Полісахариди Cistanche Deserticola полегшують зниження когнітивних здібностей у модельних мишей старіння, відновлюючи вісь кишкової мікробіоти та мозку

Контакт: ali.ma@wecistanche.com

Yuan Gao1,*, Bing Li1,*, Hong Liu1, Yajuan Tian2, Chao Gu1, Xiaoli Du1, Ren Bu1, Jie Gao1, Yang Liu1, Gang Li1

АНОТАЦІЯ

Останні дані свідчать про те, що зміни в системі кишкова мікробіота-мозок можуть викликати когнітивні порушення.старіння. У цьому дослідженні ми спостерігали, що тривале введення D-галактози мишам викликало зниження когнітивних функцій, кишковий мікробний дисбактеріоз, периферичне запалення та окислювальний стрес. У цій моделі вікового когнітивного зниження,Полісахариди Cistanche deserticola(CDPS) покращив когнітивні функції у мишей, які отримували D-галактозу, відновивши кишковий мікробний гомеостаз, тим самим зменшивши окислювальний стрес і периферичне запалення. Сприятливі ефекти CDPS у цих модельних мишей старіння були скасовані через абляцію кишкової мікробіоти антибіотиками або імуносупресію циклофосфамідом. Метаболомічний профіль сироватки крові показав, що рівні креатиніну, валіну, L-метіоніну, о-толуїдину, N-етиланіліну, сечової кислоти та проліну були змінені встаріннямоделі мишей, але були відновлені CDPS. Ці знахідки продемонстрували цеCDPSпокращує когнітивні функції в індукованих D-галактозоюстаріннямоделі на мишах, відновлюючи гомеостаз осі кишкової мікробіоти головного мозку, що полегшувало амінокислотний дисбаланс, периферичне запалення та окислювальний стрес.CDPSтаким чином демонструє терапевтичний потенціал для пацієнтів із розладами пам’яті та навчання, особливо пов’язаними з кишковим мікробним дисбактеріозом.

Клацніть, щоб побічний ефект Cistanche проти старіння

ВСТУП

Тривале введення D-галактози (D-gal) і солей берилію індукує старіння на експериментальних моделях тварин і первинних клітинних культурах in vitro і використовується для ідентифікації механізмів, що лежать в основі природного процесу старіння [1–4]. Попередні дослідження показують, що зниження когнітивних функцій у D-галактозистаріннямодельних мишей пов’язана зі зниженим рівнем білка фактора росту нервів (NGF) і підвищенням активних форм кисню (АФК) у мозку, обидва з яких викликають дегенерацію нейронів гіпокампа та знижують нейрогенез [3, 4]. Недавні дослідження також показали, що склад і кількість кишкової мікробіоти людини значно змінюються під часстарінняпроцес [5].

Цистанхеdeserticola - це трава, яка росте в основному в північно-західному пустельному регіоні Китаю і використовується в традиційній китайській медицині. Він широко відомий як «женьшень пустелі». Екстракти Cistanche deserticola містять кілька фармакологічно активних сполук, включаючи фенілетаноїдні глікозиди, іридоїди, лігнозу, олігосахариди, полісахариди та амінокислоти; ці сполуки пов’язані з протизапальними, антиоксидантними, антистаріючими, нейропротекторними та імуномодулюючими властивостями [6, 7]. Наприклад, полісахариди, витягнуті з Cistanche deserticola, використовувалися в традиційній китайській медицині для лікування колоректального раку [8]. З кількох організмів було виділено широкий спектр слаботоксичних полісахаридів із корисною біоактивністю, таких як полісахарид Chuanqiong, полісахарид Ganoderma lucidum і полісахарид Lycium barbarum [9–11]. CDA 0.05 є галактоглюканом, виділеним зЦистанхеdeserticola, яка сприяє росту кількох корисних кишкових бактерій, включаючи кілька видів Bacteroides і Lactobacillus [12].

