Cd73 Надмірна експресія в подоцитах: новий маркер пошкодження подоцитів при хворобі нирок людини
Feb 26, 2022
Абстрактний:Шлях CD73 є важливим протизапальним механізмом у різних умовах захворювання. Спостереження на моделях мишей припускали, що CD73 може мати захисну роль уураження нирок,; однак прямих доказів його ролі в людині немаєзахворювання нирок,була описана на сьогоднішній день. Тут ми висунули гіпотезу про те, що травма подоцитів у людинизахворювання нирок,змінює експресію CD73, що може полегшити діагностику подоцитопатії. Ми оцінили експресію CD73 і однієї з його функціонально важливих мішеней, рецептора хемокіну C-C 2 типу (CCR2), в подоцитах зниркабіопсії 39 хворих на подоцитопатію (включаючи вогнищевий сегментарний гломерулосклероз (ФСГС), хворобу з мінімальною зміною (МКД), перетинчастий гломерулонефрит (МГН) і амілоїдоз) і контрольну групу. Експресія Podocyte CD73 в кожній з груп захворювання була значно збільшена в порівнянні з контролем (p< 0.001–p="">< 0.0001).="" moreover,="" there="" was="" a="" marked="" negative="" correlation="" between="" cd73="" and="" ccr2="" expression,="" as="" confirmed="" by="" immunohistochemistry="" and="" immunofluores-="" cence="" (pearson="" r="−" 0.5068,="" p="0.0031;" pearson="" r="−" 0.4705,="" p="0.0313," respectively),="" thus="" suggesting="" a="" protective="" role="" of="" cd73="">ураження нирок,.Нарешті, ми ідентифікуємо CD73 як новий потенційний діагностичний маркер людських подоцитопатій, особливо МХД, який був відомий відсутністю патологічних особливостей, впізнаваних світловою мікроскопією та імуногістохімією.
Ключові слова:подоцити; мінімальна зміна захворювання; CD73; CCR2;ураження нирок;ниркова недостатність,
Введення
Еволюційно-вирішальна роль аденозинтрифосфорної кислоти (АТФ) як всюдисущого внутрішньоклітинного джерела енергії була оновлена більше трьох десятиліть тому з революційним уявленням про те, що члени пуринергічної системи (АТФ, аденозин ді- і трифосфат (АДФ і АМФ відповідно) також можуть подавати позаклітинні сигнали для посередництва клітинних взаємодій [ 1 , 2 ]. Ця концепція привела до розуміння того, що пуринергічна система бере участь у формуванні імунних реакцій за допомогою модуляції профілю експресії рецепторів, секреції цитокінів, вироблення реактивних видів кисню (АФК) і внутрішньоклітинного перетравлення патогенів [3–7]. Позаклітинні АТФ піддаються перетворенню/дефосфорилюванню в АДФ і АМФ через CD39 (екто-нуклеозидтрифосфатдифосфогідролаза 1) і, нарешті, АМФ деградує до аденозину cd73 (екто-5 0 нуклеотидаза) [ 8 ]. CD73 може бути присутнім у мембранно-зв'язаній або розчинній формі. Мембранна форма має димер-структуру, що складається з двох однакових субодиниць 70 kD, які зв'язуються з плазматичною мембраною через зв'язок між С-кінцевим серином і глікозилфосфатидиловим інозитолом (ГПІ) [ 9 ]. Примітно, що CD39 субстрати АТФ і АДФ виявляються конкурентними інгібіторами CD73 [ 9 - 11 ]. Експресія CD73 представляє, таким чином, критичний шлях налаштування рівня аденозину в позаклітинному просторі. CD73 не є молекулою, специфічною для клітини або органу; його експресія на лейкоцитах, ендотелії, епітеліальних або мезенхімальних клітинах різних органів (нирка, легені, печінка, товста кишка, мозок і серце) і стовбурові клітини були добре задокументовані [ 12 - 14 ]. Про захисну роль аденозину через оксид азоту (NO)-шлях синтезу при травмі, викликаній ішемією печінки, вперше повідомили Peralta et al. [ 15 ]. Відповідно до цих даних, було показано, що його дія пом'якшує гостре ураження легень, відторгнення алотрансплантатних дихальних шляхів, гостру хворобу трансплантата проти хазяїна та сепсис [4,16–19].
