Як вивчити генетичне різноманіття Herba Cistanches?
Mar 14, 2022
Дослідження генетичного різноманіття Herba Cistanches RAPD
Контакти:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Цуй Гуанхун, Чень Мін, Хуан Луці*, Сяо Супін, Лі Да
(Інститут китайської Materia Medica, Китайська академія китайської медицини, Пекін 100700)
Анотація
Призначення:Для вивчення населеннягенетичне різноманіттязCistanche deserticolaіЦистанка трубчаста.
Методи:Дві дикі популяціїCistanche deserticolaі чотири дикі популяціїЦистанка трубчастабули проаналізовані RAPD, ігенетичне різноманіттяпопуляцій аналізували за допомогою програмного забезпечення версії 1.31 POPGENE.
Результати:Середній відсоток поліморфних локусівCistanche deserticolaстановив 47,37 відсотка, поліморфні локуси двох популяцій становили 39,47 відсотка та 35,53 відсотка, а середнє різноманіття генів Nei становило 0.135 8. У Шеннона було більше. Індекс інформації про стан становить 0.207 2, а коефіцієнт диференціації генів Gst {{1{{20}}}}254 6. Середній відсоток поліморфних локусів у Cistanche становив 27,59 відсотка, а відсоток поліморфних локусів у кожній популяції коливався від 19,54 відсотка до 25,29 відсотка, з яких у популяції Andier було найвище 25,29 відсотка, а середнє розмаїття генів Nei становило 0. { {21}}, індекс інформації про поліморфізм Шеннона становить 0,1258, коефіцієнт диференціації генів Gst =0.175 5.
Висновок:Cistanche deserticolaіЦистанка трубчастамають певну диференціацію між популяціями. Theгенетичне різноманіттяпустельної Cistanche значно вищий, ніж Cistanche tubulosa, і диференційований на два екотипи.
Ключові слова: Cistanche deserticola; цистанка трубчаста; RAPD; генетичне різноманіття
[Номер китайської бібліотеки] S 567 [Ідентифікаційний код документа] A [Номер статті] 1001-5302 (2004) 08-0727-04
Цистанхея — це паразитична рослина, яка належить до роду цистанхових із сімейства лідових, також відомого як Даюнь, і є дорогоцінним китайським лікарським матеріалом. Основними рослинами-джерелами Cistanche deserticola в моїй країні єCistanche deserticolaYCMa та C.tubulosa (Schenk) R.Wight[1]. Рослини-господарі Cistanche deserticola — Haloxylon ammodendron і Haloxylon ammodendron, які в основному поширені в Алашаньській лізі у Внутрішній Монголії, північному Сіньцзяні, Цинхаї, Ганьсу та інших місцях. Поширення Cistanche deserticola таке ж, як і рослин-господарів. У моїй країні Cistanche cistanche поширений лише в округах навколо пустелі Таклімакан на південь від гір Тянь-Шань у Сіньцзяні, і його поширення не повністю синхронізовано з хазяїном Tamarix. Інші регіони, такі як північний Сіньцзян, Ганьсу, Цінхай, Нінся, Внутрішня Монголія, Шеньсі та інші місця рослин тамарікс не є паразитичними Cistanche Tubula[2]. Через швидке зростання попиту на цистанху в останні роки, що призвело до зникнення її ресурсів, ресурси дикої цистанхи скоротилися лише до кількох основних виробничих районів. Обидва були занесені до списку охоронюваних видів рослин у моїй країні [3], серед якихCistanche deserticolaбуло включено до Додатку II CITES [4].