Основні механізми нормстарінняЦей процес також причетний до кількох захворювань людини, таких як нейродегенеративні розлади, коронарний атеросклероз, діабет 2 типу (ЦД 2 типу) та гіпертонія [13, 14]. Останні дослідження показали, що зміни в кишковій флорі відіграють значну роль у старінні людини [15]. Кілька досліджень показали, що тривале введення D-галактози піддослідним мишам і щурам імітує нормальний процес старіння і є корисною моделлю для вивченнястаріння-пов'язані фенотипи, такі як зниження когнітивних функцій [16]. Крім того, D-галактоза-індукована модель старіння мишей демонструє зміни в складі кишкової мікробіоти [17]. Таким чином, ми припустили, що зміни в складі кишкової мікробіоти можуть спричинити зниження когнітивних функцій у мишей моделі старіння, індукованого D-галактозою, і дослідили, чиПолісахариди Cistanche deserticola(CDPS) може полегшити зниження когнітивних функцій, відновлюючи дисбактеріоз кишкової мікробіоти.

РЕЗУЛЬТАТИ

D-галактоза-індукована модель старіння мишей демонструє зниження когнітивних функцій і кишковий мікробний дисбактеріоз

Ми проаналізували поведінкові показники мишей дикого типу (WT) і мишей, які отримували 150 мг D-gal на кг маси тіла протягом 2 місяців (модель або мод) за допомогою тестів розпізнавання нових об’єктів і водного лабіринту Морріса (MWM). Переважні значення індексу в новому тесті розпізнавання об’єктів були значно знижені у мишей групи Mod порівняно з мишами групи WT (рис. 1A, 1B). Результати тесту MWM показали, що час затримки виходу після шостого дня був значно збільшений у групі Mod порівняно з групою WT (рис. 1C, 1D). Більше того, перетин цільової платформи та час плавання в цільовому квадранті були значно скорочені в групі Mod порівняно з групою WT (рис. 1E, 1F). Ці результати продемонстрували значне зниження здатності до навчання та пам'яті D gal-індукованогостаріннямоделі мишей.

Потім ми проаналізували відмінності в кількості та складі типів, родів і видів кишкових мікробів у зразках фекалій груп Mod і WT мишей, використовуючи дані секвенування 16S рибосомальної РНК (рРНК) зі зразків фекалій. Переважаючою кишковою флорою у мишей груп WT і Mod були Firmicutes і Bacteroides. Однак кількість Bacteroides була значно зменшена, а кількість Firmicutes значно зросла в групі Mod порівняно з групою WT (рис. 2A). Далі ми виконали лінійний дискримінантний аналіз (LDA), щоб визначити розмір ефекту LDA (LEfSe), а потім тести Краскела-Уолліса та Вілкоксона, щоб оцінити відносну кількість різних таксонів у мишей групи WT та Mod. Результати LDA показані на малюнку 2B. Крім того, ми побудували кладограми, що показують диференційоване збагачення різних родів і видів, що належать до типів Bacteriodes і Firmicutes у WT і модельних групах (рис. 2C). Загалом наші результати продемонстрували порушення когнітивних здібностей і кишковий мікробний дисбактеріоз у модельних мишей старіння, індукованого D-галактозою.

Лікування CDPS покращує когнітивні здібності у модельних мишей старіння, індукованого D-gal

Ми проаналізували якщоCDPSлікування полегшує зниження когнітивних функцій при D-gal-індукованихстаріннямоделі мишей. Протягом 2 місяців прийому вимірювання маси тіла проводили через день. Маса тіла модельної та CDPS груп мишей була подібною (рис. 3А). Проведіть поведінкові експерименти після останньої дози. Розпізнавання нових об’єктів і результати тесту водного лабіринту Морріса показали, що короткочасна пам’ять була значно вищою в групах CDPS мишей порівняно з модельною групою мишей; довготривала пам'ять у групі мишей CDPS була вищою, але статистично незначущою порівняно з модельною групою мишей (рис. 3B, 3C). Це свідчить про те, що лікування CDPS скасовувало втрату короткочасної пам'яті розпізнавання об'єктів у мишей, які отримували D-gal.

Просторове навчання та пам'ять цих мишей оцінювали за допомогою тесту водяного лабіринту Морріса, і результати показали, що час затримки втечіCDPSмишей групи мишей можна порівняти з групою мишей WT і значно нижчими, ніж миші групи Mod (Рис. 3D). Крім того, час затримки виходу був значно нижчим на шостий день після введення CDPS порівняно з модельною групою (рис. 3E). Час плавання в цільовому квадранті був значно вищим у групах CH і CM порівняно з модельною групою. Група CL вища за групу моделі, але не має статистичної значущості (рис. 3F). Крім того, кількість перетинів платформи була значно вищою в групах CM і CL порівняно з групою моделі. Однак група CH вища за модельну групу і не має статистичної значущості (рис. 3G). Ці результати продемонстрували, що лікування CDPS покращило просторове навчання та пам’ять у модельних мишей старіння, викликаних D-gal.

