, здійснювалася за допомогою спрощеного програмного забезпечення UNIFI для швидкого визначенняхімічнийкомпоненти, які відповідають стандартам із власно створеною базою даних і внутрішньою бібліотекою традиційної медицини.

Далі, щоб перевіритихімічнийУ структурі кожної цільової сполуки ізомери відрізнялися за характерними моделями фрагментації MS, які були виявлені в повідомлених дослідженнях, і шляхом порівняння часів утримування еталонних стандартів.

Метаболомічний аналіз на основі багатовимірного статистичного аналізу

Перед обробкою необроблених даних були встановлені такі параметри, як маса в діапазоні від 150 до 1200 Da, діапазон часу утримання (від 0 до 20 хв), порогова інтенсивність ( 2000 відліків), толерантність до маси, тобто 5 мДа, тоді як вікно маси та часу утримання становило 0,20 хв і 0,05 Да, відповідно. У подальшому списку бази даних ідентифікатором іонів були пари RT-m/z щодо часу їх елюції. Однакові значення RT і m/z у різних партіях зразків вважалися однією і тією ж сполукою.

Було проведено багатофакторний статистичний аналіз для оцінки ефективних біомаркерів, які значною мірою сприяли варіаціям між різними групами. Під час аналізу використовувався аналіз головних компонентів (PCA), щоб визначити максимальні відмінності та розпізнавання шаблонів для отримання огляду та класифікації. OPLS-DA — це інструмент моделювання, який забезпечує візуалізацію прогнозованого завантаження компонентів OPLS-DA для допомоги в оцінці моделі. Змінна важливість для прогнозу (VIP) використовувалася для оцінки оцінки різних компонентів, а такожметаболітиwith VIP values >1.0 і P-value< 0.05 were="" regarded="" as="" effective="" markers.="" furthermore,="" a="" permutation="" test="" was="" conducted="" for="" providing="" reference="" distributions="" for="" the="" r2/q2="" values="" that="" could="" show="" the="" statistical="">

цистанче хімічних профілів і метаболіту

Досліди на тваринах

Щурів випадковим чином розділили на чотири групи (n = 6 для кожної групи), після чого перорально вводили різні екстракти: (1) Пуста контрольна група: щурам давали фізіологічний розчин (2 мл/100 г); (2) Група CD: щурам давали екстракт CD (2 мл/100 г); (3) Група CD-NP: щурам давали екстракт CD-NP (2 мл/100 г); (4) Група CD-HP: щурам давали екстракт CD-HP (2 мл/100 г). Подальшу класифікацію всіх груп проводили на три підгрупи для плазми, сечі та фекалій відповідно. Через дві години кожному щуру перорально вводили однакову кількість екстрактів.

Після введення зразки крові відбирали через 1.0 год, 2.0 год і 4.0 год у гепаринізовані поліетиленові пробірки на 1,5 мл (з орбітальних вен). , з подальшим центрифугуванням (при 4500 об/хв) усіх зразків протягом 15 хв.

Для зразків сечі та фекалій щурів утримували в метаболічних клітинах, а потім проводили збір зразків сечі та фекалій протягом 24 годин після введення. Центрифугування зразків сечі проводили при 4500 об/хв протягом 15 хв, а зразки калу висушували в тіні, подрібнювали в порошок, потім відбирали 0,2 г і додавали в 0,5 мл фізіологічного розчину. розчину, УЗД протягом 5 хв і центрифугування при 12,000 об/хв протягом 15 хв. Усі біозразки зберігали при температурі -80 градусів до аналізу.

Підготовка біологічних зразків

До зразків плазми, сечі та фекалій додавали 3 об’єми метанолу з наступним перемішуванням протягом 3 хв. Потім проводили центрифугування (при 12,000 об/хв) сумішей протягом 10 хв, потім перенесли супернатант у пробірку EP, а потім висушили азотом при 37°. Крім того, додавали 200 мкл розчину HCN–H2O (50%). Потім вортекс використовували для перемішування (1 хв) з наступним центрифугуванням (при 12,000 об/хв) протягом 5 хв. Супернатант (5 мкл) оброблених зразків вводили в систему UPLC-Q-TOF-MSE.