CISTANCHE ПОКРАЩИТЬ НИРКОВУ/НИРКОВУ НЕДОСТАТНІСТЬ
Як переконливо продемонстровано в декількох моделях миші, CD73 може брати участь у тубуло-клубочковій взаємодії внирка. Було показано, що CD73-опосередкована генерація аденозину, отримана CD73 з АТФ трубчастого походження під час ішемії-реперфузійного пошкодження, послаблює запалення через інгібування ефекторної функції нейтрофілів [ 20 ]. Більш того, У CD73-дефіцитних мишей проявляється аутоімунне запалення, яке супроводжується зниженою кількістю подоцитів і ендотеліальних фенестраціях [ 21 ]. Це явище було пов'язане з підвищенням рівня прозапальних цитокінів у сироватці крові, таких як фактор некрозу пухлин (ФНП)-альфа або ліганд мотиву хемокіну С-Х-С 2 (CXCL-2). В умовах людської обстановкизахворювання нирок,було постульовано, що пошкодження подоцитів, ймовірно, являє собою суміш адаптивних і деструктивних механізмів клітинної відповіді на патологічні подразники, не обов'язково відображаючи опубліковані спостереження з in vitro або моделей тварин. Етіологія травми подоцитів варіюється від механічного впливу (гіперфільтрація клубочків), окисного стресу (як при гіпертонічній або діабетичній нефропатії, токсичної травми, запальної інфільтрації клітин або тваринних моделей мінімальної зміни захворювання) до імунологічного стресу (тобто імунного комплексу і комплементу опосередкованого пошкодження при гломерулонефриті) [ 22 ]. Запальна установка гломерулонефриту може стимулювати подоцити до синтезу різних цитокінів, потенційно через CC хемокіновий рецептор 2 (CCR2), опосередкований сигналізацією. Тим не менш, мало що відомо про роль CD73 в людинізахворювання нирок,, особливо в умовах хронічного запалення та травми подоцитів.
У цьому дослідженні ми висунули гіпотезу про те, що CD73 відіграє роль у патогенезі клубочкових захворювань людини та проаналізували експресію podocyte CD73 у людининиркабіопсії у пацієнтів з патологіями, пов'язаними з подоцитопатією. Ми демонструємо, що поверхнева експресія подоцитів CD73 є надійним маркеромподоцитедажу, таким чином, включичні підтримують діагностичне значення CD73 при мінімальній зміні захворювання (МКД). Більше того, ми повідомляємо про негативну кореляцію між експресією podocyte CCR2 та CD73, що свідчить про те, що надмірна експресія CD73 являє собою адаптивну відповідь на ураження клубочків.
Результатів
Клінічні дані та ультраструктурна візуалізація пошкодження подоцитівУ таблиці 1 викладено клінічну картину випадків, включених до дослідження, щодо віку, статі, креатиніну та загальних значень протеїнурії. Усі пацієнти з ФСГС мали первинну форму NOS (не вказано інакше). Серед 12 пацієнтів з МГН 5 були рецепторами фосфоліпази А2 (PLA2R)-позитивними (42%). У групі амілоїдозу 2 пацієнти хворіли на АА-амілоїдоз (16,7%) та 10 АЛ-амілоїдоз (83,3%); у 2 пацієнтів з АЛ-амілоїдозом світловий ланцюг каппа був очевидним (20%) і 8 були позитивними на лямбду (80% групи АЛ-амілоїдозу). У всіх пацієнтів з МСД, ФСГС, МГН і амілоїдозом пошкодження подоцитів було чітко виявлено за допомогою електронної мікроскопії (рис. 1).
Малюнок 1. Ультраструктурне зображення первинного і вторинного пошкодження подоцитів. ( а ) Поширення тіла подоцитів на клубочкову базальну мембрану (стрілку) з втягуванням стопних відростків у випадку МКД. (b) Екстенсивний процес подоцитів стопи випорожнення (стрілка) і цитоплазматична вакуолізація (зірка) у пацієнта з первинною ФСГС. (c) Випорожнення процесу стопи (стрілка), вакуолізацію та видатні органели (подвійна стрілка) з підстилаючим епімембранозним електронно-щільним матеріалом (зіркою) у первинному плівчастому гломерулонефриті. г ) Субепітеліальне накопичення амілоїдів-фібрил (двоголова стрілка) з послідовним відшаруванням подоцитів (як ознака незворотного пошкодження подоцитів) у хворого на АЛ-амілоїдоз (лямбда). Всі електронні мікрофотографії представлені на 4000 × збільшенні. Вставки — відповідні світлові мікроскопії фотомікрографи (40 × /0,65 NA; розмір шкали: 50 мкм в (a,c,d) і 100 мкм в (b); PAS-фарбування).