Лікування CDPS відновлює гомеостаз складу мікробіоти кишечника у мишей моделі старіння D-галактози

Моносахариди та полісахариди є основними поживними речовинами, необхідними для росту бактерій [18–21]. Також повідомляється, щоCDPSрегулює склад кишкової мікробіоти [22]. Таким чином, ми проаналізували, чи лікування CDPS полегшує кишковий мікробний дисбактеріоз у модельної групи мишей, оцінюючи дані секвенування 16S рРНК зразків фекалій від WT, модельної та CDPS груп мишей.

По-перше, ми розрахували індекси альфа-різноманіття, щоб оцінити загальне багатство фекальної мікробіоти та структурну різницю між цими групами. Ми проаналізували індекси альфа-різноманітності (-різноманітності), такі як спостережувані види, значення індексу Шеннона, Чао 1, ACE та Сімпсона, щоб визначити зміни в складі різних видів бактерій у зразках фекалій різних груп мишей. Індекси різноманіття (спостережувані види, індекси Шеннона, Чао 1, ACE та Сімпсона) були вищими у WT таCDPSгрупи мишей порівняно з модельною групою, але статистична значущість спостерігалася лише для значень індексу Chao 1 між групою CM і групою Mod. Це показало, що введення CDPS збільшує багатство мікробіома (рис. 4A–4E). Далі ми проаналізували індекси різноманіття, щоб визначити відмінності у видах кишкових мікробів між WT, модельними та CDPS групами мишей за допомогою неметричного багатовимірного шкалювання (NMDS), аналізу головних координат (PCoA) та аналізу основних компонентів (PCA). . PCA показав варіації в мікробному складі кишечника модельної групи мишей під часстарінняпроцесу, включаючи зменшення розмірів і підтримку шаблонів і тенденцій (рис. 4F). Відмінності у фекальній мікробіоті між групами WT, моделі та CDPS були визначені на основі PCoA незважених відстаней UniFrac для генів 16S рРНК (рис. 4G). Аналіз кластеризації показав значні відмінності в NMDS між модельною групою та групами WT і CDPS (рис. 4H).

Ми оцінили 10 найкращих типів кишкової мікробіоти та виявили, що кількість типів Bacteroides була значно вищою в групі CH, CM та CL порівняно з групою моделі (рис. 4I). Це свідчить про те, що CDPS відновлює гомеостаз кишкової мікробіоти у мишей, які отримували D-gal. Кладограми показали диференціальне збагачення різних родів і видів, що належать до типів Bacteriodes і Firmicutes у WT, моделі та групах CDPS (рис. 4J). Як показано на теплових картах,CDPSлікування зменшило відносну чисельність Thermoplasmata, Bacilli, неідентифікованих Actinobacteria, Fusobacteriia та неідентифікованих Elusimicrobia та збільшило відносну чисельність Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, неідентифікованих_Deferribacteres, Mollicutes, Nitrososphaeria, Anaeroline, Erysipelotrichia та неідентифікованих{{1} }Ціанобактерії порівняно з модельною групою (Рис. 4K). Ці результати продемонстрували, що лікування CDPS значно відновило гомеостаз кишкової мікробіоти у модельних мишей, індукованих D-gal.

Лікування CDPS полегшує нейродегенерацію у модельних мишей, викликаних D-gal, шляхом зменшення окисного стресу

Далі ми проаналізували вплив CDPS на запалення шляхом аналізу сироваткових рівнів прозапальних цитокінів (IL-2 і TNF-) і протизапальних цитокінів (IL-4 і IL-10 ) у різних групах мишей. Сироваткові рівні IL-2 та TNF- були значно нижчими, а сироваткові рівні IL-4 та IL-10 були значно вищими в групі CH, CM та CL порівняно з модельною групою . Це показало, щоCDPSмає протизапальну дію (рис. 5A–5D).