Умови рідинної хроматографії та мас-спектрометрії

Аналіз дляметаболітитакож було виконано приладом Waters UPLC через інтерфейс ESI. Розділення проводили за допомогою колонки Acquity UPLC HSS T3 (100 мм × 2,1 мм, 1,8 мкм), рухома фаза складала 0.1% мурашиної кислоти (A): Ацетонітрил (B), умова градієнтного елюювання становила 0–3 хв (99,8 % → 98 % A), 3–5 хв (98 % → 95 % A), 5–8 хв (95 % → 90 % A), 8 –12 хвилин (90 відсотків → 85 відсотків A), 12–17 хвилин (85 відсотків → 70 відсотків A), 17–22 хвилини (70 відсотків → 60 відсотків A), 22–23 хвилини (60 відсотків → 58 відсотків A) , 23–25 хвилин (58 відсотків A), 25–32 хвилини (58 відсотків → 45 відсотків A) і 32–37 хвилин (45 відсотків → 35 відсотків A), швидкість потоку 0,4 мл/хв. Температуру для колонки та кімнати для зразків було встановлено на 40 градусів і 8 градусів відповідно. Використовували згадані вище умови мас-спектрометрії.

Стратегія систематичного аналізу метаболітів у біопробах

Для обробки даних використовувалося програмне забезпечення UNIFI (1.8.2). Для ідентифікації ефективних метаболітів використовувалася функція Binary Compare. Оцінені метаболіти не існували в еквівалентному контрольному зразку або існують при низькій інтенсивності іонів. Відносний поріг інтенсивності був встановлений на 3 або 5, іметаболітиякі відповідають підкресленим критеріям, можуть бути оцінені. Поширене і передбачуванеметаболітипотім були визначені EIC. Для пошуку двофазних метаболітів застосовували функцію NLF. Наприклад, у програмному забезпеченні UNIFI параметри можуть бути встановлені на 176,0321 для пошуку можливих кон’югатів глюкуронової кислоти. Після обробки, нейтральні втрати можуть бути встановлені в методі або визначені. MassFragment використовувався для визначення або характеристики виявленогометаболітиСтруктури, функція спектральної інтерпретації UNIFI є основною функцією, яка використовується для аналізу вторинної фрагментації батьківських компонентів. Цю функцію можна використовувати для швидкої перевірки доцільності шляху фрагментації.

цистанче хімічних профілів і метаболіту

Результати

Правило масової фрагментації фенілетаноїдних глікозидів та іридоїдів

Основними є фенілетаноїдні глікозидихімічнийскладові CD. Було взято стандартні розчини ізоактеозиду, цистанозиду F, тубулозиду А, ехінакозиду, актеозиду та 2'-актилактеозиду з подальшим наданням іншого рівня енергій зіткнень (табл. 1), а потім отримано відповідні карти MS2 (рис. 1). .

Рис. 1 Мас-спектрограма та шлях розщеплення фенілетаноїдних глікозидів. А Ізоактеозид; B цистанозидF; C тубулозідА; Д ехінактеозид; E актеозид; F 2'-актилактеозид

Таблиця 1 Енергія зіткнення стандартних речовин

Мас-спектрометричний аналіз показав, що фенілетаноїдні глікозиди мають подібні моделі фрагментації мас-спектру, шляхи розщеплення в режимі негативних іонів в основному включають: (1) Розщеплення складноефірного зв’язку: втрата нейтральної кофеоїльної групи (C9H3O6, 162,03) і нейтральної ацетильної групи (C2H2O). , 42.00); (2) Глікозидне розщеплення: втрата нейтральних залишків рамнози (C6H10O4, 146,05) і нейтрального залишку глюкози (C6H10O5, 162,05). За допомогою мас-спектрометрії з високою роздільною здатністю можна було виділити кофеїл (162,03) і залишок глюкози (162,05).

Були взяті стандартні розчини аджуголу іридоїдів, каталполу, геніпозидової кислоти, геніпозиду та 8-епідеоксилоганової кислоти з подальшим наданням різних енергій зіткнень і отримано відповідні карти MS2 (рис. 2).

Рис. 2 Мас-спектрограма та шлях розщеплення іридоїдних глікозидів. A Аюгол, B каталпол, C геніпозидова кислота, D геніпозид, E 8-епідеоксилоганова кислота

Іридоїдні глікозиди мають подібні моделі фрагментації мас-спектру, шляхи розщеплення в режимі негативних іонів в основному включають (1) глікозидне розщеплення: втрата нейтрального залишку глюкози (C6H10O5, 162,05); (2) Втрата нейтрального CO2 (43,99) і H2O (18,01).

