Короткочасна інгаляція севофлурану може зменшити утворення гліальних рубців після гіпоксично-ішемічної травми головного мозку у новонароджених щурів. Частина 1

Анотація

Попередні дослідження показали, що посткондиціонування севофлураном може забезпечити нейропротекторію після гіпоксично-ішемічної травми та покращити функцію навчання та пам’яті в мозку гризунів, що розвивається.

Під гіпоксично-ішемічним ушкодженням розуміють патологічний стан, обумовлений ішемією головного мозку, гіпоксією, порушенням обміну речовин, пошкодженням нервових клітин внаслідок порушень серцево-судинної та цереброваскулярної систем. З прогресом суспільства та зміною способу життя гіпоксично-ішемічна травма стає все більш поширеною. Цей стан може завдати шкоди здоров’ю людини, в тому числі вплинути на інтелект і пам’ять.

Хоча гіпоксія та ішемія можуть призвести до зниження функції мозку, це не означає, що це негативно вплине на пам’ять. Навпаки, ми можемо покращити пам'ять і підвищити ефективність мозку за допомогою правильних методів. Ось кілька способів покращити пам’ять:

1. Здорове харчування: вплив дієти на пам’ять дуже важливий. Їжа, багата білком, вітамінами та мінералами, може допомогти підтримувати здорову нервову систему та функції мислення.

2. Більше займайтеся фізичними вправами: фізичні вправи можуть сприяти кровообігу, збільшити приплив кисню, підвищити імунітет організму та зменшити ризик захворювань. За допомогою вправ ви можете покращити свою пам’ять.

3. Зміцнюйте впевненість у собі: впевненість є важливим фактором пам'яті людини. Якщо ви вірите, що можете виконати певне завдання, ви легко досягнете бажаних результатів, а також зможете ефективно покращити свою пам’ять.

Як видно, гіпоксично-ішемічне ураження не є станом, який неминуче зашкодить пам'яті людини. Поки ми володіємо правильними методами та дбаємо про свій мозок, ми можемо прийняти здорове майбутнє з позитивним настроєм. Можна побачити, що нам потрібно покращити пам’ять, і Cistanche deserticola може значно покращити пам’ять, оскільки Cistanche deserticola є традиційним китайським лікарським матеріалом, який має багато унікальних ефектів, одним із яких є покращення пам’яті. Ефективність Cistanche deserticola пояснюється багатьма активними інгредієнтами, які він містить, включаючи дубильну кислоту, полісахариди, флавоноїдні глікозиди тощо. Ці інгредієнти можуть сприяти здоров’ю мозку різними шляхами.

Натисніть «Знай 10 способів покращити пам’ять».

Класичну модель Райса-Ваннуччі використовували для індукції гіпоксично-ішемічного ушкодження, а новонароджених (постінатальний день 7) щурів лікували 2,4% севофлураном протягом 30 хвилин після гіпоксично-ішемічного ушкодження.

Наші результати показали, що посткондиціонування севофлураном значно покращило функцію навчання та пам’яті щурів, зменшило астрогліоз і утворення гліальних рубців, збільшило кількість дендритних шипів і захистило гістоморфологію гіпокампу. Механічно посткондиціонування севофлураном зменшувало експресію фон Гіппеля-Ліндау фактора, індукованого гіпоксією-1, і підвищувало експресію DJ-1.

Ін’єкція 1,52 мкг інгібітора YC-1 фактора, що індукує гіпоксію-1 (Lificiguat) у лівий бічний шлуночок за 30 хвилин до гіпоксично-ішемічного ушкодження скасувала нейропротекторію, індуковану севофлураном. Це відкриття свідчить про те, що севофлуран може ефективно полегшити астрогліоз у гіпокампі та зменшити порушення навчання та пам’яті, спричинені утворенням гліального рубця після гіпоксично-ішемічного ушкодження.

Основний механізм може бути пов’язаний із посиленою експресією DJ{0}}, зниженою повсюдною експресією фактора, індукованого гіпоксією-1, і стабілізованою експресією фактора, індукованого гіпоксією-1. Це дослідження було схвалено Комітетом з догляду за лабораторними тваринами Китайського медичного університету, Китай (номер затвердження 2016PS337K) 9 листопада 2016 року.

Ключові слова: черепно-мозкова травма; мозок; Центральна нервова система; в природних умовах; травма; модель; пластичність; щур; відновлення; регенерація; repairКитайська бібліотечна класифікація № R453; R741; R614.2+1.