Окислювальний стрес спричинений підвищеним виробництвом активних форм кисню (АФК) і є одним із основних факторів, що сприяютьстаріння[23]. Таким чином, ми проаналізували вплив CDPS на окислювальний стрес на моделі старіння миші, спричиненого D-gal, шляхом оцінки сироваткових рівнів антиоксидантного ферменту, SOD, і продукту перекисного окислення ліпідів, малонового діальдегіду (MDA). Сироваткові рівні MDA були значно вищими, а сироваткові рівні SOD були значно знижені в групі Mod порівняно з групою WT, але,CDPSлікування скасувало ці ефекти (рис. 5E, 5F). Ці результати продемонстрували, що окислювальний стрес був підвищений у модельних мишей старіння, індукованого D-gal, але був знижений лікуванням CDPS.

Крім того, ми оцінили рівні окисного стресу в тканинах мозку, проаналізувавши рівні продукту вдосконаленого окисленого білка (AOPP), прямого перекисного окислення ліпідів (LPO) і MDA, а також активності антиоксидантних ферментів, таких як глутатіонпероксидаза (GSH-Px). ) і супероксиддисмутази (СОД) в гомогенатах тканини мозку. Мозок мишей групи Mod продемонстрував значно знижену активність SOD і GSH-PX і значно підвищені рівні AOPP, LPO і MDA порівняно з групою WT, але ці ефекти були зворотними в групі CH, CM і CL (рис. 6A-6E). ).

Крім того, ми провели гістологічне фарбування зрізів мозку фарбами H&E та Nissl для оцінки захисних ефектівCDPSна мозок індукованого D-galстаріннямоделі мишей. Миші групи Mod продемонстрували значне зменшення кількості та об’єму нейронів, збільшення проміжку між нейронами, неправильне розташування нейронів і ядерний пікноз в області CA1 гіпокампу порівняно з групою WT, але ці патологічні зміни були значно зменшені при лікуванні CDPS ( малюнок 6F). Ці результати продемонстрували, що лікування CDPS значно зменшило окислювальний стрес і патологію головного мозку у модельних мишей, індукованих D gal.

Лікування CDPS зменшує периферичне запалення та окислювальний стрес, підтримуючи кишковий мікробний гомеостаз у модельних мишей, індукованих D-gal

Далі ми проаналізували, чи пов’язані зміни в складі кишкової мікробіоти зі збільшенням периферичного запалення та окисного стресу під час старіння. Для цього ми використовували потрійний антибіотичний коктейль (група ABX) або циклофосфамід (група Cy; також див. Матеріали та методи) для видалення кишкової мікробіоти або індукування імуносупресії в пацієнтів, які отримували CDPS.старіннямоделі мишей. Лікування антибіотиками скасовувало сприятливий ефект лікування CDPS у мишей старіння. Ми спостерігали порушення навчання та пам’яті (рис. 7A), а також зміни в складі кишкової мікробіоти (рис. 7B, 7C) у мишей групи ABX порівняно з групою, що отримувала CDPS. Наведені вище результати свідчать про те, що навіть адмініструванняCDPSне може підвищити здатність до навчання та пам’яті мишей після зміни кишкової флори. Крім того, ми спостерігали підвищені рівні прозапальних цитокінів у мозку та сироватці мишей групи ABX порівняно з групою CDPS (рис. 7D–7N). Результати груп ABX і CY показали, що після знищення кишкової флори та імунної функції навіть введення CDPS не могло покращити здатність мишей до навчання та пам’яті. Ці результати свідчать про те, що лікування CDPS зменшувало периферичне запалення, окислювальний стрес і когнітивне зниження, спричинене D galстаріннямоделювати мишей шляхом запобігання дисбактеріозу кишечника.

Потім ми використали імуносупресивний препарат, циклофосфамід [24], щоб визначити роль запалення в сприятливих ефектах CDPS. Миші CDPS, які отримували циклофосфамід (група Cy), продемонстрували порушення здатності до навчання та пам’яті, зміни в складі кишкової мікробіоти та аномальні рівні про- та протизапальних цитокінів у мозку та сироватці порівняно з мишами дикого типу таCDPSгрупа мишей. Однак це не має значення в порівнянні з моделлю та групою ABX. (Рис. 7A–7N). Ці дані демонструють, що зміни в складі кишкової мікробіоти посилюють периферичне запалення в індукованому D-galстаріннямоделі мишей.