Ідентифікація сполук в екстрактах CD, CD-NP і CD-HP

UPLC-QTOF-MS E аналіз

Проведено оптимізацію хроматографічних умов. Далі, сполуки зЦистанхеHerba оцінювали як у негативних, так і в позитивних іонних режимах з високим і низьким CE. Отримані результати показали, що для цих сполук сумісність негативної моди була вищою порівняно з позитивною. На малюнку 3 показана іонна хроматограма основного піку (BPI) з пронумерованими піками. Інтенсивність кожного виявленого іона в аналізі UPLC-Q-TOF-MSE була нормалізована відносно загальної кількості іонів для створення матриці даних, яка складалася зі значення m/z, нормалізованої площі піку та часу утримання.

Рис. 3 Базовий пік інтенсивності (BPI) зразків. 1.CD, 2. CD-NP, 3. CD-HP

Оцінка компонентів із CD та продуктів його переробки на платформі UNIFI

Загалом було ідентифіковано 97 сполук за допомогою -SEM (n = 6) режиму з CD та його обробленого продукту (таблиця 2), включаючи фенілетаноїдні глікозиди (PhG), іридоїди, лігнани та олігосахариди. Компоненти 95, 91 і 94 були виявлені в CD, CD-NP і CD-HP відповідно. Серед них було визначено 64 фенілетаноїди, 13 — іридоїди та 20 інших видів сполук. Була подібність ухімічнийсклад компакт-диску та його переробленого продукту, однак було виявлено, що кількість компонентів різна для компакт-диску та його переробленого продукту.

Таблиця 2 Оцінка сполук, отриманих з CD та продуктів його переробки за допомогою UPLC-Q-TOF-MSE

Варіації вхімічнийкомпоненти продуктів переробки

Для аналізу багатовимірної матриці даних було використано програмне забезпечення Simca-P 13.0. До PCA всі змінні були середньоцентрованими та шкалою Парето з наступною ідентифікацією потенційних дискримінантних змінних. На діаграмі балів PCA кожна точка показувала окремий зразок. Зразки, які показали схожість у своїххімічнийкомпоненти були розкидані поруч один з одним, тоді як ті, які демонстрували зміни у своїх компонентах, були розділені. Як видно на PCA (рис. 4), група CD-HP була відокремлена від груп CD і CD-NP.

Рис. 4 PCA компакт-диска та різних продуктів його переробки

To distinguish CD from CD-HP and CD-NP, OPLS-DA, permutation test, S-plot, and VIP value were developed. (Figs. 5, 6, 7) The obtained results revealed that many components were key characteristic components of each product. The screening condition was the VIP >1 і П< 0.05. from="" the="" date="" of="" the="" s-plot,="" the="" characteristic="" components="" were="" evaluated,="" which="" were="" commonly="" existing="" in="" the="" three="">

Рис. 5 OPLS-DA/тест на перестановку/S-ділянка/теплова карта, що вказує на інтенсивність потенційних біомаркерів між CD-NP і CD-HP Сполуками 9, 10, 14, 32, 59, 60, 68, 70, 74, 75, 80, 81, 82 і 84 є диференційними компонентами CD-NP, тоді як сполуки 11, 15, 16, 45, 48, 66 і 72 є диференціальними компонентами CD-HP.

Рис. 6 OPLS-DA /тест на перестановку/ S-ділянка/теплові карти, що вказують на інтенсивність ефективних біомаркерів між CD та CD-NP Сполуками 13, 15, 16, 37, 49, 63, 66, 72, 74, 75 та 85 є диференціальними компонентами CD, тоді як сполуки 10, 11, 32, 59, 60, 68, 70, 71, 80, 81 і 82 є диференціальними компонентами CD-NP.

Рис. 7 OPLS-DA/тест на перестановку/S-ділянка/теплові карти, які виявляють інтенсивність ефективних біомаркерів між CD та CD-HP Сполуками 9, 14, 16, 59, 63, 66, 72, 74, 75, 80, 82 , 84, 85 і 94 є диференціальними компонентами CD, а 11, 15, 45, 49, 50, 60 і 71 є диференціальними компонентами CD-HP.