Після кількох років досліджень дослідження штучного розведення цистанчі були успішними, і воно знаходиться на стадії широкомасштабного просування та посадки. Однак те, як запобігти занепаду видів Cistanche під час промислового виробництва, як відновити обмежену дику популяцію якомога швидше та зберегти дорогоцінні ресурси дикої зародкової плазми, є ключем до досягнення її сталого використання. Щодо охоронюваної спадщини Cistanche [Дата отримання], 2004-03-11 [Проект фонду] Проект соціального забезпечення Міністерства науки і технологій (2001.109); Проект «Десятий п’ятирічний план» Міністерства науки і технологій (2001BA701A09a) [Автор-кореспондент] * Huang Luqi, тел.:( 010) 64014411-2955, електронна пошта: huangluqi @263.net Дослідження передачі все ще триває порожній. У цьому дослідженні використовується технологія RAPD для вивчення 2 диких популяційCistanche deserticolaі 4 дикі популяціїЦистанка трубчаста, і проаналізуйте обидва Різниця вгенетичне різноманіттяочікується, що він стане важливою експериментальною генетичною основою для захисту цистанхе, дорогоцінного китайського ліки.
1. Матеріал і методи
1.1 Матеріали
Cistanche deserticolaбуло зібрано з округу Джимсар у Сіньцзяні та району Цзіліньтай Ліги Стародавньої Альша у Внутрішній Монголії. Популяції Cistanche були зібрані з округів Мінфен і округів Юйтянь, Сіньцзян. Округ Мінфен наразі є територією з найбільшим урожаєм Cistanche cistanche, з найвищою щільністю та відносно повними спільнотами природних лісів. Точки відбору проб Andil, Sawuzek, Yatongguz і Daheyan округу Yutian є основними виробничими районами, які розташовані в річках Andir, Yeyike, Yatongguzi та Kelaniya. У нижній течії річки відстань між популяціями перевищує 50 км. Кожна сукупність випадково відібрала 19-30 осіб. Зразки швидко висушували в силікагелі та використовували для екстракції ДНК (табл. 1).
Таблиця 1 Відбір популяцій та райони виробництва Cistanche deserticola та Cistanche tubulosa
1.2 Виділення ДНК
Метод тотальної екстракції ДНК використовує метод з високим вмістом солі та низьким pH [5]. Зразок ДНК піддавали обробці на спектрофотометрі для виявлення концентрації ДНК-матриці, потім електрофорез в 1-відсотковому агарозному гелі, EB-фарбування, спостереження та фотографування в ультрафіолетовому світлі, електрофорез ДНК з чіткими смугами та менше хвостів використовували для аналізу RAPD.
1.3 Скринінг праймерів RAPD
Оскільки експеримент виявив, що той самий праймер має незадовільний вплив на одночасну ампліфікацію обохCistanche deserticolaі Cistanche tubulosa, праймери перевіряли незалежно. Для ампліфікації та скринінгу використовували 150 випадкових праймерів (10 bp), 25 мкл реакційної системи Shanghai Shenggong Biotechnology Co., Ltd.; кожен праймер використовував 2 матриці популяції та 1 стерилізовану подвійну дистильовану воду як порожній контроль і отримав 10 праймерів для ампліфікації Cistanche deserticola з чіткими смугами, сильним поліморфізмом і хорошою повторюваністю: S490, S1 101, S{{ 8}}, S1 137, S1 165, S1 218, S1 222, S2 015, S2 112, S{{15 }}; 10 букварів оЦистанка трубчаста: S1 141, S1 146, S1 183, S1 208, S1 500, S2 032, S2 042, S2 052, S2 059, S2 155.
1.4 ПЛР-ампліфікація та виявлення продукту
Вибрані праймери використовували для ампліфікації матричної ДНКCistanche deserticolaіЦистанка трубчастаметодом ПЛР. Геномну ДНК розбавляли до 50 нг·мкл -1 відповідно до виміряної концентрації як матриці. Загальний об’єм реакції становить 25 мкл, з яких 10 × ПЛР-буфер 2,5 мкл, Mg2 плюс 1,5 мкл, Taq (5 од. мкл -1) 0,2 мкл, суміш dNTP (кожна 2,5 мМ) 1 мкл, 5 мкМ праймер 1 мкл, матриця ДНК 1 мкл, стерилізована двічі дистильована вода 18,8 мкл, вищевказаний розчин для ПЛР-ампліфікації є продуктом Shanghai Sangon. Ампліфікацію проводили на термоциклері PTC-100. Програма ампліфікації передбачала попередню денатурацію 94 градуси протягом 5 хвилин, а потім 40 циклів. Кожен цикл включав 94 градуси 45 с, 34 градуси 1 хв, 72 градуси 1 хв 30 с і, нарешті, Розширення на 72 градуси протягом 5 хв. Ампліфіковані продукти піддавали електрофорезу на 2,0-процентному агарозному гелі (містить EB) у буфері 1 × TAE, спостерігали та фотографували за допомогою системи візуалізації гелю SYNGENE.
