Полісахариди Cistanche Deserticola послаблюють діабетичну нефропатію у мишей, впливаючи на кишкову флору та інгібуючи сигнальний шлях рецептора 4/ядерний фактор-κB

Анотація: Мета цього дослідження полягала в дослідженні меліоративного ефекту таПотенційний механізм полісахаридів Cistanche Deserticola (CDP)наДіабетична нефропатія (DN)у мишей. Модель миші DN була встановлена ​​за допомогою годування дієти з високим вмістом жиру (HFD) у поєднанні з внутрішньочеревною ін'єкцією стрептозотоцину (STZ). Тридцять шість мишей C57BL/6n були випадковим чином розділені на шість груп (n=6 кожна). Всі групи вводили перорально з дистильованою водою (контроль та модель), дапагліфлозин або CDP протягом 4 тижнів. Зміни у фізіологічних індексах, функції нирок,Запальні факториі кишкові мікробіоти оцінювали. Результати показали, що CDP значно покращили загальний стан та послаблювалиниркові гістопатологічні зміниізнизив рівень глюкози в крові, сечовий білокіЗапальні факториу мишей DN. Крім того, CDP вплинули на рівновагу кишкової мікробіоти, збільшували чисельність корисних бактерій та зменшили потенційні патогенні бактерії, що, в свою чергу, покращило функцію кишкового бар'єру. CDPS також інгібував активацію сигнального шляху рецептора 4/ядерного фактора-рецептора (TLR4/NF-κB) та зменшив вивільнення ліпополісахариду (LPS). На закінчення, CDP виявляють поліпалений вплив на ДН у мишей, впливаючи на мікробіоти кишечника та інгібуючи запальні сигнальні шляхи. Цей висновок пропонує нові уявлення про лікування ДН.

 

Ключові слова: полісахариди Cistanche Deserticola;діабетична нефропатія; кишковий бар'єр; кишкова флора; Рецептор 4, що нагадує, 4; Ядерний фактор-κB

 

Екстракт Cistanche Deserticola з високоякісною сировиною

Клацніть, щоб отримати більше деталей

 

 

 

Діабет нефропатія (ДН)є провідною причиною ниркової хвороби кінцевої стадії та серйозно загрожує життю та здоров’ю пацієнтів [1]. Дослідження підтвердили, що дисбаланс кишкової флори відіграє важливу патогенну роль у процесі діабету, що розвивається в DN [2-3]. Теорія "Осі кишки-Кідні" вважає, що зміни в мікросередовищі кишечника можуть впливати на прогресування хронічної хвороби нирок, безпосередньо регулюючи метаболіти кишкової флори [2-3]. Флора кишечника відіграє важливу роль у регулюванні функції нирок у моделях миші DN [4-5]. Поглиблені дослідження "Осі кишки-Кідні" допоможуть уточнити патогенез ДН та виявити нові цілі для профілактики та лікування.
Cistanche Deserticola - це традиційна лікарська та їстівна рослина, також відома як Cistanche Deserticola, Dijing, Jinsun тощо, загальновідома як Даун, і має репутацію "пустельного женьшеню" [6]. Згідно з фармакопоеї Китайської Народної Республіки, Cistanche Deserticola є сушеним м'ясистим стеблом з лускатлими листками Cistanche Deserticola yc Ma або C. tubulosa (Schenk) Wight, рослиною роду Cistanche у сімейному Orobanchaceae.
Серед них Cistanche Deserticola має довгу історію використання як ліків, так і їжі. Cistanche Deserticola має солодкий, солоний і теплий за своєю природою і входить у нирки та меридіани товстої кишки. Це впливає на тонізуючу нирку Ян, користь сутності та крові, а також зволоження кишечника та полегшення запор [7-8]. Полісахариди - один з головних активних інгредієнтів Cistanche Deserticola. Вміст полісахаридів у екстракті води Cistanche Deserticola відносно високий. В основному він складається з моносахаридів, таких як глюкоза, галактоза, рамноза, арабіноза та фруктоза. Він має багато фармакологічних ефектів, таких як регулювання імунної активності, проти старіння, поліпшення навчання та пам’яті, захист нервів, протистояння ушкодженню печінки, антивірусного та протипухлинного [9-12]. Попередні дослідження дослідницької групи показали, що екстракт води Cistanche Deserticola має потенційний терапевтичний вплив на ДН [13]. Виходячи з цього, цей експеримент сприйняв кишкову флору та запальну реакцію як вихідну точку для вивчення впливу полісахаридів Cistanche Deserticola (CDP) на покращення ДН у мишей та відновлення функції нирок, щоб забезпечити наукову основу для ролі CDP у лікуванні ДН.

