Посилення протипухлинної активності Aspergillus Favus «ендофіту жожоба» таксолу шляхом кон’югації з наночастинками золота за допомогою ‑опромінення Ⅱ
May 30, 2023
Хімічна ідентифікація та протипухлинна активність таксолу A. favus
Передбачувані плями ТШХА. фавусТаксол відбирали та розчиняли в метанолі,і хімічні властивості сполуки були визначені за різними ВЕРХ,ЯМР, FT-IR хроматографічний і спектроскопічний аналізи. Протон ядерно-магнітнийрезонансні сигнали (1 H ЯМР).А. фавусекстрагований таксол розподілявся між 1.0і 8.0 ppm, з трьома розділеними протонними сигналами при 1.0–3.0 ppm, що відповідають метилу,ацетатні та ацетиленові групи, тоді як сигнали протонів при 6,5–9.0 ppm, що відповідаєароматичні частини (рис.3). Картина і розподіл сигналів протонівA. faпротиТаксол підтверджує структурну ідентичність і схожість зразка зі стандартомТаксол (рис.3). Крім того, таксол зA. favusмає ті самі спектри FTIR, що й справжній Taxol.Пік на 3393,3 см−1був призначений для гідроксилу (OH), тоді як пік при 2923,5 бувприписується аліфатичному розтягуванню CH, піки на 1661.0 см−1відповідають C=Oчастота розтягування. Спостережуваний пік становить 1452.0 см−1і 1404.0 були посилання начастота розтягування NH, тоді як пік на 1109,0 см−1відноситься до карбонільної групичастота розтягування кисню. Піки в діапазоні від 1020,0 до 979,77 см−1булипосилається на наявність ароматичних C і H вигинів. Нарешті, спектральна картинаFTIR щодо функціональних групА. фавусТаксол був ідентичний автентичномуТаксол (рис.3). Зрештою, з хроматографічного та спектрального аналізів, припущеннязразок був розділений і автентифікований як сполуки таксолу порівняно з автентичнимз'єднання.
Натисніть тут, щоб дізнатися про китайські трави цистанхеАнтипроліферативна активність
Вплив різних типів середовищ на продукцію таксолу A. favus
Вплив складу середовища на продукцію таксолуА. фавусбуло оціненошляхом вирощування на PDB, M1D, Czapek's-Dox та солодовому екстракті. Після культурних інкубТаксол екстрагували та кількісно визначали, як описано в матеріалах і методах. Відрезультати на рис.4, найвищий вихід таксолу заА. фавусбув отриманий шляхом вирощування на солодіекстракту (170 мкг/л) і Czapek's-Dox (166 мкг/л), порівняно з середовищем росту PDB як контролем(89 мкг/л). Таким чином, вихід таксолу поА. фавусзросла приблизно в 2 разивирощуванням на середовищі Czapek's-Dox і солодового екстракту порівняно з контрольним середовищем.Отже, подальші дослідження оптимізації для максимізації виходу таксолуА. фавусза відповіддюреалізовано статистичний підхід поверхневої методології.