CDPS запобігає старінню, викликаному D-gal, регулюючи метаболізм амінокислот

На імунну систему хазяїна впливають метаболіти, що утворюються кишковою мікробіотою [25]. Фекальні метаболіти являють собою функціональне зчитування кишкового мікробного метаболізму та кишкового мікробного складу [26]. Крім того, метаболіти кишкової мікробіоти потрапляють у кровообіг і впливають на метаболізм і здоров’я господаря [26, 27]. Загалом 1058 метаболітів було ідентифіковано у зразку сироватки від fWT, Mod andCDPSмиші. Потім ми проаналізували ці метаболіти за допомогою BioCyc, Кіотської енциклопедії генів і геномів (KEGG) і бази даних метаболом людини (HMDB) і виявили, що 65 метаболітів були диференційовано експресовані в групі Mod порівняно з групою WT. Крім того, ми виявили, що рівні 8 метаболітів (креатиніну, валіну, L-(-)-метіоніну, о-толуїдину, N-етиланіліну, сечової кислоти, проліну та фенілаланіну) значно відрізнялися між групами WT, Mod та CDPS. Аналіз збагачення цих 8 метаболітів за допомогою MetaboAnalyst [28, 29] показав, що ці метаболіти пов’язані з метаболізмом аргініну, гістидину, аргініну, проліну та пурину (рис. 8A, 8B). 7 різних метаболітів групи MOD і групи CDPS у групі WT.

Потім ми проаналізували, чи пов'язані зміни в метаболізмі амінокислот зі змінами в складі мікробіоти кишечника. Ми спостерігали, що 7 різних метаболітів груп WT, Mod і CDPS (креатинін, валін, L-(-)-метіонін, о-толуїдин, N-етиланілін, сечова кислота та пролін) були значно знижені в ABX, Cy та Групи мод порівняно з групами WT і CDPS. Крім того, немає значення між групами ABX і Cy (рис. 8C). Нарешті, щоб дослідити, існує кореляція між диференціальним метаболізмом та іншими захворюваннями, пов’язаними зі старінням. Ми проаналізували кореляцію між цими сімома різними метаболітами та захворюваннями людини за допомогою бази даних MetaboAnalyst і виявили, що ці метаболіти пов’язані з хворобою Альцгеймера (p=0.00173; рис. 8D, 8E). Загалом ці дані свідчать про цеCDPSзахищає від D-gal-індукованогостарінняшляхом регуляції обміну амінокислот.

ДИСКУСІЯ

Прогресуюче зниження когнітивних функцій є характерною ознакою старіння. Попередні дослідження показали, що лікування CDPS значно покращило навчання та пам’ять у мишей старіння моделі [30–33]. У цьому дослідженні ми продемонстрували, що лікування CDPS покращує когнітивні функції шляхом пригнічення периферичного запалення та окислювального стресу через відновлення кишкового мікробного гомеостазу в індукованих D-galстаріннямоделі мишей (рис. 9). Щури Sprague-Dawley годували сПолісахариди цистанхепоказали посилений ріст корисних кишкових бактерій і посилене мікробне різноманіття кишечника [34]. CDA-0.05, нейтральний полісахарид Cistanche, покращує ріст пробіотичних лактобактерій [22]. Ці дані свідчать про те, що полісахариди Cistanche покращують гомеостаз кишкових бактерій.

У цьому дослідженні ми продемонстрували цеCDPSмає протизапальну дію та покращує когнітивні здібності модельних мишей, що старіють, шляхом модуляції чисельності родів кишкових бактерій, таких як Bacteroidetes, Firmicutes і Proteobacteria. Таким чином, CDPS може бути терапевтично корисним для захворювань, пов’язаних зі старінням, змінюючи склад мікробіоти кишечника [35,36]. Крім того, попередні дослідження показали, що рівні запальних цитокінів у сироватці крові та товстій кишці пов’язані з відносною чисельністю таких родів бактерій, як Bacteroidetes, Firmicutes та Proteobacteria [37, 38]. Крім того, мікробний склад кишечника регулює функцію мозку шляхом модуляції циркулюючих рівнів кількох цитокінів [39–43]. Наші результати показали, що лікування CDPS зменшило відносну чисельність Thermoplasmata, Bacilli, неідентифікованих Actinobacteria, Fusobacteriia та неідентифікованих Elusimicrobia та збільшило відносну чисельність Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, неідентифікованих _Deferribacteres, Mollicutes, Nitrososphaeria, Anaerolineae, Erysipelotrichia та неідентифіковані_ціанобактерії.