Експресія поверхні CD73 пов'язана з пошкодженням подоцитів при хворобі нирок людини
Для дослідження того, чи експресують подоцити CD73 у фізіологічних умовах, і для оцінки інтертернуCD73indifferentdiseasesettingsrelatedtopodocytedamage,weperformedim- munohistochemical analysis експресії CD73. Ультраструктурний аналіз підтвердив пошкодження подоцитів як нерегулярність цитоскелету з принаймні випорожненням процесу стопи (рис. 1). У нашій негативній контрольній групі без ураження подоцитів не може бути виявлено жодної значної експресії подоцитів CD73, незважаючи на позитивність внутрішнього контролю (перитубулярних капілярів), який зазвичай забарвлює позитивний колір (рис. 2). З іншого боку, групи пошкоджень подоцитів (MCD, FSGS, MGN і амілоїдоз) показали статистично дуже значну апрегуляцію подоцитів CD73 (p< 0.0001);="" the="" significant="" increase="" was="" consistent="" also="" when="" comparing="" single="" entities="" with="" negative="" controls="" (p="" at="" least="">< 0.001).="" interestingly,="" the="" extent="" of="" cd73="" upregulation="" tended="" to="" be="" lower="" in="" the="" mcd="" group,="" albeit="" significantly="" lower="" only="" in="" comparison="" with="" mgn="" samples="" (p="0.0043)" (figure="" 2).="" in="" podocyte="" damage="" groups,="" there="" was="" no="" correlation="" between="" semiquantitative="" cd73="" score="" and="" proteinuria="" on="" binary="" (nephrotic/non-nephrotic)="" or="" quantitative="" (g/24="" h)="" level="" (spearman="" r="−" 0.0807,="" p="0.6302" and="" spearman="" r="−" 0.076,="" p="0.6497," respectively;="" figure="" 3a).="" overall,="" there="" was="" no="" correlation="" between="" cd73="" score="" and="" creatinine="" level="" (spearman="" r="0.0722," p="0.6259;" figure="" 3b).="" additionally,="" we="" could="" not="" detectsignificant="" correlation="" between="" cd73="" expression="" and="" hypertension="" (spearman="" r="−" 0.03024,="" p="0.8384)" or="" diabetes="" mellitus="" (spearman="" r="−" 0.1784,="" p="">
Апрегуляція CD73, отриманого з подоцитів, при клубочковій хворобі людини негативно корелює з експресією рецептора CCR2 і не корелює з експресією нефрину та подоцинуОцінюючи опубліковані дані про зниження регуляції експресії макрофага CCR2 після надмірної експресії CD73 в моделі стовбурових клітин, ми висунули гіпотезу про те, що апрегуляція CD73 під час травми подоцитів обернено корелює з експресією прозапального CCR2 і проведеного імуногістохімічного аналізу CCR2. У контрольній групі не можна було виявити жодного або лише м'якого вираження CCR2, без суттєвої невідповідності в порівнянні з підписом CD73 в тих же зразках. На відміну від цього, в основному значна апрегуляція поверхні CCR2 (але різної інтенсивності) могла спостерігатися в більшості зразків з біопсій подоцитів-пошкоджень і, як правило, була регульована в порівнянні з контрольною групою (p = 0,0206; Додатковий малюнок S1). Групи хвороб істотно не відрізнялися один від одного в цьому плані.
Далі ми проаналізували потенційну кореляцію між інтенсивністю експресії CD73 і CCR2. Дійсно, порівнюючи оцінки CD73 і CCR2 з когорти біопсії подоцит-травматизму, можна було спостерігати помітну негативну кореляцію (Спірмен r = − 0,4821, p = 0,0052), (рис. 4). Слід зазначити, що клубочки з CD73-позитивними подоцитами, як правило, демонстрували знижену експресію CCR2 не тільки в подоцитах, але і в навколишніх клітинах, таких як тім'яні епітеліальні клітини (рис. 4). Зворотна кореляція була підтверджена оцінкою імунофлюоресцентного спільного фарбування cd73/CCR2 в пошкоджених подоцитах шляхом конфокальної мікроскопії (Спірмен r = − 0,4478, p = 0,0282), (рис. 5). Щоб вирішити можливий зв'язок між позитивом CD73 і (втратою) експресії білка, специфічної для подоцитів, ми провели додаткові імунофлюо-ресуцентні фарбування для нефрину і подоцину і оцінили їх схему експресії в контролі, групи MCD і FSGS (рисунок 6a), а також спільне фарбування з CD73 в зразках з ураженням подоцитів (рис. 6б–е). Ми не змогли виявити значну кореляцію між середньою інтенсивністю флуоресценції експресії подоцину або нефрину з одного боку, і середнім виразом CD73 з іншого (n = 39, Spearman r = 0,212, p = 0,1948 для подоцину і n = 60, Спірмен r = 0,01906, p = 0,8851 для нефрина).