вступ

Неонатальна гіпоксично-ішемічна енцефалопатія (ГІЕ) є поширеним ускладненням у період новонародженості, спричиненим багатьма факторами, такими як неонатальна асфіксія, внутрішньоутробний дистрес і захворювання гіалінемембрани (Douglas-Escobar and Weiss, 2015; Barkhuizen et al., 2017).

HIE є основною причиною дитячої смертності та основним джерелом неврологічних ускладнень (Edwards та ін., 2010; Descloux та ін., 2015). Дев’яносто відсотків тих, хто пережив HIE, мають довгострокову неврологічну дисфункцію, таку як порушення навчання, когнітивні та моторні дисфункції, а також епілепсію (Doi та ін., 2012; Davies та ін., 2019). Сучасне лікування HIE в основному зосереджено на симптоматичному лікуванні, включаючи штучну вентиляцію легенів, корекцію гіпотензії, додаткове введення глюкози та обмеження споживання рідини, якщо це доречно.

Однак потрібне ефективне лікування, здатне скасувати або зменшити довгострокове пошкодження мозку (Stankowski and Gupta, 2011; Davidson et al., 2015). Як ключова частина навчання та розпізнавання, гіпокамп, у тому числі зубчаста звивина (DG) , CA1 і CA3 області, беруть участь у перетворенні та інтеграції периферичної інформації в нервові центри (Morris et al., 2012; Jung et al., 2020).

Гіпокамп є гіперчутливим до гіпоксично-ішемічного (HI) пошкодження, яке може спровокувати апоптоз гіпокампневронів, стимулювати надмірний реактивний гліоз і призвести до утворення гліальних рубців (Hopkins and Haaland, 2004; Wang et al., 2012). Проліферація астроцитів має вирішальне значення для герметизації місця інфаркту, реконструкції структури гіпокампу та тимчасового контролю місцевих імунних реакцій під час гострої фази (Rolls et al., 2009).

Однак утворення гіпертрофії та гліального рубця сприяють аберрантному нейрогенезу, перешкоджають росту дендритних шипів і перешкоджають формуванню синапсів, ще більше погіршуючи функції навчання та розпізнавання (Yiuand He, 2006; Wanner та ін., 2008; Burda та Sofroniew, 2014; Pekny та ін. , 2014; Ши та ін., 2017).

Гліальний фібрилярний кислий білок (GFAP) і протеоглікани хондроїтинсульфату, такі як нейрокан, є патологічними маркерами астрогліозу та гліальних рубців, експресію яких можна посилити високоактивованими астроцитами (Pekny and Nilsson, 2005; Choudhuryand Ding, 2016). Таким чином, інгібування астрогліозу та гліальних рубців може бути терапевтичною мішенню для HIE та його довгострокових неврологічних наслідків.

Застосування севофлурану було продемонстровано для пом’якшення ураження ГІ у гризунів. Дослідження, що вивчають значення посткондиціонування севофлурану (SPC) для полегшення пошкодження HI шляхом підвищення регуляції фактора, індукованого гіпоксією-1 (HIF-1) у дорослих гризунів і новонароджених щурів, виявили кілька потенційних механізмів (Wang et al., 2019b; Yanget). ін., 2019; Ду та ін., 2020; Лю і Гонг, 2020).

Як ключовий фізіологічний датчик гіпоксії, HIF-1 є транскрипційним фактором із сотнями розташованих нижче молекул, залучених до механізмів ішемічної толерантності, таких як фактор росту ендотелію судин і еритропоетин (Na et al., 2015). Було підтверджено, що гіпоксичне посткондиціонування зменшує активацію астроцитів і мікрогліалів після HI в мозку новонароджених щурів (Teo et al., 2015).

Таким чином, ми припустили, що HIF-1 може сприяти послабленню утворення гліальних рубців і астрогліозу. HIF-1 може конститутивно існувати в нейронах, завдяки чому він швидко збільшує експресію та накопичується в умовах гіпоксії. Однак, коли кисень повертається до нормального рівня, експресія HIF1 не може підтримуватися на достатньо високому рівні, щоб безперервно здійснювати нейропротекторний ефект через залежну від кисню деградацію білками пролілгідроксилази та подальше повсюдне поширення білками фон Гіппеля-Ліндау (VHL) (Berra et al., 2003; Чжан та ін., 2018).

Повідомляється, що DJ-1 (закодований Park7) є нейрозахисним білком, особливо в умовах окислення (Aleyasin та ін., 2007, 2010). Білок VHL фізично взаємодіє з DJ-1, як визначено за допомогою об’єктивного сканування мас-спектрометрії та підтверджено на моделі хвороби Паркінсона (ХП). Крім того, Parsanejad та ін. (2014) показали, що DJ-1 інгібує VHL-залежну убіквітацію та стабілізує експресію HIF-1.