Оптимізація змінних біопроцесу за допомогою методології поверхні відгукуСкринінг дизайну Плакетта–Бермана для критичних факторів
Вихід таксолу поА. фавусбуло оптимізовано за допомогою статистичного експериментального дизайнуПлакетт–Берман [18, 28]. Мінімальний і максимальний діапазони обраних параметріввибрані за планом Плакетта–Бермана були підсумовані в табл2. Концентрація таксолу становилавизначається за допомогою ТШХ і ВЕРХ. Всі досліди були
враховували середню концентрацію таксолу. Статистичний аналіз цього дизайну ілюструєthat the model F-value of 5.98 implies the model is significant and values of "Prob>F" меншевиконується в трьох примірниках ініж 0.0500, як зазначено в таблиці3. Фактичний і прогнозований вихід таксолу у відповідь наекспериментальні параметри, виявлені з плану Плакетта–Бермана, були показані зматриця в табл4. "Pred R-Squared" 0.3061 не так близько до "Adj R-Squared"0.5760, як зазвичай можна очікувати. Максимальний фактичний (255,35 мкг/л) і прогнозований(280,4 мкг/л) вихід таксолу поА. фавусза факторіальним дизайном Плакетта–Берманабуло отримано при прогоні № 8. З отриманих даних (рис.4), найвищий вихід таксолу заA. favus(225 мкг/л) отримано з використанням солодового екстракту (20 г/л), пептону (2 г/л), сахарози (20 г/л), соїтону.(2 г/л), цистеїн (0.5 г/л), глутамін (0.5 г/л), екстракт яловичини (1 г/л), при температурі інкубації30 градус, початковий рН 6,0 і після 12 днів інкубації при швидкості струшування (150 об/хв). При цьому культурнийпрогон (12), вихід таксолу поА. фавусзначно збільшився приблизно в 1,4 рази,порівняно з контрольним середовищем (170 мкг/л). Зменшення моделі, перетворення відгуку,і Adeq Precision вимірюють відношення сигнал/шум, і бажано співвідношення більше 4[46]. На основі оціненого параметра та шляхом застосування множинного регресійного аналізуекспериментальні дані, тестові змінні та змінна відповіді були пов'язані наступним чиномрівняння моделі: рівняння першого порядку в термінах закодованих факторів — Taxol Con.= плюс 11,51 плюс 1,91E плюс 2,92 Дж плюс 0,81 K. Фактичний і прогнозований рівні таксолу заА. фавусна Plackett–Burбіопроцес оптимізації людини зведені в табл4і рис.4. Максимальна фактична(255,35 мкг/л) та прогнозований (280,4 мкг/л) вихід таксолу заА. фавусза факторним дизайномПлан Плакетта–Бермана був отриманий у циклі № 8 із середнім компонентом. Ефект індиокремі параметри, як виявлено з плану Плакетта–Бермана, були представлені в ПаретоДіаграма, що відображає порядок значущості змінних, залучених до виробництва таксолу Рис.4. Таким чином, найбільш значущі змінні, що впливають на продуктивність таксолуA. favusбули цистеїн,pH і час інкубації, як виявлено з плану Плакетта–Бермана.
Центральну композитну конструкцію було прийнято для подальших досліджень оптимізації з використаннямзначуща змінна, що з плану Плакетта–Бермана. Результати 20 заїздів з трьохзмінні з позитивним ефектом показали, що виробництво таксолу помітно диверсифікувалосяз умовою були перевірені в діапазоні 96,5–302,7 мкг/л. Максимальна врожайністьТаксол поА. фавус(302,7 мкг/л) спостерігали за допомогою цистеїну (0,50 г/л) при pH 6,0 та інкубувалипротягом 15 днів, як зазначено в табл5. Мінімальне виробництво таксолу було зафіксовано припрогон № 15, де цистеїн (1.0 г/л) при pH 7.0 та інкубували протягом 7 днів. СтатистичнийАналіз дизайну лінійної моделі показує, що F-значення становить 87,08, що означаєsignificance of the model, and the values of "Prob>F" менше 0.050 вказує на цю модельтерміни значні (табл6). Таким чином, цистеїн, pH і час інкубації є значущимимодельні умови. Аналіз показав, що "Пред. R-квадрат" 0.8972 є прийнятнимугода з "Adj. R-Squared" 0.9315. Коефіцієнт "Adeq. Precision" 30,800 заходіввідношення сигнал/шум, оскільки бажане співвідношення більше чотирьох, Adeq.Результати, отримані в результаті експерименту CCD, були проаналізовані за допомогою ANOVA, що дало результатнаступне рівняння регресії на рівні виробництва таксолу: рівняння моделі першого порядкутерміни закодованих факторів — Конц. таксолу.{{0}} плюс 11,47 плюс 1,60A плюс 2,43B плюс 0,67C. Тривимірнийкриві поверхні відповіді, що показують ефект взаємодії найбільш значПараметри нахилу, цистеїн, pH і час інкубації показані на рис.4.