1 матеріали та методи

1.1 Тварини, матеріали та реагенти

36 6- Тижневий C57BL/6J мишей-чоловіків були придбані в Центрі експериментів тварин Медичного університету Сіньцзян, Ліцензія на виробництво тварин №: SCXK (xin) 2023-0006; Резолюція етики №: IACUC -20210331-04.
Desert CDP (полісахаридна масова фракція ＞ 80%, номер партії: 2306019) компанія Shaanxi Xintianyu; dapagliflozin (dapa; партія номер: 2108119) Astrazeneca Pharmaceuticals Co., Ltd.; Загальний білок сечі (сеча загальний білок, UTP; партія номера: C 035-2-1), азот сечовини (азот крові сечовипускання, BUN; партія: C 013-2-1), креатинін (креатинін, CRE; партія; Нанкін Цзянченг Інститут біоінженерії; Ліпополісахарид (LPS; Пакетний номер: yx -121619 m), interleukin -6 (il -6; число партії: yx-e20012), il -1 (партія номера: yx-e20533), трансформація росту (tgf- YX-E20217), фактор некрозу пухлини (TNF-; партія: YX-E20220) KIT Shanghai Youxuan Biological Co., Ltd.; Посилений набір хемілюмінесцена (ECL) Beijing Pulilai Gene Technology Co., Ltd.; Стрептозотоцин (СТЗ; число партії: 20230503), дієта з високим вмістом жиру (60% співвідношення жиру з високим вмістом жиру очищена тип, число матеріалу: Boaigang12492m) Пекін Boaigang Biotechnology Co., Ltd.
Основна корм (містить 22% кукурудзяного борошна, 12% висівок, 18% нафтового залишку, 8% рибної їжі, 12% соєвої їжі, 0. 17% солі, 0. 25% вітамінів, 0. Медичний університет Сіньцзян.

 

1.2 Інструменти та обладнання

AE240 Аналітичний баланс, Mettler-Toledo Instrument Co., Ltd., Швейцарія; DHG -9053 Електрична духовка сушильна духовка, Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.; DK-S22 Постійна температурна водяна бомба, Шанхай Джинхонг Експериментальний інструмент Co., Ltd.; 3-18 KS високошвидкісна низькотемпературна центрифуга, Sigmaaldrich, США; BS -380 повністю автоматичний біохімічний аналізатор, Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd.; EM KMR3 SLICER, HI1220 SLICER, DIGITAL MICROSCOPE LEITZ OPTILUX, Leica, Німеччина; Fluorchem e ChemiLumineScience System, білки, США.

1.3 Методи

1.3.1 Експеримент з тваринами

36 мишей C57BL/6J чоловіків годували в лабораторії SPF медичного університету Сіньцзян і вільно годували. Експеримент проводився після 7 днів адаптивного годування. Шість мишей були вибрані випадковим чином як нормальна (контрольна) група та дали основну дієту. Решту експериментальних груп годували дієтою з високим вмістом жиру і зберігали в окремих клітках. Вага тіла тестували раз на тиждень. Мишам вільно їсти та пити воду. Після 6 тижнів годування дієти з високим вмістом жиру експериментальні групові миші вводили STZ 4 0 мг/кг внутрішньочеревно протягом 5 днів поспіль, крім вільної дієти з високим вмістом жиру щодня. Глюкоза в крові натще після моделювання становила 11,1 ммоль/л, що вважалося успішною моделлю діабету. Thirty mice with successful modeling were randomly divided into five groups, with six mice in each group, namely the model (distilled water + high-fat diet, Model) group, Dapa (Dapa 4 mg/kg + high-fat diet, Dapa) group, CDPs low-dose (50 mg/kg + high-fat diet, CDPs-L) group, CDPs medium-dose (100 mg/kg + high-fat diet, CDPs-M) group, and CDPS з високою дозою (200 мг/кг + дієта з високим вмістом жиру, CDPS-H). Контрольну групу (дистильована вода + нормальна дієта) отримували рівну кількість дистильованої води. Кожну мишу гріли на рівні 0,1 мл/10 г, один раз на день одночасно, загалом 4 тижні. Зміни глюкози тіла та зміни глюкози в крові щотижня реєструвались.