Таким чином, ми припустили, що севофлуран стабілізує білок HIF-1 у гіпокампі шляхом посилення регуляції DJ-1 для пригнічення повсюдного поширення HIF-1, тим самим покращуючи довгострокове навчання та функцію пам’яті.

Щоб дослідити роль HIF-1 у зв’язку між севофлураном і астрогліозом, ми використали YC-1 (Lificiguat), як селективний антагоніст HIF-1, щоб повністю пригнічувати експресію HIF-1 на посттранскрипційний рівень. У цьому дослідженні ми досліджували роль HIF-1a у нейропротекції неонатальних щурів HIE, які отримували SPC.

Матеріали та методи

Тварини
Дослідження на тваринах проводили на синаптичній стадії розвитку щурів, яка починається на 7 постнатальний день (P7), що відповідає періоду росту людських немовлят від пізньої вагітності до 3 років після народження (Jevtovic-Todorovic et al., 2003). Семиденних щурів Sprague-Dawley вагою 12–16 г було відібрано з 20 вагітних щурів (придбаних у лабораторії лікарні Shengjing, Китайський медичний університет, Китай; співвідношення самців/самок 1:1).

Усі щури мали вільний доступ до води та їжі та підтримували стандартну вологість і температуру в лабораторії з 12--годинними циклами світла/темряви (8:00/20:00). Усі досліди на тваринах проводили відповідно до рекомендацій Національного інституту здоров’я (Бетесда, штат Меріленд, США) щодо догляду та використання лабораторних тварин.

Комітет з догляду за лабораторними тваринами Китайського медичного університету офіційно схвалив описані експерименти (Шеньян, Китай; схвалення № 2016PS337K) 9 листопада 2016 року.

З 25 вагітних щурів було відібрано 249 щурів P7 і випадковим чином розподілено на групи на основі таблиці випадкових чисел (Wang et al., 2019a). Наш остаточний аналіз включав загалом 201 новонародженого щура; смертність після лікування HI становила 19%.

Ці 201 новонароджені щури були випадковим чином розділені на чотири групи: фіктивні (n=54), HI (n=54), HI + севофлуран (HIS) (n=54) і HIS+ YC{{ 6}} (n=39) груп. У кожній групі 24 щури використовували для вестерн-блот-аналізу, 5 використовували для імуногістохімії та фарбування Гольджі, а 10 використовували для поведінкового тестування. Решта 45 щурів у групах фіктивної, HI та HIS використовували для полімеразної ланцюгової реакції зворотної транскрипції (RT- ПЛР).

Планування експерименту та вплив анестетика

Використовувана модель HIE була описана раніше (Zhao et al., 2007; Grandvuillemin et al., 2017). На підставі відстані між заднім проходом і репродуктивними органами було завершено сексідентифікацію постнатальних щурів. Щоб створити модель HIE, голову кожного щура P7 помістили в прозору пластикову трубу, яку запечатали ватою перед випуском севофлурану (Wang et al., 2019a; Xue et al., 2019).

Ліва загальна сонна артерія кожного щура була остаточно перев'язана, а між двома перев'язками артерія була перерізана; кожна операція була завершена протягом 5 хвилин. Згодом щури прокинулися без впливу анестезії та були поміщені назад у клітини своїх матерів на 2 години. Для введення SPC щурів помістили в прозору камеру (компанія Lingzhi, Ханчжоу, Китай), підключену до випарника асевофлурану; одна труба допомагала у вентиляції, а інша виводила зразок газу з камери на монітор.

Камеру вентилювали 30% O2 і 70% N2 протягом 2 годин для фіктивної групи, тоді як 8% O2 і 92% N2 вводили протягом 2 годин для групи HI. SPC було встановлено відразу після HI: 2,4% севофлурану (1 мінімальна альвеолярна концентрація) вдихали щури в камері з атмосферою 30% O2 і 70% N2 і швидкістю повітряного потоку 2 л/хв протягом 30 хвилин. Басейн з підігрівом стабілізував температуру всередині камери на рівні 37 градусів.

Введення препарату

Рівно за 30 хвилини до HI 1,52 мкг інгібітора HIF-1 (YC1; Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) було введено в лівий бічний шлуночок (Paxinos and Franklin, 2013) за допомогою шприц 5-μLHamilton (Yingweida Technology, Пекін, Китай). Як описано раніше, YC-1 розчиняли в штучній спинномозковій рідині в концентрації 0,304 мкг/мкл (Shen та ін., 2012; Na та ін., 2015).