Таблиця 2Мінімум і максимумдіапазони вибраних параметрівв П-БД для оптимізації вВиробництво таксолу
Таблиця 4План Плакетта–Бермана для оцінки факторів, що впливають на виробництво таксолуА. фавус
змінні з позитивним ефектом показали, що виробництво таксолу помітно диверсифікувалосяз перевіреним станом в діапазоні 96,5–302,7 мкг/л. Максимальна врожайністьТаксол поА. фавус(302,7 мкг/л) спостерігали за допомогою цистеїну (0,50 г/л) при pH 6,0 та інкубувалипротягом 15 днів, як зазначено в табл5. Мінімальне виробництво таксолу було зафіксовано припрогон № 15, де цистеїн (1.0 г/л) при pH 7.0 та інкубували протягом 7 днів. СтатистичнийАналіз дизайну лінійної моделі показує, що F-значення становить 87,08, що означаєsignificance of the model, and the values of "Prob>F" менше 0.050 вказує на цю модельтерміни значні (табл6). Таким чином, цистеїн, pH і час інкубації є значущимимодельні умови. Аналіз показав, що "Пред. R-квадрат" 0.8972 є прийнятнимугода з "Adj. R-Squared" 0.9315. Коефіцієнт "Adeq. Precision" 30,800 заходіввідношення сигнал/шум, оскільки бажане співвідношення більше чотирьох, Adeq.Результати, отримані в результаті експерименту CCD, були проаналізовані за допомогою ANOVA, що дало результатнаступне рівняння регресії на рівні виробництва таксолу: рівняння моделі першого порядкутерміни кодованих факторів — таксол конц.{{0}} плюс 11,47 плюс 1,60A плюс 2,43B плюс 0,67C. Тривимірнийкриві поверхні відгуку, що показують ефект взаємодії найбільш істотнихпараметри, цистеїн, pH і час інкубації, показані на рис.4.
модифіковане середовище солодового екстракту, отримане з RSM за дизайном Плакетта–Бермана. післякультуральної інкубації за стандартних умов, таксол екстрагували та кількісно визначали за допомогою ТШХі ВЕРХ. З отриманих результатів (рис. S1) немає істотного впливу на Taxol proелектропровідність при опроміненні в різних дозах.
Синтез AuNP та кон’югація з таксолом A. favus за допомогою – радіації
Полівінілпіролідон(Було синтезовано наночастинки золота (AuNP), закриті PVPшляхом змішування PVP з хлоридом золота (III) за допомогою гамма-опромінення в дозах{{0}}.25–10,0 кГр, а розроблені PVP-AuNP оцінювали за допомогою УФ-види, FT-IR,та XRD аналізи. Показано ескіз формування консорціуму Taxol-PVP-AuNPsна рис.5. Розмір розроблених PVP-AuNP, опосередкованих 1.0 кГр гамма-променями, відстежувализа допомогою DLS, і він становив близько 50 нм (рис.5). Зі зображення HRTEM очікуванеформа та розмір синтезованих AuNP були продемонстровані зі сферичними частинками всерединінанорозмірний діапазон від 20 до 30 нм із середнім основним діаметром 25 нм (рис.5). Подібні результати спостерігалися з PVP-AuNP, опосередкованими гамма-опроміненням [49, 50]. Спектральні властивості розроблених AuNP у відповідь на різні дози гамма-випромінюванняпромені оцінювали за допомогою аналізу UV-Vis із максимальним зареєстрованим спектром поглинанняпри λ540нм при 1,5–3.0 кГр. Крім того, здійснювався моніторинг розвитку AuNPпри візуальному огляді, з вірогідним жовтуватим або коричневим кольором, виявляючи утворенняAuNPs.
Хімічну кон'югацію таксолу та PVP-AuNP перевірено за допомогою спектра FT-IRаналізу, як виявлено незначне зміщення інтенсивності та коефіцієнта пропусканняфункціональні групи кон'югатів таксол-PVP-AuNP порівняно з таксолом як контролем.Інтенсивність піку на 3393,3 см−1призначений для гідроксилу (OH) у таксол-PVPКонсорціум AuNPs був збільшений приблизно в 3 рази порівняно з природним таксолом, виявившихімічне розтягування гідроксильних груп (рис.5). А також інтенсивність піків1661.0 см−1відносно частоти розтягування C=O було значно збільшено приблизно на 10згортається при кон’югації з PVP-AuNP, забезпечуючи розтягування зв’язків C=O. Theінтенсивність піку 2923,5, що відповідає аліфатичному розтягуванню CH, була досить стабільною. Аневелике зміщення інтенсивності спостережуваних піків на 1452.0 см−1і 1404,0 см−1бувспостерігається через частоту розтягування NH. Інтенсивність піку 1109,0 см−1зчастота розтягування карбонільної групи кисню була дещо знижена при кон'югації зPVP-AuNP.