1.3.2 Визначення індексу

Після 4 тижнів введення гаважів зразки сечі (24 год) та свіжі кали збирали через метаболічні клітки в кінці 4 -го тижня і зберігали на градусі -20 та -80 ступінь відповідно. Мишей постили, але не поливали протягом 12 год. Наступного дня вимірювали масу тіла голодування мишей. Мишей знеболювали при внутрішньочеревній ін'єкції 3 мл/кг 10% хлорального гідратного розчину. Кров збирали з орбіт і центрифугували в центрифузі (4 градусів, 3 500 r/хв) протягом 15 хв. Супернатант був аспірований, упакований та зберігався в холодильнику -80 для подальшого використання. Сироватку вимірювали для BUN, CRE, UA, IL -6, IL -1, TGF-, TNF- та LPS відповідно до набору. Сечу вимірювали протягом 24 год UTP відповідно до набору.

 

1.3.3 Морфологічне та патологічне спостереження нирок та кишечника

1.3.3.1 Визначення коефіцієнта нирок

Після збору крові мишей знеболювали до смерті шляхом передозування, а нирки та колони були повністю видалені та негайно промивали попередньо охолодженим сольовим розчином, осушеними на фільтрувальному папері і зважували. Коефіцієнт нирок обчислювали відповідно до наступної формули: коефіцієнт нирок/%= × 100 м1 м, де M1 - це мокра вага нирок/г; м - маса тіла миші/г.

 

1.3.3.2 Патологічне спостереження нирок

Нирки миші за фіксуванням 4% параформальдегіду фіксатором, зневодненим градієнтом розчину етанолу, прозорим за допомогою ксилолу, вбудовано в парафін, нарізаний (товщина 2 мкМ), зневоднювали ксилолом і гідратували градієнт етанолу, а потім заплямовані гематоксилінами & eosin (h & e) запечатані, а зображення збирали та спостерігали під мікроскопом.

 

1.3.3.3 Патологічне спостереження кишечника

Кишечник миші фіксували 4% фіксатором параформальдегіду, зневодненим градієнтом розчину етанолу, прозорим з ксилолом, вбудованим у парафін, нарізаним (товщина 2 мкМ), зневодений ксилолом, і гідратував етанолу градієнтом, а потім забарвленими Mistroscopy.

 

 

1.3.4 Аналіз складу флори кишечника

Вміст товстої кишки мишей у контрольній групі, модельній групі та групі CDPS-H виявлено за допомогою високопропускної послідовності гена рРНК. Вилучення ДНК та побудови бібліотеки та секвенування мікроорганізмів у вмісті товстої кишки були завершені Lianchuan Biotechnology Co., Ltd., а отримані дані були проаналізовані на хмарній платформі Lianchuan.

 

1.3.5 Виявлення експресії білка нирок та товстої кишки

Білки з тканинами нирок та товстої кишки були вилучені, а білок кількісно оцінювали методом кількісного визначення білка біцинхонінової кислоти. Після денатурації білка білок зберігали в холодильнику -20. 10% додецилсульфат-поліакриламідного гелевого електрофорезу, полівініліден-дифторид-перенесення, мембрана поміщали в сольовий розчин Tris з інкубаційним резервуаром Tween -20 (TBST) та заблокованою при кімнатній температурі. Виявлення
The primary antibodies to Toll-like receptors (TLR) 4, nuclear transcription factor (NF)-κB p65, p-NF-κBp65, and -actin in kidney tissue (antibody diluted 1:2 000 (V/V) with TBST solution) and occludin and zonula occludens-1 (ZO -1) у тканині товстої кишки (антитіло, розведене 1: 1 000 (v/v) з розчином TBST) інкубували при 4 градусах протягом ночі. Розведення TBST, вторинне антитіло (антитіло
Розведений розчином TBST 1∶ 2 000 (v/v)), інкубований при кімнатній температурі протягом 1 год, промивається TBST 3 рази, а потім виявляв шляхом додавання люмінесцентного реагенту ECL, а для виявлення експресії білка використовували. -Actin використовувався як внутрішня довідка, а значення білка сірого аналізували за допомогою програмного забезпечення ImageJ. Експресія білка кожної групи виражалася як відносне значення сірого значення контрольної групи.

 

1.4 Статистика даних

Усі результати даних були виражені як ± s, а для статистичного аналізу використовувались ± s, а SPSS 21. 0. Для безперервних даних, якщо вони дотримувались нормального розподілу, для порівняння міжгрупового порівняння використовувався односторонній аналіз дисперсії. Якщо різниця між групами була статистично значущою, метод Туреччини додатково використовувався для попарного порівняння; Якщо дані слідували за нормальним розподілом, для порівняння міжгрупового порівняння використовували тест Kruskal-Wallis H. Коли існувала статистична різниця між групами, метод найменш значущої різниці Дурбіна додатково використовувався для декількох порівнянь. P <0. 05 вказав, що різниця була статистично значущою.