На рис. 8 ми знайшли інтенсивність актеозиду (54), цистанозиду С (74), кампнеозиду II (43), османтузиду (75) і 2'-актилактеозиду (80), що мають 4'-O-кафеоїльну групу в 8-O- -D-глюкопіранозилова частина (див. рис. 9) зменшилася після обробки рисовим вином, тоді як інтенсивність ізоацетозиду (60), ізоцистанозиду (71), ізокампнеозиду I (69) , ізомартинозид (86), що містить 6'-O-кофеоїльну групу (див. рис. 9), збільшився, особливо для групи CD-NP. Хоча тубулозид B (72) має 6'-O-кафеоїльну групу, таку ж, як ізоактеозид, інтенсивність зменшилася через його 2'-актильну групу. Інтенсивність ехінакозиду (38) і цистанозиду B, що мають 6'-O- -D-глюкопіранозильні групи фрагментів, зросла, але інтенсивність тубулозиду A (55) також зменшилася через його 2'-актильну групу.

Рис. 8. Інтенсивність переважно PhGs у CD та продуктах його переробки

Рис. 9хімічнийСтруктури головним чином PhG в CD та продуктах його переробки.

Наша дослідницька група також вивчила термічну стабільність актеозиду та ізоактеозиду та виявила, що актеозид нестабільний у воді, метанолі та розчині жовтого рисового вина та може частково перетворюватися на ізоактеозид під час нагрівання. Але термостабільність ізоактеозиду була кращою, особливо в розчині жовтого рисового вина. На рисунку 10 показані можливі зміни ФГ в КД під час обробки:

Рис. 10 Можлива реакція на PhG під час обробки

Ідентифікація метаболітів у щурів

За даними мас-спектрометрії з високою роздільною здатністю точна молекулярна маса та елементний склад дляметаболітиі протомолекулярні сполуки були проаналізовані та порівняні. Оскільки ті самі види сполук у TCM показали подібність у метаболічних модифікаціях, кореляції фітохімічних компонентів in vitro можуть поширюватися на їхні метаболіти in vivo. Тим часом, на основі звичайних шляхів біотрансформації було зроблено висновок про розумну зміну молекулярної маси. Нарешті,метаболітибули ідентифіковані шляхом аналізу MSE мас-спектрів метаболітів і шляху фрагментації протосполук у мас-спектрі [21, 22]. Порівняно з холостим зразком його компоненти ідентифікували in vivo на основі інформації, наданої хромато-мас-спектром, можливістю метаболічної реакції, характеристиками структури сполуки та правилом фрагментації її мас-спектру. Дивіться таблицю 3.

Таблиця 3 ВиявленоМетаболітиу плазмі, сечі та калі водного екстракту в CD та продуктах його переробки

Ідентифікація метаболітів, пов'язаних з глікозидами фенілетанолу

Для обробки використовувалася платформа UNIFI. На малюнку 11 показано ТІХ-хроматографію сечі, калу та плазми для CD та продуктів його переробки. Порівняно з порожніми зразками, у щурів було ідентифіковано загалом 54 метаболіти, включаючи 10 прототипних компонентів і 44метаболіти, у яких 24, 49 та 6 відповідно у калі, сечі та плазмі.

Рис. 11 Хроматограф TIC. A Зразок сечі в групі БК; B Зразок сечі в групі CD; C Зразок сечі в групі CD-NP; D Зразок сечі в групі CD-HP; E Зразок калу в групі БК; F Зразок калу в групі CD; G Зразок калу в групі CD-NP; H Зразок калу в групі CD-HP; I Зразок плазми в групі БК; J Зразок плазми в групі CD; K Зразок плазми в групі CD-NP; M Зразок плазми в групі CD-HP

На основі точної маси, каскаду фрагментації та передбачуваних нейтральних втрат шляхом біотрансформації, загалом 35 фенілетаноїдних глікозидів пов’язаніметаболітибули попередньо оцінені. Споріднені метаболіти фенілетаноїдних глікозидів мають подібні моделі фрагментації мас-спектру, як типовий декафеоїльний фрагмент m/z 461,1605, який потім додатково гідролізується глікозидними та складноефірними зв’язками in vivo та метаболізується в гідрокситирозол (HT) (m/ z 153,0504, C8H10O3, 4,73 хв) і кавової кислоти (CA) (m/z 179,0389, C9H7O4, 0,77 хв), див. рис. 12A.