Вестерн-блот аналіз

Щурів P7 анестезували 2% севофлураном, і тканини гіпокампу вилучали з дитинчат через 12, 24 і 48 годин і 28 днів після операції. Після екстракції тканини негайно помістили на лід.

Загальні супернатантні білки виділяли шляхом додавання радіоімунопреципітаційного аналізу (Beyotime, Haimen, Китай). Концентрацію білка визначали за допомогою One BCA Kit (Beyotime).

Потім зразки розділяли на 12,5% додецилсульфат натрію-поліакриламідних гелях і переносили на нітроцелюлозні мембрани. Після блокування 5% бичачим сироватковим альбуміном (Sigma-Aldrich) при 4 градусах мембрану інкубували з відповідними первинними антитілами, включаючи анти-гліцеральдегід 3-фосфатдегідрогеназу (GAPDH; 1:2000; Cat# 5174S; CellSignaling Technology). , Денверс, Массачусетс, США), анти-DJ-1 (1:1000;Cat# ab18257; Abcam, Кембридж, Великобританія), анти-VHL (1:5000;поліклональний; Cat# ab77262; Abcam), анти -HIF-1 (1:900; поліклональний; Cat# ab2185; Abcam), антинейрокан (1:200;моноклональний; Cat# sc-33663; Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас, США) , антипостсинаптичний білок щільності 95 (PSD95; 1:1000; моноклональний; кат. № 3409S; Cell Signaling Technology), антиростовий білок 43 (GAP43; 1:2000; поліклональний; Cat# 16971-1-AP; Proteintech Biotechnology , Чикаго, штат Іллінойс, США), і анти-GFAP (1:5000, поліклональний, Cat# ab53554; Abcam).

Після цього блоти інкубували з анти-кролячим IgG (1:5000; Cat# ZB-2301; Zhongshanjinqiao, Пекін, Китай) або протимишачим IgG (1:5000; Cat# ZB-2301; Zhongshanjinqiao) протягом 2 годин при кімнатній температурі.

Білкові блоти візуалізували за допомогою реагентів для виявлення хемілюмінесценції (SuperSignal West Pico; Pierce, Rockford, IL, USA). Білкові смуги були кількісно визначені за допомогою програмного забезпечення ImageJ (Національний інститут здоров’я). Для аналізу вестерн-блотів дані були нормалізовані до GAPDH.

Імуногістохімія

Через двадцять вісім днів після операції щурам вводили анестетик за допомогою описаного вище методу, перфузували 4% формаліном, і їхній мозок видаляли для імунофлуоресцентного фарбування.

Мозок занурювали в 4% параформальдегід при температурі 4 градуси на 48 годин, потім зневоднювали в градуйованому етанолі і, нарешті, занурювали в парафін. Потім залиті парафіном тканини нарізали вібратомом на зрізи товщиною 2.5- мкм, а отримані зрізи зберігали при кімнатній температурі.

Кожен мозок безперервно розділяли, і три розривні зрізи мозку вибирали для фарбування NeuN (нейронний маркер), GFAP (астроцитарний маркер) і нейрокан (гліальний рубцевий маркер). Для подвійного мічення зрізи тканини інкубували з двома змішаними первинними антитілами, включаючи козячі антитіла GFAP(1:250; поліклональний; Cat# ab53554; Abcam), кролячі антигени (1:100; Cat#12943; Cell Signaling Technology) та/або мишачий антинейрокан (1:200; моноклональний; Cat# sc{{ 10}}; Біотехнологія Санта-Крус) при 4 градусах протягом ночі у зволоженій камері.

Згодом зрізи промивали 0.1 Мфосфатним буферним розчином та інкубували протягом 2 годин при кімнатній температурі з відповідними вторинними антитілами, включаючи антитіла проти кроликів, кон’юговані з Alexa Fluor-594 (1:200; термін служби) Technologies, Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк, США), антимишачий IgG, кон’югований з Alexa Fluor-594 (1:200; Life Technologies), і анти-козячий IgG, кон’югований із флуоресцеїн ізотіоціанатом (1:200; Life Technologies).

Протифарбування клітинних ядер було здійснено 4′,6-діамідіно-2-феніліндолом (Beyotime) протягом 5 хвилин.

Для спостереження за пофарбованими зрізами використовували мікроскоп Olympus BX51 (OlympusCorporation, Токіо, Японія). Три поля зору лівого гіпокампу були випадковим чином обрані з кожного зрізу для фотографії. Для оцінки кількісної колокалізації та, отже, для розрахунку коефіцієнта перекриття Мандерса використовувалося програмне забезпечення ImageJ.

For more information:1950477648nn@gmail.com