Кишкові мікробні метаболіти вивільняються в кров і регулюють здоров’я та метаболізм хазяїна [26, 27]. Мікробні метаболіти кишківника можна оцінити, оцінюючи фекальний метаболітичний склад, який змінюється зі змінами в складі кишкових мікробів [44]. Недавні дослідження показали, що рівні цитруліну, проліну, аргініну, аспарагіну, фенілаланіну та треоніну в плазмі пов’язані з нейродегенеративними розладами, включаючи хворобу Альцгеймера [45, 46]. Наше дослідження показало, що сироваткові рівні креатиніну, валіну, L-метіоніну, о-толуїдину, N-етиланіліну, сечової кислоти та проліну були пов’язані з D-gal-індукованимстарінняу мишей.

Вроджені та адаптивні ланки імунної системи відіграють значну роль у підтримці гомеостазу мікроорганізмів-хазяїна на поверхні просвіту кишечника [47]. Кишкова мікробіота також відіграє важливу роль у регуляції центральної нервової системи (ЦНС) та імунітету шляхом вивільнення цитокінів і метаболітів у кров [48, 49]. Прозапальні цитокіни відіграють ключову роль у кількох нейродегенеративних захворюваннях [50–52]. Наприклад, вікова дегенерація жовтої плями (ВМД) і глаукома пов’язані з позаклітинним накопиченням амілоїду (А) і внутрішньоклітинним відкладенням гіперфосфорильованого тау (p-тау) і заліза в гангліозних клітинах сітківки (RGC) [44]. Крім того, запалення відіграє значну роль у патогенезі глаукоми [53]. Порушення зору є раннім симптомом хвороби Альцгеймера (БА) і проявляється до початку когнітивного зниження [54]. Наше дослідження це показалоCDPSзахищає від зниження когнітивних функцій і периферичного запалення, підтримуючи гомеостаз мікробіоти кишечника.

Це дослідження має кілька обмежень. По-перше, зв’язок між метаболізмом амінокислот і складом мікробіоти кишечника недостатньо відомий. По-друге, склад і молекулярна структура CDPS невідомі. Таким чином, необхідні майбутні дослідження для подальшого вивчення регуляторної ролі CDPS у полегшенні AD через вісь кишкової мікробіоти та мозку.

На завершення наше дослідження це продемонструвалоCDPSпокращення когнітивних здібностей у D-gal-індукованихстаріннямодельних мишей, відновлюючи гомеостаз кишкової мікробіоти, тим самим відновлюючи амінокислотний дисбаланс, периферичне запалення та окислювальний стрес. Ці результати свідчать про те, що CDPS є потенційним терапевтичним засобом для пацієнтів із розладами навчання та пам’яті, особливо пов’язаними з дисбактеріозом кишечника.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Підготовка ЦДПС

Близько 1.0 Кг очищеногоCistanche deserticolaсушили на повітрі в духовці при 40 градусах C і подрібнювали в сирий порошок. Порошок екстрагували гарячим етанолом протягом 3 годин. Залишок фільтрували через марлю для видалення фільтрату, а потім розбавляли водою (8X) і кип’ятили послідовно протягом 2 годин, 1,5 годин і 1 години при 90 °C. У кожній точці часу розчин центрифугували, щоб відокремити супернатант і з'єднується з коричнево-червоним фільтратом. Потім фільтрат концентрували при зниженому тиску, охолоджували до кімнатної температури, повільно додавали до 95% етанолу (3X) і залишали стояти при 4°C протягом 24 годин. Потім розчин центрифугували при 6000 об/хв протягом 20 хв при 4°C. Осад збирали після повторної водної екстракції та тричі осадження спиртом. Осад розчиняли у воді, депротеїнізували, діалізували та ліофілізували, щоб отримати сирийПолісахарид Cistanche deserticola(CDPS). За даними ультрафіолетової спектрофотометрії, вміст полісахаридів становив понад 90 відсотків.