Кристалічна/фізична структура таксолу після кон’югації з PVP-AuNP булавирішено з аналізу XRD (рис.5). З XRD, Taxol-PVP-AuNPs conсорту мав таку саму структурну конфігурацію, орієнтацію кристалів і розмір нативуТаксол, що забезпечує відсутність негативного впливу на кристалічну структуру нативного Таксолу. ВідРезультати порівняння аморфної та кристалічної структури таксол-PVP-AuNPнативний таксол був підтверджений. З XRD-аналізу кон'югація таксолу таPVP-AuNPs було розділено, як виявлено з відповідних дифракційних властивостей2ɵ=38.18 градусів, 44,01 градусів, 64,57 градусів, 77,67 градусів і 81,74 градусів, які описують спостереження Бреггав (111), (200), (220), (311) і (222), відповідно. Всі вершини були пов'язані з ідеаломкартка Об’єднаного комітету зі стандартів порошкової дифракції (JCPDS) AuNPs (JCPDSкартка № 04–0784) [51]. Так, була показана міцність кристалів синтезованих AuNPs,забезпечення гранецентрованої кубічної (ГЦК) кристалічної структури. Крім того, є простоаморфний пік при 19,25 градуса для таксолу, який включений в організацію та постійністьAuNP. Рентгенограма підтвердила успішну кон’югацію таксолу та PVP-AuNP.Середній розмір кристалітів включених AuNP визначали за шкалою Шеррерарівняння [52], і він становив 20,2 нм для консорціуму Taxol-PVP-AuNPs, опосередкованого гамма-випромінюваннямпроменів, як зазначено в рівнянні:
де D середній розмір кристаліту, повна ширина на половині максимуму, λ рентгенівськийдовжина хвилі, θ – кут Брегга,іk є константою.
Протиракова активність кон'югатів таксол-PVP-AuNPs
Theантипроліферативна активність таксол-PVP-AuNPкон'югатів оцінювали протиКлітинні лінії HEPG-2 і MCF-7, нормалізовані до нативного таксолу та AuNP, окремо. Відрезультати (рис.6), біоактивність таксолу різко зросла при кон’югаціїз AuNP порівняно з нативним таксолом як контролем. Як з'ясували в СК50значення, таксол-Консорціум PVP-AuNP виявив значну активність проти HEPG-2 (2,2 мкг/мл) іMCF-7 (3,3 мкг/мл) порівняно з нативним таксолом і AuNP окремо. Отже, при сполученніз AuNPs активність таксолу була збільшена в два рази щодо досліджуваних клітинних ліній.Щодо біоактивності AuNPs, тоантипроліферативна активністьтаксол-PVP-AuNPsконсорціуму було збільшено приблизно в 4 рази порівняно з AuNP як контроль. Цікаво,діяльність консорціуму Taxol-AuNPs вірогідно відповідала автентичному таксолу.
Антимікробна активність таксолу та синтезованих AuNP проти різнихмікроорганізми
Аантимікробна активністьвидобутогоА. фавусКонсорціум Taxol та Taxol-AuNPsоцінювали проти різних мультирезистентних бактерій і грибів (табл7). При сполученніз AuNP протимікробна активність таксолу була значно збільшена в порівняннідо нативного таксолу та AuNP окремо, як виявлено за діаметром інгібуваннязони досліджуваних мікроорганізмів (рис.6). Як показано на рис.6, консор Taxol-AuNPSнайвищу активність щодоE. агломерати(11 мкг/мл),C. альбікани (12 µg/ мл), ікишкова паличка(14 мкг/мл), порівняно з нативнимА. фавусТаксол і автентичний. Theбільш висока активність таксолу при кон'югації з AuNP підтверджує біодоступність,розчинність та ефективність таксолу щодо зв’язування з цільовим білком тубуліну in vivo.
ЗАПИТАЙТЕ БІЛЬШЕ:
Електронна пошта:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: плюс 86 15292862950