M11 вказує [M–H]− при m/z 153,0504 із формулою, тобто C8H10O3, і ідентифікується як HT. M16 показав [M–H]− при m/z 329,0851, що було на 176 Да вище, ніж у HT, показуючи, що це може бути глюкуронідований метаболіт HT. [M–H]- M26 становив m/z 343,1037, що на 14 Да вище, ніж у HT-глюкуроніду. Таким чином, M26 був ідентифікований як HT-метильований глюкуронід. M17 було ідентифіковано як HT-сульфат на основі його [M–H]− при m/z 233,0112, 80 Da над HT, який міг бути додатково метильований, а потім утворив M22, який показав m/z 247,0278, що вказує на те, що це НТ-метильований сульфатованийметаболіт. M7 (m/z 167,0335) і M5 (m/z 167,0762) розглядалися як продукти окислення і метильований HT відповідно (рис. 12B).

M1 вказував [M–H]− при m/z 179,0389, з’ясована молекулярна формула була C9H7O4 і ідентифікована як кавова кислота (CA). M25 виявив [M–H]− при m/z 355,0704, які були на 176 Да підвищені, ніж у CA, показує, що це може бути глюкуронідованийметаболітCA. M27 мав m/z 258,994, що було на 80 Да вище, ніж у CA, тому ми з’ясували його як сульфат CA, і він міг утворювати M35 (m/z 273,0064). Оскільки M4 дає [M–H]− при m/z 193,0524, що на 14 Да вище, ніж CA, його ідентифікували як метаболіт CA. M39 був дегідроксилюванням САметаболіт, з m/z 163,04, і його можна було сульфатувати до M32 (m/z 242,9951).

M33 (m/z 181.0491, C9H10O4, 9,06 хв) був продуктом відновлення CA, тобто 3,4-дигідроксибензолпропіонової кислоти, яка могла бути метильована в M19 (m/z 195,0623, C10H12O4, 0,93 хв). M33 може бути дегідроксильовано до M43, тобто 3-HPP (m/z 165,0558, C9H10O3, 11,29 хв), і M31 (m/z 341,0942, C15H17O9, 8,90 хв) і M29 (m/z 245,0125, C9H10O6S, 8,52 хв) були глюкуронованими та сульфатованими продуктами (рис. 12C).

Для фенілетаноїдних глікозидівметаболіти, ключовими метаболічними каскадами були метаболічні реакції II фази, тобто глюкуронізація, метилювання та сульфатування. Пропоновані метаболічні каскади фенілетаноїдів зображені на рис. 13.

Рис. 12 Мас-спектр деякихметаболітина компакт-дисках

Рис. 13 Можливий метаболічний шлях фенілетаноїдів

Ідентифікація пов'язаних з іридоїдами метаболітів

Аналізуючи елементний склад вметаболіти, фрагментації MSE та пов’язаної літератури, було попередньо оцінено загалом 19 іридоїд-асоційованих метаболітів. Іридоїдні глікозиди були гідролізовані глікозидними зв'язками з утворенням відповідних їм агліконів. Значення m/z 185,117 було для M8 на 162 Да менше, ніж для аджуголу, отриманого внаслідок втрати залишку глюкози.

M40 (m/z 199,0641, Rt 10,91 хв) був деглікозильованим продуктом каталполу. M45 m/z 169,0487, Rt 12,15 хв) було менше 30 Да, ніж у деглікозильованого каталполуметаболіт, і було ідентифіковано як видалення молекули метаболіту CH2O. M34 (m/z 151,0352, Rt 9,08 хв), була подальша втрата H2Oметаболіт.

M44 (m/z 211,0665, Rt 11,31 хв) був деглікозильованим метаболітом геніпозиду, а M37 (m/z 197,0833, Rt 15,03 хв) був деглікозильованим 8-епідеоксилогановою кислотою. Метаболічні реакції для іридоїдів можуть бути виявлені як фаза I метаболізму деглікозилювання (рис. 12D).

Порівняння метаболічного профілю в плазмі, сечі та калі між CD та продуктами його переробки

Порівнювали 2 прототипи в плазмі, 7 в сечі і 3 в калі. Було 7 прототипів, поглинених у CD, 7 прототипів, поглинених у CD-NP, і 8 прототипів у CD-HP. M21 був виявлений лише в калі групи CD-NP, а M38 і M51 були виявлені лише в сечі груп CD-HP. У порівнянні з метаболітами ідентичніметаболітиу плазмі, сечі та калі були 4, 42 та 21 відповідно. Було абсорбовано 34 метаболіти в групі CD, 39 у CD-NP і 40 у групі CD-HP. M5, M7, M40 і M52 були виявлені лише в групах CD-NP, тоді як M24, M41 і M48 були виявлені лише в групах CD-HP.