Обговорення
Опишемо тут вперше вираз CD73 на поверхні травмованих подоцитів у людинизахворювання нирок,. АналізуНирковабіопсії від пацієнтів з вираженим пошкодженням подоцитів, такими як при МКД, ФСГС, МГН та амілоїдозі, ми повідомляємо про значну апрегуляцію експресії подоцитів CD73 у кожній з цих груп порівняно з контролемНирокнезалежні від етіології пошкодження подоцитами. Більше того, ми повідомляємо про зворотну кореляцію між експресією CD73 та CCR2 подоцитами подоцитів груп пошкодження подоцитів. Було показано, що підвищений подоцитоспецифічний CCR2 опосередковує діабетикаураження нирок,у мишей [ 23 ]. Крім того, повідомлялося, що блокада CCR2 в індукованій адріаміцином муріновій моделі ФСГС знижує протеїнурію і травму клубочків [ 24 ]. Недавнє дослідження Лі та ін., також з використанням моделі миші, вказує на те, що виснаження CCR2 може покращити альбунурію, викликану ожирінням, через блокаду окисного стресу та накопичення ліпідів [ 25 ]. Дійсно, в системі in vitro, що використовує мезенхімальні стовбурові клітини (MSC) з тканини перикардію мурину, було показано, що CD73-надмірноекспресивні МСК диктують репаративні процеси через протизапальну активність, серед інших факторів також пов'язані з інгібуваннямCCR2-позитивної інфільтрації макрофагів [ 13 ]. Отже, у світлі наших результатів та опублікованих даних спокусливо постулювати, що експресія CD73 подоцитами може діяти захисно вураження нирок,, можливо, через шляхи, які послаблюють CCR2. Сигналізація CCR2 тісно пов'язана з адгезією і активацією макрофагів [ 26 , 27 ]. Оскільки макрофаги можуть впливати на патогенез пов'язаних з подоцитопатієюзахворювання нирок,(як первинний МГН, де інфільтрація CD68 + , CCR2 + макрофагів була визнана значущим показником кінцевої стадіїниркова недостатність,[ 28 ]), подальші дослідження зв'язку між вмістом моноцитів/макрофагів, походженням (проникнення проти резидента), профілями активації (M1—прозапальне проти М2—альтернативно активоване) та експресією CD73 у людинизахворювання нирок,необхідні для перевірки відповідності наших результатів попереднім даним з моделей Муріну.
При запальному мікроміліє, який може спостерігатися при гіпоксії, ішемії-реперфузії або аутоімунному ураженні тканин, множинні клітини вивільняють членів пуринергічної сигнальної системи, переважно у вигляді прозапальних АТФ або АДФ [ 29 , 30 ]. У цих умовах екто-нуклеотидазаCD73anditsproductadenosineareimportantfactorsinimmune регуляція реагування і замовчування. На моделях тварин CD73 було показано, що він є захисним униркареперфузійний травма ішемії та її дефіцит індукували дисфункцію подоцитів, що призвело до аутоімунного запалення тазахворювання нирок,[ 21 , 31 ]. Інші експерименти миші in vivo з використанням реперфузії-травми ішемії виявили важливий протизапальний вплив CD73, виражений проксимальними трубчастими епітеліальними клітинами, та його вирішальну дію внирказахист під час діабетичної нефропатії за допомогою сигналізації аденозин–ендотеліального рецептора Адора2б [20,32]. Подоцитопатії - найчастіша група клубочкових уражень, що призводять до білково-урії. МКД, прототип «первинної» подоцитопатії, є найбільш поширеною причиною нефротичної протеїнурії у дітей > 1 року [ 33 , 34 ]. Сучасні гіпотези про патогенез МКД свідчать про значну роль цитокінів та інших імунних медіаторів у порушенні цілісності подоцито-клубочкової базальної мембрани [ 35 – 38]. Невідповідність між відсутністю видимих змін світлової мікроскопії і важкою протеїнурією є відмінною рисою МКД; ультраструктурні докази пошкодження подоцитів електронною мікроскопією, таким чином, є conditio sine qua non для діагностики МКД на сьогоднішній день. Даний алгоритм діагностики підкреслює значимість подальших засобів діагностики першої лінії в цьому відношенні. Таким чином, дослідження експресії CD73, особливо в умовах обмеженої доступності електронної мікроскопії, може допомогти диференціювати клубочкові (тобто подоцитопатичні) та позагломерулярні (наприклад, трубчасті або парапротеїнемічні) джерела протеїнурії. Порівняння між імуногістохімією та імунофлюоресценцією в нашому дослідженні говорило б на користь останнього.