Групування тварин і лікування

Восьмитижневих самців мишей Куньмін (ліцензія SCXK №2019-0010) придбали у SPF Biotechnology Co. Ltd (Пекін, Китай), помістили в освітлене приміщення з контрольованою температурою та годували їжею та водою. Усі експерименти на тваринах проводилися відповідно до протоколів, затверджених Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Медичного університету Внутрішньої Монголії. Експерименти проводилися відповідно до Керівництва Національного інституту здоров’я (NIH) щодо догляду та використання лабораторних тварин.

Після 1 тижня адаптації до нового середовища 120 мишей розділили на наступні 7 груп: (1) контроль дикого типу (WT); модельна група (150 мг/кг/день D-gal; Mod); (3) CH: D-gal плюс 100 мг/кг CDPS; (4) CM: D-gal плюс 50 мг/кгCDPS; (5) CL: D-gal плюс 25 мг/кг CDPS; (6) Група ABX: антибіотики плюс D-gal плюс 50 мг/кг CDPS; (7) Група Cy: циклофосфамід плюс D-gal плюс 50 мг/кг CDPS.

Миші з модельної групи, груп ABX, Cy та CDPS отримували підшкірні ін’єкції 150 мг/кг D-gal у фізіологічному розчині щодня протягом 2 місяців. Групі WT підшкірно вводили рівний об’єм фізіологічного розчину протягом 2 місяців. Мишам групи CDPS також щодня вводили внутрішньошлункові ін’єкції, що містили 100 мг/кг, 50 мг/кг або 25 мг/кг CDPS протягом 2 місяців. Миші групи ABX отримували питну воду з 0,1 мг/мл ампіциліну та 0,5 мг/мл стрептоміцину протягом 2 місяців на додаток до D-gal іCDPSін'єкції. Перед введенням D-gal миші протягом 7 днів отримували ін’єкції, що містили 0,1 мг/мл ампіциліну, 0,5 мг/мл стрептоміцину та 0,1 мг/мл колістину в групі АВХ. Мишам групи Cy отримували внутрішньоочеревинні ін’єкції 20 мг/кг циклофосфаміду через день (qod) протягом 2 місяців на додаток до щоденних ін’єкцій D-gal і CDPS.

Тест розпізнавання нових об'єктів

Проведіть поведінкові експерименти після останньої дози. Тест на розпізнавання об’єктів включав етапи ознайомлення, навчання та тестування. Під час етапу ознайомлення мишей звикали в порожній тестовій камері протягом 10 хвилин протягом двох днів. Потім, на третій день (день навчання), два предмети однакового розміру, форми та кольору (A1 і A2) були розміщені на протилежних кінцях камери. Потім кожній миші було дано 10 хвилин на дослідження двох схожих об’єктів. Через 1- годин (на третій день) і 24- годин (на четвертий день) інтервалів між навчанням і тестуванням один із подібних об’єктів (A1 або A2) було замінено на B або C об’єкт, що відрізняється розміром, кольором і формою в день тестування. Під час етапу тестування кожну мишу тестували протягом 5 хвилин і розраховували індекс переваги для визначення пам’яті розпізнавання нового об’єкта (B або C) за такою формулою: Індекс переваги=Час на об’єкті B або C/( Час на об’єкті B або C плюс час на об’єкті A) × 100 відсотків.

Тест у водному лабіринті Морріса

Випробування водного лабіринту Морріса проводили в круглому басейні глибиною 45 см і діаметром 90 см. Протокол, описаний Ruediger S, et al. (2011) [55] та Wood RA, et al. (2018) [56] тут був працевлаштований. Глибина води в басейні становила 30 см, а температура води 20±1 градус С. Діаметр платформи становив 6 см, глибина під водою 1 см. Час навчання і тестування становив 60 с. Для навчання ми проводили чотири випробування по 60 с кожне з прихованою платформою щодня протягом п’яти безперервних днів. Якщо платформа не була виявлена ​​мишами протягом 60 с, їх направляли на платформу і ставили на платформу на 5 с. Під час етапу тестування затримка досягнення прихованої платформи під час навчання та пробних сеансів зондування, кількість переходів через вилучену платформу та час, проведений у цільовому (платформному) квадранті, реєструвалися й аналізувалися.