Спостерігалися варіації в поглинанні, а також метаболізмі активних сполук у різноманітних продуктах переробки CD. На рис. 14 ми виявили, що інтенсивність HT-сульфатної кон’югації (M17) була найвищою в сечі, за якою йдуть 3-HPP сульфатна кон’югація (M29), метильована HT сульфатна кон’югація (M22), дегідроксильована CA сульфат кон'югація (M32) і кон'югація сульфату 3,4-дигідроксибензолпропіонової кислоти (M19). Вміст продуктів метаболізму в обробленій групі був вищим, ніж у групі CD, особливо для М22, М29, М27, М16, М19, М1, М2. Сполуки-попередники, такі як гідрокситирозол, мають протипухлинні, протизапальні, антибактеріальні, противірусні та протигрибкові властивості [23]. Кофеїнова кислота має протизапальну, протиракову та противірусну дію [24]. Це відповідало клінічному використанню CD та продуктів його переробки.

Обговорення

CD є TCM, і його основні біоактивні компоненти, включаючи PhG, іридоїди, полісахариди, були задокументовані різними дослідженнями. У клінічній практиці ТКМ оброблені продукти CD широко використовуються порівняно з сирими. Theхімічнийсклад буде змінено під час обробки, що може призвести до зміни лікувальних ефектів (рис. 14).

Рис. 14 Інтенсивність основногометаболітив сечі

PhG - це тип фенольних сполук, що характеризується структурою -глюкопіранозиду, що містить гідроксифенілетильний фрагмент як аглікон. Ці сполуки часто включають кавову кислоту та рамнозу, приєднані до залишку глюкози через складноефірні чи глікозидні зв’язки відповідно. У поточному дослідженні було проведено якісний аналіз CD, CD-NP і CD-HP, і було ідентифіковано загалом 97 сполук, включаючи фенілетаноїдні глікозиди (PhG), іридоїди тощо. Отримані результати показали варіації вхімічнийсклад до і після обробки. Інтенсивність ФГ з 4'-О-кофеоїльною групою в 8-O- -D-глюкопіранозильній частині, таких як актеозид, цистанозид С, кампнеозид II, османтузид, зменшилася після обробки, тоді як ФГ з 6 '-O-кофеоїльна група в 8-O- -D-глюкопіранозильній частині, така як ізоацетозид, ізоцистанозид, ізокампнеозид I, ізомартинозид, збільшилася, особливо в групі CD-NP. Також зросла інтенсивність ехінакозиду та цистанозиду B, структура яких містить 6'-O- -D-глюкопіранозильний фрагмент. PhG, які мають 2'-актильну групу, часто знижуються через реакцію гідрозису під час процесу, як тубулозид B, 2-ацетилактеозид.

Розслідуванняметаболітиабсорбцію in vivo проводили після перорального введення CD та продуктів його переробки. Метаболічні процеси фази II були ключовими каскадами, і більшість метаболітів були сульфатними, глюкуронідними та метильованими кон’югатами. Фенілетанолглікозиди мають низьку абсорбцію та використання при пероральному прийомі. Вони важко всмоктуються в кров і діють як попередники, які відіграють свою роль після метаболічної активації in vivo. Фенілетаноїди, що утворюються у фенілетанолаглікон, як-от гідрокситирозин (HT) і кавова кислота (CA) і її похідна 3-гідроксифенілпропіонова кислота (3-HPP), ці метаболіти можуть легше всмоктуватися в плазмі та мати кращу лікувальну дію ефект.

Більшість зметаболітибули виявлені в нижчих концентраціях або не були виявлені в плазмі крові щурів, однак вищі концентрації спостерігалися в сечі, що вказує на те, що метаболіти легко виводяться із сечею. Як показано в таблиці 3, ті самі сполуки були визначені в різних групах, тоді як значні варіації були виявлені в концентраціяхметаболітищо може бути пов’язано з нерівною ефективністю CD та продуктів його переробки. HT-сульфатна кон’югація (M17) має найвищу інтенсивність у сечі, потім 3-HPP сульфатна кон’югація (M29), метильована HT сульфатна кон’югація (M22), дегідроксильована CA сульфатна кон’югація (M32) і 3,{{ 7}}дигідроксибензолпропіонова кислота сульфатна кон’югація (M19). Вміст продуктів метаболізму в обробленій групі був вищим, ніж у групі CD, особливо для М22, М29, М27, М16, М19, М1, М2.