CISTANCHE ПОКРАЩИТЬ ЗАХВОРЮВАННЯ НИРОК/НИРОК
Кілька публікацій переконливо задокументували аберантний розподіл і втрату подоцитоспецифічних білків у різнихзахворювання нирок,налаштування, які включають травму подоцитів і протеїнурію, як недавно переглянуто [ 39 ]. У нашому дослідженні, в межах групи подоцитів-пошкоджень, ми не змогли виявити значну кореляцію між інтенсивністю флуоресценції подоцину/нефрину та інтенсивністю експресії CD73. Однак специфічні обмеження виключають патофізіологічну інтерпретацію статистичних даних подоцин/нефрин проти CD73. По-перше, для оцінки інтенсивності флуоресценції ми відібрали подоцити з використанням технічного збільшення та роздільної здатності конфокальної мікроскопії. Хоча ці умови легко дозволяють виявляти тіла подоцитів, основні процеси і особливо стопні процеси залишаються невиразними, отже, можливо, не позначені/проаналізовані. По-друге, кореляція між експресією CD73 і подоцитоспецифічних білків у цілих клубочках не може бути виправдана: хоча оцінка подоцину і нефрину на цьому рівні була б законною (оскільки розумно припустити, що ніякі інші клубочкові клітини не експресують ці білки), це не може бути заявлено для CD73, який частково виражений принаймні ендотеліальними клітинами. По-третє, оцінка лише середньої інтенсивності флуоресценції як незалежного маркера травми подоцитів є сумнівною, оскільки не охоплює патологічну, зернисту схему розподілу подоцитів та нефрину всередині клубочка, яку ми могли б чітко спостерігати на рисунку 6. Тому ми неохоче відносимо відсутність кореляції CD73-подоцину та CD73-нефрину в нашому аналізі з розбіжними молекулярними шляхами цих маркерів. Подальші дослідження podocyte in vitro та на тваринах необхідні для вивчення можливих перешкод між цими сигнальними каскадами.
У сукупності, визнаючи невеликий розмір вибірки основним обмеженням нашого дослідження, ми демонструємо тут неконсистентну надмірну експресію CD73 травмованими подоцитами і пропонуємоCD73 як новий діагностичний маркер подоцитопатії. При мінімальних змінах захворювання наші результати можуть допомогти виявити пошкоджені подоцити і призвести до менш трудомісткого і витратного діагностичного процесу. Крім того, наші результати відповідають опублікованим даним експериментальних підходів Murine і свідчать про захисну взаємодію між CD73 і CCR2 у людинизахворювання нирок,. Подальші багатоцентрові дослідження з більшими когортами пацієнтів необхідні для усунення механізмів сигналізації CD73 у людининирказахворювання і його прогностичне значення. Аналогічно, більші когортні числа були б необхідні для встановлення потенційної кореляції між тяжкістю захворювання та експресією CD73.