 

 

2 результати та аналіз

2.1 Вплив CDP на глюкозу в крові, маса тіла та коефіцієнт нирок C57BL/6J

Як видно з таблиць 1 до 3, порівняно з контрольною групою, глюкоза мишей у крові натще в модельній групі була значно збільшена (p<0.01), and the kidney coefficient was significantly increased (P<0.01); compared with the Model group, CDPs- The body weight of mice in group H increased significantly after 4 weeks of administration (P＜0.05), and blood sugar began to decrease after 3 weeks of administration (P＜0.05). The kidney coefficient of mice in each intervention group decreased, and the CDPs-H group was the lowest (P<0.01); the body weight of mice in the Control group was larger than that of each group, indicating that CDPs can slow down the swelling of the kidneys of DN mice, thereby Reduce the kidney coefficient.

 

Таблиця 1 Вплив CDP на глюкозу в крові мишей (n=6)

Група	Час/тиждень
	0	1	2	3	4
КОНТРОЛЬ	7.98±0.55	7.32±0.40	7.58±0.50	7.38±0.87	7.28±0.34
Модель	10.62±2.79#	20.32±2.69#	24.47±4.18#	24.92±3.98#	20.33±2.96#
CDPS-L	16.03±2.97	21.83±4.81	20.13±6.97	23.30±3.77	21.25±1.65
CDPS-M	13.17±3.59	22.6±5.88	19.35±4.45	22.6±4.87	18.38±1.20
CDPS-H	11.07±1.74	21.53±3.71	21.57±6.19	17.43±2.05**	15.87±0.90**
Дапа	10.28±4.75	21.12±4.96	17.72±2.00**	17.35±2.00**	14.55±1.06**

Одиниця: mmol/l

 

Таблиця 2 Вплив CDP на індекс нирок мишей (n=6)

 

Група	КОНТРОЛЬ	Модель	CDPS-L	CDPS-M	CDPS-H	Дапа
Нирки/маса тіла %	0.98±0.04	1.69±0.17##	1.42±0.12	1.37±0.10*	1.28±0.10**	1.18±0.10**

 

Таблиця 3 Вплив CDP на масу тіла мишей (n=6)

 

Група	Час/тиждень
	0	1	2	3	4
КОНТРОЛЬ	28.57±0.82	28.75±0.97	28.70±0.79	29.10±1.24	29.32±1.35
Модель	24.53±1.25##	24.92±1.20##	24.35±1.39##	24.82±1.22##	24.73±1.56##
CDPS-L	25.75±0.69	24.77±0.91	24.83±0.99	25.10±0.83	25.42±0.97
CDPS-M	25.10±0.56	25.00±0.54	24.68±0.48	25.13±0.62	25.25±0.58
CDPS-H	25.38±0.28	25.43±0.49	25.52±0.62	25.73±0.50	26.08±0.34*
Дапа	25.13±1.02	25.52±0.98	25.97±1.00*	26.25±0.63*	26.63±0.78*

 

 

2.2 Вплив CDP на ниркову функцію мишей C57BL/6J

Як показано в таблиці 4, порівняно з контрольною групою, концентрації BUN, CRE та UA у сироватці крові та 24 години концентрації маси UTP у сечі мишей у модельній групі були значно збільшені (P<0.01); compared with the Model group, CDPs-M and CDPs-H can significantly reduce the concentrations of BUN, Cre, and UA in serum and the 24-hour UTP mass concentration in urine (P＜0.05, P＜0.01). CDPs-L can significantly reduce the concentrations of BUN and UA in mouse serum. and 24 h UTP mass concentration in urine (P＜0.05, P＜0.01).