1.5 Статистика та аналіз даних
У спектрі електрофорезу порівнюють відповідне положення продукту реакції на гелі за стандартом молекулярної маси та оцінюють молекулярну масу ампліфікованого продукту. Смуга зі смугою записується як 1, а смуга без смуги записується як 0, утворюючи матричний графік 0/1 і вводячи в комп’ютер, використовуючи POPGENE32 для обчислення відсотка поліморфних сайтів (PPL) кожної популяції, індекс генної різноманітності Нея (H), індекс інформації про поліморфізм Шеннона (I), коефіцієнт диференціації генів (Gst), різноманітність генів (Ht),Генетичне різноманіття(Hs), генетична ідентичність Нея (1978) (I) і генетична дистанція (D) в межах популяції, а також кластерний аналіз проводили за допомогою методу UPGMA.
2. Результати та аналіз
2.1 Генетичне різноманіття цистанхеї
Усі зразки отримали смуги з молекулярною масою в діапазоні від 200 до 2 200 bp (рис. 1, 2). Всього виявлено 76 локусів у 60 пробах із 2 популяційCistanche deserticola, 36 з яких були поліморфними локусами, що становило 47,37 відсотка, H=0.135 8, I=0.207 2. Серед них PPL Джимсара становить 39,47 відсотка, а Гіланті — 35,53 відсотка. H є 0. 0 95 3 і 0.1 070 відповідно, а I це 0.15 12 і 0.163 7 відповідно. Загалом було виявлено 87 локусів у {{20}} особин із 4 популяцій Cistanche, 24 з яких були поліморфними локусами, що становить 27,59 відсотка, H=0.084 8, I=0.1278. Найвищий PPL був у Анділі – 25,29 відсотка, тоді як PPL був нижчим у Савузеку та Ятунгусі (обидва – 19,54 відсотка). H — 0.062 1 -0.080 0, I — 0.095 0 -0.116. Розмір H та I узгоджується з тенденцією розміру PPL кожної популяції, і коефіцієнти є найбільшими в Andier, за яким йде Dayan. У випадку того самого PPL, H Савузека=0.{{40}} сума I=0.097 0 трохи вища за 0.{{44 }} та 0.095 0 Ятунгуської (табл. 2).
Рисунок 1 Посилені смуги RAPD деяких зразків пустеліCistanche deserticola, буквар S490 1-10. Гарантійні зразки; 11-20. Зразки Jimpster M-DNA Marker (200 - 2 000 bp)
Рисунок 2 Смуги ампліфікації RAPD деяких зразків Cistanche Tubulosa, праймер S2 042 1-20. Зразок Xinjiang Andier M-DNA Marker (200 - 2 000 bp)
Таблиця 2генетичне різноманіттязCistanche deserticolaіЦистанка трубчастанаселення
2.2 Аналіз генетичної варіації Cistanche
Відповідно до рівнягенетичне різноманіттяу популяціях (Hs), диференціації між популяціями (Dst) і частки генетичних відмінностей між популяціями в загальних генетичних відмінностях (Gst), можна побачити, що загальне генетичне різноманіття Cistanche deserticola Ht=0.{{ 1}}, де Hs=0.101 2, Gst =0.254 6. Cistanche Ht=0.082 2, з яких Hs=0.067 8, Gst=0.175 5 (табл. 3). Наведені вище результати вказують на наявність певного ступеня генетичної варіації серед популяцій. Варіації між пустельними популяціями Cistanche deserticola становили 25,46 відсотка загальної варіації, а варіація популяцій Cistanche tubulosa становила 17,55 відсотка загальної варіації.
Таблиця 3 Аналіз генетичної варіаціїCistanche deserticolaіЦистанка трубчаста.