Матеріал і методи
Когорта вивченняЗагалом 49 біопсій, включених до цього дослідження, у 49 різних пацієнтів були діагностовані в період з 1 січня 2018 року по 31 грудня 2019 року в університетській лікарні Мангейма, Гейдельберзький університет. Подальшими критеріями відбору були репрезентативна біопсія з можливістю проведення потрійної діагностики з імуногістохімією та ЕМ, адекватна клінічна інформація, чітка діагностика та достатній матеріал для цього дослідження. Всі хворі були дорослими і кавказцями. Дослідження охопили 39 біопсій від пацієнтів з пошкодженням подоцитів різної етіології (7 біопсій у пацієнтів з первинним вогнищевим сегментарним гломерулосклерозом—ФСГС; 8 від хвороби з мінімальною зміною—МЦД; 12 від пацієнтів з плівчастим гломерулонефритом—МГН; 12 від пацієнтів з амілоїдозом). Негативний контроль бувниркабіопсії від 10 хворих без ураження подоцитами та без протеїнурії (6 хворих на нефросклероз легкого ступеня, 2 хворих на інтерстиціальний нефрит та 2 пацієнтів без патологічних змін). Всі перераховані вище біопсії були включені в аналіз експресії podocyte CD73; для CCR2, після виключення парафінових відділів з недостатньою кількістю несклеротичних клубочків (<5), we="" performed="" analysis="" of="" surface="" expression="" and="" of="" correlation="" with="" cd73="" signature="" in="" 6="" samples="" from="" fsgs,="" 8="" from="" mcd,="" 10="" from="" mgn="" and="" 8="" from="" the="" amyloidosis="" group.="" in="" the="" ccr2="" analysis,="" the="" control="" group="" consisted="" of="" 6="" biopsies.="" relevant="" clinical="" data="" were="" collected="" from="" electronic="" medical="" records="" (table="" 1).="" informed="" consent="" was="" waived="" because="" of="" the="" retrospective="" nature="" of="" the="" study,="" because="" of="" the="" fact="" that="" anonymous="" clinical="" data="" were="" used="" for="" analysis="" and="" because="" the="" study="" was="" performed="" on="" already="" existing="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" after="" completing="" the="" diagnostic="" process,="" as="" approved="" by="" the="" ethic="" committee="" of="" the="" university="" medical="" centre="" mannheim,="" university="" of="" heidelberg="" (reference="" number:="">
Гістологія, імуногістохімія, імунофлюоресценція та електронна мікроскопіяПослідовні секції площею 1 μ м були зроблені на парафіні-вбудованіниркабіопсія та фарбування гематоксиліном/еозином (Н/Е), періодичною кислотою-Шиффом (PAS), трихромним фарбуванням Массона, а також стандартною рутинною імуногістохімією в діагностичних цілях. Імуногісто- хімічне та імунофлюоресцентне фарбування вбудованих біопсій формаліну парафіну, для яких проводилося вручну з використанням моноклональних антитіл кролячих анти-людських CD73 (клон D7F9A, Cell Signaling, Франкфурт-на-Майні, Німеччина) та мишачих моноклональних антилюдських антитіл CCR2 (клон клон 7A7; Abcam, Кембридж, Великобританія), кролячі поліклональні антилюдські антитіла до нефрину (Abcam, Cambridge, Великобританія) і антитіла до подоцитів проти людини проти людини (Sigma, Saint Louis, MO, США), згідно з протоколами виробника. Всі біопсії були включені в аналіз експресії podocyte CD73 шляхом імуногістохімії; для CCR2 парафінові відділи з недостатньою кількістю несклеротичних клубочків (<5) were="" excluded.="" to="" minimize="" the="" noise,="" antibody="" optimization="" for="" immunohistochemistry="" was="" performed="" using="" control="" (tonsil)="" tissue.="" the="" tissue="" sections="" were="" stained="" with="" dako="" real="" detection="" system="" alkaline="" phosphatase/red="" rabbit/mouse="" kit="" (agilent,="" santa="" clara,="" ca,="" usa)="" and="" avidin/biotin="" blocking="" kit="" (vector="" laboratories,="" burlingame,="" ca,="" usa).="" antigen="" retrieval="" was="" performed="" for="" 20="" min="" using="" dako="" target="" retrieval="" solution="" (equivalent="" citrate="" buffer,="" ph="" 6.0).="" primary="" antibodies="" were="" incubated="" for="" 60="" min="" in="" dako="" antibody="" diluent="" with="" 2%="" dry="" milk="" at="" 37="" ◦="" c="" and="" detected="" using="" the="" dako="" real="" link,="" biotinylated="" secondary="" antibodies="" (included="" in="" the="" kit),="" and="" dako="" real="" streptavidin="" alkaline="" phosphatase="" (ap).