Біохімічні та гістопатологічні реакції Biomphalaria Alexandrina на RIPEX (регулятор росту рослин)Ⅰ

Анотація

Фон

Регулятори росту рослин широко використовуються в сільському господарстві для прискорення росту та дозрівання рослин, але вони ставлять під загрозу водну екосистему. Поточне дослідження оцінювало вплив сублетального впливу 48-відсоткових концентрацій RIPEX EC (8 і 16 мкл/л) на параметри окисного стресу, статеві гормони, ферменти імунного потенціалу, різну кількість гемоцитів і гістопатологію травних залоз і яйцеклітин у Равлики Biomphalaria alexandrina.

Клацніть, щоб дізнатися про тестостерон

Результати

Вплив RIPEX викликав загальне підвищення активності супероксиддисмутази та глутатіон-S-трансферази у B. Alexandrina. Однак екстремальний вплив RIPEX пригнічує активність SOD в равликах. Активність малонового діальдегіду показала збільшення B. Alexandrina під впливом обох концентрацій після всіх періодів впливу. RIPEX також викликав значне підвищення рівня тестостерону в равликів, які зазнали впливу 16 мкл/л, однак він знизив рівень гормонів у равликів, які зазнали впливу 8 мкл/л через 7 днів. Що стосується естрадіолу, спостерігалося значне підвищення після 3 днів впливу до 16 мкл/л і 7 днів впливу до 8 мкл/л. Вплив RIPEX також збільшив активність ферментів мієлопероксидази та аденозиндезамінази в травних залозах равликів. Це збільшило загальну кількість гемоцитів у равликів, які зазнали впливу, а також кількість гранулоцитів. Травні залози та овотестиси равликів показали патологічні зміни після 7 днів впливу RIPEX.

Висновки

Ці висновки свідчать про те, що RIPEX є токсичним для B. Alexandrina і що цього равлика можна використовувати як біоіндикатор забруднення навколишнього середовища регуляторами росту рослин.

Ключові слова

Biomphalaria alexandrina, RIPEX, Тестостерон, Естрадіол, Мієлопероксидаза, Аденозиндезаміназа, Гістопатологія

1 Фон

Агрохімічне забруднення поверхневих вод викликає зростаючу глобальну екологічну проблему, особливо в районах, де сільське господарство швидко розширюється та інтенсифікується. Різні синтетичні хімічні речовини, такі як пестициди або добрива, використовуються для зміни кількості та якості врожаю, щоб задовольнити потреби споживачів [7, 40]. Стимулятори росту рослин є поширеними агрохімікатами в багатьох країнах [18].

Коли ці хімічні речовини безпосередньо вдихаються або споживаються із зараженими овочами, вони завдають шкоди здоров’ю людини [39]. Фосфорорганічний пестицид, етефон (2-хлоретилфосфонова кислота) – це синтетична хімічна речовина, що вивільняє етилен, яка зазвичай використовується як регулятор росту рослин (PGR) для стимулювання цвітіння, дозрівання плодів та інших фізіологічних реакцій. Він дозволений для використання на різноманітних харчових, кормових, нехарчових, тепличних і декоративних рослинах, які вирощуються у відкритому грунті [3, 50]. Лабораторна оцінка токсичності етефону показала, що етефон викликав морфометричні вади розвитку другої антени, сенсорних щетинок, хвостової ості та рострума Daphnia magna, що призвело до втрати функції та смерті [54].

Abd-El Azeem [1] зафіксував зниження швидкості росту, пошкодження ДНК та апоптозу в клітинах травних залоз слимака Deroceras reticulatum після впливу етефону. Багато авторів підтверджують токсичність Етефону на щурах і птахах [2, 17, 55]. Крім того, вплив етефону викликало генотоксичність, окислювальний стрес і репродуктивну токсичність у мишей [16]. Тератогенність і дисфункція гонадної системи у мишей також були пов’язані з впливом етефону [2, 16]. Також доведено, що етефон є імунотоксичним, має мутагенну дію [26], підвищує окислювальний стрес і знижує концентрацію дезоксирибонуклеїнової та рибонуклеїнової кислот [4].