Як правило, ефективними можуть бути компоненти, що мають високу експозицію в органах-мішенях. Достатню кількість фенілетаноїдів та їх похідних було оцінено та визначено in vitro. Характерними сполуками є актеозид, вміст якого після обробки рисовим вином зменшився, а вміст ізоактеозиду, ізоцистанозиду С, ізокампнеозиду І відповідно збільшився. Продукти розпаду PhG, такі як похідні CA і HT, можна оцінити в біо-зразках, а обробка рисового вина може підвищити поглинанняметаболітив природних умовах.

Висновок

У цьому дослідженні було виявлено 97 сполук в екстрактах CD та продуктах його переробки. Деградація деяких глікозидів відбувалася при підвищеній температурі, в результаті чого були синтезовані нові ізомери та комплекси. У дослідженні in vivo прототип компонентів (10) іметаболіти(44) визначали або попередньо оцінювали в плазмі, калі та сечі щурів. Фаза II метаболічних процесів була ключовим каскадом, більшість з нихметаболітибули пов’язані з ехінакозидом або актеозидом, як-от HT, CA та їхні похідні 3-гідроксифенілпропіонова кислота 3-HPP. Ці метаболіти можуть легше всмоктуватися в плазму і мати кращий лікувальний ефект. Отримані результати показали, щохімічнийсклад CD був різним і впливав на диспозицію сполуки in vitro та in vivo.

Наявність даних і матеріалів

Набори даних, використані та/або проаналізовані під час поточного дослідження, доступні у відповідного автора за розумним запитом.

Скорочення

PhGs: фенілетаноїдні глікозиди

CD:Cistanche deserticola

CMM: китайська Materia Medica

TCM: Традиційна китайська медицина

CD-NP:Cistanche deserticolaОброблено пропарюванням з рисовим вином під нормальним тиском

CD-HP:Cistanche deserticolaОбробляється пропарюванням з рисовим вином під високим тиском

UPLC-Q-TOF-MSE: Рідинна хроматографія надвисокої ефективності в поєднанні з TOF-MSE

PCA: аналіз основних компонентів

VIP: змінна важливість для проекції

CA: кавова кислота

HA: гідрокситирозол

Дослідження цистанх хімічних профілів і метаболіту

Список літератури

1. Китайська фармакопейна комісія. Фармакопея Китайської Народної Республіки, вип. I. Пекін: China Medical Science Press; 2020. стор. 140.

2. Лі З, Лінь Х, Гу Л, Гао Дж, Цзен Ч.М. HerbaЦистанхе(Rou Cong-Rong): один із найкращих фармацевтичних подарунків традиційної китайської медицини. Фронт Фармакол. 2016; 7: 41.

3. Лю Б.Н., Ши Дж., Чжан Ч., Лі З., Хуа І., Лю П.П., Цзя Т.З. Вплив різних методів сушіння для FreshCistanche deserticolaна його складовий вміст. J Chin Med Mater. 2020; 10: 2414–8.

4. Liu BN, Shi J, Jia TZ, Lv TT, Li Z. Оптимізація процесу пропарювання під високим тиском для Cistanches Herba. Chin Trad Patent Med. 2019; 11: 2576-80.

5. Фан YN, Huang YQ, Jia TZ, Wang J, La-Sika, Shi J. ЕфектиЦистанчіherba до та після обробки на функцію запобігання старінню та імунну функцію щурів, індукованих D-галактозою. Chin Arch Trad Chin Med, 2017; 11: 2882-2885.

6. Гао YJ, Jiang Y, Dai F, Han ZL, Liu HY, Bao Z, Zhang TM, Tu PF. Дослідження проносних компонентів Cistanche deserticola YC Ma. Modern Chin Med. 2015;17(4):307–10.

7. Liu BN, Shi J, Li Z, Zhang C, Liu P, Yao W, Jia T. Дослідження нейроендокринної імунної функціїCistanche deserticolaі його продукти для приготування рисового вина на моделі щурів, індукованих глюкокортикоїдами. Evid Based Complement Alternat Med. 2020; 22: 5321976.

8. Guo Y, Wang L, Li Q, Zhao C, He P, Ma X. Посилення функції нирок, що оживляє, у моделі миші за допомогою Cistanches herba, швидко висушеного при середньо-високій температурі. J Med Food. 2019; 22 (12): 1246–53.