="" the="" reaction="" was="" visualized="" by="" a="" red="" chromogen="" (included="" in="" the="" kit).="" the="" slides="" were="" counterstained="" with="" hematoxylin,="" dehydrated,="" mounted="" using="" aquatex="" (merck,="" darmstadt,="" germany)="" and="" cover-slipped.="" for="" immunofluorescence,="" ccr2/cd73="" co-expression="" was="" evaluated="" in="" total="" of="" 22="" podocytes="" from="" all="" podocyte="" lesion="" groups.="" cd73="" was="" stained="" with="" alexa="" flour="" tm="" 488="" tyramide="" superboost="" tm="" kit,="" streptavidin="" (invitrogen,="" thermo="" fisher,="" waltham,="" ma,="" usa)="" using="" secondary="" biotinylated="" anti-mouse="" antibody="" (biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" secondary="" antibodies="" for="" the="" immunofluorescence="" were="" donkey="" anti-mouse="" cf="" 594="" and="" donkey="" anti-rabbit="" cf="" 594="" (both="" from="" biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" for="" electron="" microscopy,="" biopsies="" were="" post-fixed="" with="" 1%="" osmium="" tetroxide="" (roth,="" karlsruhe,="" germany),="" embedded="" in="" agar="" 100="" resin="" (agar="" scientific,="" stansted,="" uk),="" cut="" at90nm="" thickness="" andstained="" with1%="" uranylacetate(serva,="" heidelberg,="" germany).="" micro-graphs="" were="" taken="" on="" transmission="" electron="" microscope="" jem-1400="" (joel,="" freising,="">
CISTANCHE ПОКРАЩИТЬ ВИТІКАННЯ НИРОК/НИРОК
Світлова мікроскопія та морфометричний аналізЗбір та аналіз зображень проводився за допомогою скануючого мікроскопа PreciPoint M8 з цільовим × Olympus PlanCN 40 × /0,65 та програмним забезпеченням MicroPoint (т.5 травня 2016 року; PreciPoint, Фрайзінг, Німеччина). Напівквалантитаційна оцінка експресії поверхні подоцитів CD73 при імуногістохімічному фарбуванні оцінювалася за допомогою шкали оцінки 0–3 (0—без експресії; 1— вогнищева сегментарна позитивність (<50% podocytes="" positive="" in=""><50% glomeruli);="" 2—focal="" global="" (="">50% подоцитів позитивні в<50% glomeruli);="" 3—diffuse="" (any="" percentage="" of="" podocytes="" positive="" in="">50% клубочків). CD73 позитивні та негативні подоцити були проаналізовані на предмет спільної експресії CCR2 за допомогою напівкваліцитивної системи оцінювання на основі інтенсивності (0 — без експресії, 1 — слабка експресія, 2 — помірна експресія та 3 — сильна експресія, відповідно до біопсійно-внутрішнього позитивного контролю CCR2 — ендотелію та проникнення в імунні клітини). Оцінка проводилася самостійно двома патологоанатомами (СП і ЗП) в засліпленому порядку.
Конфокальна мікроскопіяЗображення CD73 (Alexa Fluor 488), CCR2 (Alexa Fluor 594) і ядер (DAPI) подоцитів були придбані послідовно з моторизованим конфокальним мікроскопом Olympus FV1000, оснащеним HeNe 594 nm, Argon 488 nm і УФ-діодом 405 nmlaser і фотомультиплікаторними трубками (PMTs), керованими програмним забезпеченням FluoView, з використанням мети 60 × /1.35 UPlanSApo. 12-бітові зображення з кадрами розміром 512 × 512 пікселів і розміром пікселів 0,41 μ м для оглядів і 0,10 μ м для високої роздільної здатності були придбані, зберігаючи всі налаштування на мікроскопі постійними. Зображення були додатково напівавтоматично оброблені та проаналізовані за допомогою власного розробленого макросу ImageJ (дата доступу: 15 грудня 2020 року). Незабаром зображення були сегментовані для окремих подоцитів, був застосований поріг, а середня інтенсивність виміряна, статистично проаналізована і побудована. Всі зображення оброблялися з постійними налаштуваннями і відображалися з однаковим псевдоколом, однаково лінійно налаштованим для окремих каналів на об'єднаних зображеннях
Статистичний аналізСтатистичні аналізи були виконані у використанніgraphPadPrismv. 8.4.3Соціка (GraphPad Software, Inc., Ла-Джолла, Каліфорнія, США). Всі дані повідомляються як середні ± SEM. Статистичні відмінності були розраховані за допомогою парного або непарного t-тесту, а також кореляційного аналізу Пірсона, як зазначено.