2.3 Генетична дистанція та кластерний аналіз популяцій Cistanche deserticola
Генетична відстань двох популяційCistanche deserticolaце {{0}}.080 0, а генетична ідентичність – 0.9231. Генетична відстань чотирьох популяцій Cistanche становила 0.012 0-0.031 5, а генетична ідентичність становила 0.9690-0.988 1 (Таблиця 4). . Кластеризація особин Cistanche deserticola та Cistanche tubulosa показує, що Cistanche deserticola можна згрупувати у дві окремі групи відповідно до популяції, тоді як різні особини Cistanche tubulosa не можуть бути згруповані за популяцією, що також вказує на генетичну диференціацію серед Cistanche deserticola чисельність населення є відносно високою. Велика, але генетична диференціація серед популяцій Cistanche tubulosa невелика.
Таблиця 4 Генетична ідентичність (внизу ліворуч) і генетична дистанція (вгорі праворуч) відцистанка трубчаста.
3. Обговорення
3.1 Генетичне різноманіття цистанхеї
Рівеньгенетичне різноманіттярослин невіддільна від їхніх біологічних особливостей, середовищ існування, походження та еволюції. Серед них найбільший вплив мають система розмноження, ареал поширення, життєва форма, способи розповсюдження пилку та насіння [6]. Відповідно до статистичних результатів аллозимних даних 499 видів рослин у 165 родах Ge Song et al. [7], поліморфізм Cistanche на видовому рівні повинен становити близько 50 відсотків, а поліморфізм на популяційному рівні повинен становити близько 40 відсотків. Близько 0,17. Усі рівні поліморфізму, отримані в цьому експерименті, нижчі за ці середні значення. У той же час, порівняно з рівнями поліморфних локусів, отриманими методами RAPD для кількох поширених зникаючих рослин, таких як 32 відсотки зникаючих видів ялиці [18], 22,5 відсотка карликової півонії та 27,6 відсотка фіолетової півонії, [9] ] Можна побачити, що генетична різноманітністьCistanche deserticola трохи нижчий за середній рівень, тоді як генетичне різноманіття Cistanche tubulosa вже надзвичайно низьке.
3.2 Причини низького генетичного різноманіття Cistanche
Цистанхея — специфічна рослина-паразит, одночасно поширена у вузьких пустельних районах. Таким чином, унікальний спосіб життя та відносно вузька житлова площа можуть бути невід'ємною причиною того, чомугенетичне різноманіттяцистанхеї, як правило, нижче, ніж у звичайних рослин.
Різниця вгенетичне різноманіттяміж Cistanche deserticola та Cistanche tubulosa може бути пов’язано з різницею в діапазоні поширення цих двох і чи вони синхронізовані з розподілом господаря. Ареал поширення Cistanche tubulosa значно менший, ніж ареал Cistanche deserticola, і його поширення надзвичайно не синхронізовано з рослиною-господарем. Дослідження показали, що серед видів тамариксів існує велика різноманітність. Наприклад, Zhang Juan та ін. повідомили, що генетичне різноманіття Tamarix sibiricus досягає 98,7 відсотків [10], тоді як генетичне різноманіття Cistanche є надзвичайно низьким, що вказує на тривалу еволюцію. Cistanche tubulosa, можливо, зазнав серйозних вузьких місць в історії, що призвело до втрати великої кількостігенетичне різноманіття.
Водночас, за результатами розслідування, було встановлено, що жоден ізCistanche deserticolaв радіусі 20 км від людських поселень можна було розкопати та нормально розквітнути. Великі та малі ями цистанхе були розкопані, особливо в основних районах виробництва квітки цистанхе трубчастої. Тому це було викликано великим обсягом розкопок. Відсутність походження та знищення середовища проживання можуть бути основними техногенними причинами низького рівнягенетичне різноманіттяЦистанхе.
3.3 Генетична диференціація Cistanche
Через географічну відстань між Сіньцзяном і Внутрішньою Монголією географічна ізоляція спричинила диференціацію та ізоляцію міжCistanche deserticolaпопуляцій, і дві популяції сформували різні генетично різні екотипи завдяки адаптації до місцевих умов існування. Через вузький ареал поширення та часті обміни генами між популяціями генетична диференціація серед популяцій менша, ніж у Cistanche deserticola.