9. Ван Т, Чжан Ікс, Се В.Cistanche deserticolaYC Ma, «Женьшень пустелі»: рецензія. Am J Chin Med. 2012;40(6):1123–41.

10. Fu Z, Fan X, Wang X, Gao X. Cistanches Herba: Огляд його хімії, фармакології та фармакокінетики. J Етнофармакол. 2018; 219: 233-47.

11. Lei H, Wang X, Zhang Y, Cheng T, Mi R, Xu X, Zu X, Zhang W. HerbaЦистанхе(Rou Cong Rong): огляд його фітохімії та фармакології. Chem Pharm Bull. 2020;68(8):694–712.

12. Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Нейропротекторні ефекти ехінакозиду в мишачій MPTP моделі хвороби Паркінсона. Eur J Pharmacol. 2007;564:66-74.

13. Deng M, Zhao JY, Ju XD, Tu PF, Jiang Y, Li ZB. Захисний ефект тубулозиду В на альфа-індукований TNF апоптоз у нейрональних клітинах. Acta Pharmacol Sin. 2004; 25 (10): 1276–84.

14. Нань З.Д., Чжао М.Б., Зен К.В., Тянь Ш., Ван В.Н., Цзян Ю., Ту П.Ф. Протизапальні іридоїди із стебелCistanche deserticolaкультивується в пустелі Тарім. Chin J Nat Med. 2016;14(1):61–5.

15. Нан З.Д., Зен К.В., Ши С.П., Чжао М.Б., Цзян Ю., Ту П.Ф. Фенілетаноїдні глікозиди з протизапальною дією зі стебел Cistanche deserticola, культивованих у пустелі Тарім. Фітотерапія. 2013;89:167–74.

16. Морікава Т, Пан І, Ніномія К, Імура К, Юань Д, Йосікава М, Хаякава Т, Мураока О. Іридоїдні та ациклічні монотерпенові глікозиди, канканозиди L, M, N, O та P відЦистанхеtubulosa. Chem Pharm Bull. 2010;58(10):1403–7.

17. Li SL, Song JZ, Qiao CF та ін. Нова стратегія для швидкого вивчення потенціалухімічниймаркери для розрізнення сирих і оброблених Radix Rehmanniae за допомогою UHPLC-TOF-MS з багатофакторним статистичним аналізом. J Pharm Biomed Anal. 2010;51(4):812–23.

18. Peng F, Chen J, Wang X, Xu CQ, Liu TN, Xu R. Зміни рівнів фенілетаноїдних глікозидів, антиоксидантної активності та інших ознак якості вCistanche deserticolaскибочки обробкою парою. Chem Pharm Bull. 2016;64:1024-30.

19. Ma ZG, Tan YX. Зміни вмісту шести фенілетаноїдних глікозидів під час варіння на пару з вином у Desertliving Cistanche. Chin Trad Patent Med. 2011;33(11):1951–4.

20. Peng F, Xu R, Wang X, Xu C, Liu T, Chen J. Вплив процесу пропарювання на якість післязбирального матеріалуцистанка пустирськадля використання в медицині під час сушіння на сонці. Біол Фарм Бюл. 2016;39(12):2066–70.

21. Цуй Q, Пан І, Чжан В, Чжан І, Рен С, Ван Д, Ван З, Лю Х, Сяо В.Метаболітидієтичного актеозиду: профілі, виділення, ідентифікація та гепатопротекторна здатність. J Agric Food Chem. 2018;66(11):2660–8.

22. Cui Q, Pan Y, Bai X, Zhang W, Chen L, Liu X. Систематична характеристикаметаболітиехінакозиду та актеозиду зЦистанхеtubulosa в плазмі, жовчі, сечі та фекаліях щурів на основі UPLC-ESI-Q-TOF-MS. Біомед Хроматогр. 2016;30(9):1406–15.

23. Бертеллі М, Кіані А.К., Паолаччі С., Манара Е., Курті Д., Дулі К., Бушаті В., Міертус Дж., Пангалло Д., Багліво М., Беккарі Т., Мікеліні С. Гідрокситирозол: природна сполука з перспективною фармакологічною діяльністю. J Біотехнологія. 2020;309:29-33.

24. Touaibia M, Jean-François J, Doiron J. Caffeic Acid, універсальний фармакофор: огляд. Mini Rev Med Chem. 2011;11(8):695–713.