 

Таблиця 4 Вплив CDP на Bun, CRE, UA та 24 H UTP у DN мишей (N=6)

Група	Концентрація булочки (ммоль/л)	Концентрація CRE (мкмоль/л)	Концентрація вмісту UTP 24H (мг/мл)	Концентрація UA (мкммол/л)
КОНТРОЛЬ	47.51±7.32	12.80±1.36	1.32±0.12	103.9±18.59
Модель	157.97±30.57##	44.85±4.36##	2.38±0.37##	500.43±81.06##
CDPS-L	112.70±16.76*	40.72±3.62	1.37±0.12**	264.07±14.85**
CDPS-M	82.31±14.68**	35.37±6.21*	1.06±0.17**	247.62±11.22**
CDPS-H	64.58±8.64**	30.00±2.87**	0.65±0.17**	222.71±37.52**
Дапа	76.98±10.47**	28.82±3.72**	0.37±0.10**	129.87±17.69**

 

 

2.3 Вплив CDP на запальні фактори та концентрація маси LPS у сироватці крові мишей C57BL/6J

 

Як показано в таблиці 5, порівняно з контрольною групою, рівні сироватки TNF-, il -1, il -6, TGF- та LPS у мишей у модельній групі були значно збільшені (p<0.01); compared with the Model group, Each dose of CDPs can reduce the levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, TGF-β and LPS in serum, CDPs-M
Ефект групи CDPS-H був значущим (P ＜ 0. 0 5 або P ＜ 0. 01), а ефект групи CDPS-H був значущим (P ＜ 0,01).

Таблиця 5 Вплив CDP на запальні фактори та LPS у мишей (n=6)

 

Група	Масова концентрація (PG/мл)
	TNF-	Il -1	Il -6	TGF-	LPS
КОНТРОЛЬ	111.23±5.47	125.85±11.41	112.27±10.28	152.25±7.28	116.17±15.07
Модель	167.90±16.91##	184.53±21.03##	195.57±31.88##	209.36±16.17##	173.51±15.72##
CDPS-L	144.57±10.15*	160.46±11.84*	169.10±20.32	189.03±8.02*	151.41±9.40*
CDPS-M	133.62±13.24**	154.30±17.39*	150.47±19.28*	171.25±14.35**	135.33±23.92**
CDPS-H	119.30±7.31**	140.54±16.11**	127.12±10.94**	169.47±10.57**	124.98±16.38**
Дапа	114.79±10.48**	135.17±14.37**	120.90±9.32**	159.11±10.92**	113.34±13.14**

 

 

2.4 Вплив CDP на ниркову патологію мишей C57BL/6J

Як показано на малюнку 1, після фарбування H&E було встановлено, що клубочкова структура та морфологія мишей у контрольній групі були нормальними та чіткими, базальна мембрана була гладкою, морфологія клубочок була регулярною, ниркова інтерстиція була нормальною, ниркові канальці були акуратно влаштовані, а інфільтрації запалених клітин не було. Порівняно з контрольною групою, клубочковий об'єм мишей у модельній групі збільшувався, базальну мембрану потовщували, запальні клітини інфільтували навколо неї, а ниркові канальці були невпорядковані та розширені; Порівняно з модельною групою, групи введення CDPS мали різний ступінь поліпшення нирок миші. Клаумерулярний об'єм мишей у групах CDPS-M та CDPS-H значно зменшився, товщину базальної мембрани знижувались, лише невелика кількість запальних клітин проникли, а ниркові канальці значно відновлювались і були щільно розташовані. Після 4 тижнів втручання CDPS вищезазначені патологічні умови були відновлені в різній мірі.

Фарбування Массоном показало, що ниркові канальці мишей у контрольній групі були розташовані нормально, а клубочки були в нормальній формі, проліферації колагенових волокон не спостерігалося, а трубчасті підвальні мембрани були помітні; Велика кількість забарвленого колагену спостерігалася в нирковій інтерстиціальній тканині мишей у модельній групі, а інтерстиціальна фіброзна тканина була вбудована та повторно проліферирована; Клаумерулярний об'єм мишей у групі CDPS-M був зменшений, а симптоми проліферації волокнистої тканини були полегшені; Ниркові канальці мишей у групі CDPS-H були розташовані більш регулярно, і спостерігалася невелика кількість проліферації колагенових волокон.

Результати фарбування PAS показали, що клубочки мишей у контрольній групі були нормальними за об'ємом і неушкодженими за структурою; Миші в модельній групі мали пошкодження нирок, клубочковий об'єм був більшим, ніж зазвичай, і форма була нерегулярною, а мезангіальна матриця осідала; Порівняно з модельною групою, пошкодження нирок мишей у кожній групі, що лікувалася наркотиками, було полегшено, і зі збільшенням дози, клубочкова форма та розмір, як правило, були нормальними, а ступінь мезангіального матричного осадження зменшувалася. Результати свідчать про те, що CDP можуть полегшити пошкодження тканин нирок у мишей ДН.

 

Рис. 1 Вплив CDP на гістопатологічні зміни нирок у мишей DN, досліджених фарбуванням H&E, MASSON та PAS (× 400)