3.4 Рекомендації щодо захисту цистанчі
Генетичне різноманіттяє необхідною умовою довгострокового виживання видів, щоб уникнути вимирання. Зменшеннягенетичне різноманіттязменшить здатність популяцій адаптуватися до змін середовища як у короткостроковій, так і в довгостроковій перспективі [11]. Тому захист генетичного різноманіття цистанхе є дуже важливим для захисту цього рідкісного та дорогоцінного китайського ліки. Оскільки Cistanche є видом з особливим екологічним типом, його слід переважно охороняти in situ, а природну охоронну базу Cistanche слід створити відповідно до його генетичного різноманіття. Наприклад, дляЦистанка трубчаста, оскільки генетичне різноманіття в основному походить від популяції, популяції з великим генетичним різноманіттям будуть пріоритетними об’єктами захисту [12], такі як Angier Мінфена та Daheyan Yutian можуть бути. Він внесений до списку природних охоронних баз Cistanche. Що стосуєтьсяCistanche deserticola, популяції Внутрішньої Монголії та Сіньцзяну зазнали значних змін, тому слід посилити експериментальні дослідження, щоб визначити популяції, які є пріоритетними для захисту. Водночас провести фундаментальні дослідження репродуктивної біології та екології запилення цистанхеї, щоб отримати інформацію для її подальшого захисту.
Список літератури
[1] Хе Яньпін, Інь Чжечжу, Ту Пенфей та ін. ІдентифікаціяЦистанхета дослідження комерційних лікарських матеріалів. Китайські лікарські матеріали, 1997, 20(3):117.
[2] Лю Мінтін. Комплексне дослідження та загальне застосування рослин Тамарикс. Lanzhou: Lanzhou University Press, 1995.
[3] Фу Гуолі. Червона книга китайських рослин. Пекін: Science Press, 1992.
[4] Управління імпорту та експорту видів, що знаходяться під загрозою зникнення, Китайської Народної Республіки, Науковий комітет зникаючих видів Китайської Народної Республіки. Конвенція про міжнародну торгівлю видами дикої фауни і рослин, що перебувають під загрозою зникнення (CITES), Додаток II. 2003.41.
[5] Zou Yuping, Wang Xiaoquan, Lei Yiding та ін. Вилучення та ідентифікація повної ДНК кількох зникаючих рослин та їхніх родичів. Acta Botany, 1994, 36:528.
[6] Wang Hongxin, Hu Zhiang. Система селекції рослин, генетична структура та охоронагенетичне різноманіття. Біорізноманіття, 1996, 4(2): 92.
[7] Чень Цзякуань, Ян Цзі. Еволюційна біологія рослин. Wuhan: Wuhan University Press, 1994.
[8] Ван Сяоцюань, Цзоу Юпін, Чжан Дамін та ін. RAPD аналіз генетичного різноманіття ялиці звичайної. Китайська наука (C), 1997, 40(2): 145.
[9] Пей Яньлун, Цзоу Юпін, Інь Чжень та ін. Попередній звіт про RAPD-аналіз півонії карликової та фіолетової. Китайський журнал таксономії рослин, 1995, 33(4): 350.
[10] Чжан Цзюань, Інь Лінке, Чжан Даоюань. Попереднє дослідженняГенетичне різноманіттяприродних популяцій тамарикса ланцетного. Yunnan Botanical Research, 2003, 25(5):557.
[11] Ellstrand NC, Elam D R. Популяційно-генетичні наслідки малого розміру популяції: наслідки для збереження рослин. Річний огляд Екологія та систематика, 1993, 34:217.
[12] Лю Чжаньлінь, Чжао Гуйфан. Принцип популяційної генетики та його застосування в охороні рідкісних і зникаючих рослин. Біорізноманіття, 1999, 7(4): 340.
З: China Journal of Chinese Materia Medica; том. 29, випуск 8 серпня 2004 р