ІФА аналізи

Рівні прозапальних цитокінів у сироватці крові, таких як IL-2(), IL-4, IL-10 і TNF-, аналізували для кожної групи мишей за допомогою наборів ELISA, придбаних у Shanghai Yi Li Biological Technology Co., Ltd. (Шанхай, Китай) згідно з інструкцією виробника. Активність антиоксидантного ферменту, супероксиддисмутази (SOD), і рівні продукту перекисного окислення ліпідів, малонового діальдегіду (MDA), у сироватці кожної групи мишей аналізували за допомогою наборів для аналізу, придбаних у Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China) . Рівні білкових продуктів прогресивного окислення (AOPP) у зразках мишачого гіпокампу оцінювали за допомогою набору ELISA від Shanghai Yi Li Biological Technology Co. Ltd. (Шанхай, Китай) відповідно до інструкцій виробника.

Оцінка окислювального стресу в мозку мишей

Ми гомогенізували 100 мг тканини гіпокампу з 0,9 мл охолодженого льодом фізіологічного розчину, а гомогенат центрифугували при 12000 об/хв протягом 30 хвилин при 4°C. Вміст білка в супернатанті аналізували за допомогою набору для аналізу білка BCA ( Beyotime Biotechnology, Шанхай, Китай). Рівні перекисного окислення ліпідів (LPO) і малонового діальдегіду (MDA), а також активності GSH-Px і SOD у зразках гіпокампу аналізували за допомогою колориметрії з використанням наборів від Інституту біоінженерії Nanjing Jiancheng (Нанкін, Китай) відповідно до інструкцій виробника.

Склад кишкової мікробіоти

Зразки фекалій були зібрані в усіх мишей і негайно зберігаються при -80 градусах C. Ділянку V3 плюс V4 гена 16S рРНК секвенували за допомогою Illumina MiSeq (Beijing Novogene Co. Ltd., Пекін, Китай) і проаналізували за допомогою QIIME відкрита платформа для визначення профілів кишкової мікробіоти.

РХ/МС аналіз сироваткових метаболітів

Зразки сироватки інкубували протягом 10 хвилин із попередньо охолодженим метанолом у співвідношенні 1:3 для осадження білків. Зразки центрифугували при 12000 об/хв протягом 15 хвилин при 4 градусах С. Супернатанти аналізували за допомогою рідинної хроматографії швидкої роздільної здатності Thermo Scientific Dionex UltiMate3000 і мас-спектру QExactive. Умови хроматографії наведені в таблиці 1. Аналіти розділяли в хроматографічній колонці XBridge BEH Amide (2,1×100 мм; Waters Co., Мілфорд, Массачусетс, США) з використанням 0,1% мурашиної кислоти та ацетонітрилу як рухомих фаз A і B. , відповідно. Швидкість потоку встановлювали на рівні 0,4 мл/хв, об’єм ін’єкції становив 5 мкл, а температуру колонки встановлювали на рівні 25 градусів С (Таблиця 1). Сигнали мас-спектру отримували в режимах сканування позитивних і негативних іонів. Напруга іонного розпилення та інші специфічні параметри MS наведені в таблиці 2.

Статистичний аналіз

Statistical analysis was performed using the SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). The data plots were generated using GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). Partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of SIMCA-P+13.0 (Umetrics, AB, Umeå, Sweden) and Principal Components Analysis (PCA) were used to assess normalized GC-MS spectral data. Variable Influence on Projection (VIP) values were used to identify significant variables with VIP values >1.0 і стор< 0.05.="" these="" significant="" variables="" were="" used="" to="" identify="" the="" spectral="" peaks.="" the="" student's="" t-test="" was="" used="" to="" analyze="" differences="" between="" two="" groups="" of="" data.="" the="" taxonomic="" rank="" differential="" between="" groups="" was="" determined="" using="" student's="" test="" (v3.1.2;="" r="" programming="" language).="" the="" correlation="" between="" genera="" abundance="" and="" mouse="" behavior="" was="" calculated="" using="" spearman="" correlation="" coefficients="" (r="" language).="" p="" <="" 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" the="" data="" are="" presented="" as="">