Етефон у водоймах може загрожувати водній фауні; проте даних про його вплив на водні організми мало. Кілька водних видів використовувалися для виявлення гормонів росту рослин у водних системах. Однак деякими з цих організмів важко маніпулювати та підтримувати в лабораторії, що ускладнює їх використання в екотоксикологічних оцінках [54]. Водні молюски, включаючи равликів, нещодавно привернули увагу як тестові організми через необхідність розробки моделей безхребетних для екологічного моніторингу водних забруднень [21, 45]. Равлики є найпоширенішою групою молюсків у водних системах. Равлики представляють менш експлуатаційну альтернативу вищим хребетним як біоіндикатори, оскільки їх можна використовувати в різноманітних експериментах без отримання етичного схвалення, а їх придбання та утримання є недорогими [13].

У цьому відношенні равлик Biomphalaria alexandrina широко використовувався як організм-індикатор забруднення прісної води пестицидами [29, 30]. Окрім свого потенціалу як біоіндикатора, цей равлик діє як проміжний господар для передачі Schistosoma mansoni [35]. Таким чином, концентрації агрохімікатів у навколишньому середовищі можуть впливати на передачу шистосомозу шляхом прямого та опосередкованого впливу на проміжного господаря та щільність паразитів [27]. Це дослідження було спрямоване на дослідження впливу сублетального впливу регулятора росту рослин RIPEX 48% EC (торгова назва етефону, 2-хлоретилфосфонової кислоти) на різні біохімічні, імунологічні та гістологічні аспекти B. alexandrina равлики як біоіндикаторний організм.

2 Методи

2.1 Тестовий організм

Равлики Biomphalaria alexandrina були зібрані з озера Манзала, розташованого в Ель-Матарея, мухафаза Дакалія, Єгипет (31 градус 11′ пн. ш. 32 градус 2′ сх. д.), і зберігалися в добре аерованій водопровідній воді при постійній температурі 20 градусів. Їх щодня годували свіжим листям салату. Після 4-тижневого утримання в лабораторних умовах у подальших експериментах використовували здорових статевозрілих равликів (діаметр раковини 10–12 мм).

2.2 Експериментальний матеріал та умови експозиції

Регулятор росту рослин RIPEX (форма розчину, що містить 48 відсотків етефону [2- хлоретилфосфонової кислоти (C2H6ClO3P)] та 52 відсотки інертних інгредієнтів) було придбано в Chema Industries (місто Нью-Нубарія, Бехіра, Єгипет; реєстраційна ліцензія № 1840). Підготовлено серію концентрацій. Були виставлені копії дерев по десять равликів кожна. Через 1-день впливу мертвих равликів підрахували та видалили, а LC50 і LC90 обчислили за допомогою статистичного програмного забезпечення соціальних наук (SPSS; IBM Corp. Armonk, Нью-Йорк, США).

2.3 План експерименту

Використовувалися дві сублетальні концентрації, що представляють LC10 і LC20 (8 і 16 мкл/л). 90 равликів були розділені на три групи, кожна група з трьома репліками (десять равликів/реплікат): контрольна група, група з опроміненням 8 мкл/л і група з опроміненням 16 мкл/л. Через 1-, 3- і 7--денні інтервали в травній залозі оцінювали біомаркери окислювального стресу та ферменти імунного потенціалу. стероїдні гормони були оцінені в Ovotestis. Оцінювали диференційну кількість гемоцитів, гістологію травних залоз і овотестиса. Для біохімічних досліджень 0,5 г тканини (травних залоз або ovotestis) з кожної групи гомогенізували в 0,5 мл фосфатного буфера (pH 6,5) за допомогою скляного гомогенізатора та центрифугували при 10,000×g, 4 градуси протягом 10 хв. . Отримані супернатанти використовували для наступних аналізів.

2.4 Визначення маркерів окисного стресу

2.4.1 Супероксиддисмутаза (SOD, EC 1.15.1.1)

Активність SOD визначали за допомогою набору EnzyChrom™ Superoxide Dismutase Assay Kit (Кат. №: ESOD{{0}}; BioAssay Systems, Hayward, CA, США) відповідно до інструкцій виробника. Гомогенат тканини з використанням буфера для холодного лізису (50 мМ фосфату калію, 0,1 мМ EDTA і 0,5% Triton X-100) центрифугували при 12,000g протягом 5 хв при 4° , а супернатант збирали для визначення СОД [43]. Активність SOD вимірювали при оптичній щільності (OD) при 440 нм.

2.4.2 Глутатіон-S-трансфераза (GST, EC 2.5.1.18)

Цей фермент каталізує кон’югацію GSH із {{0}}хлоро-2,4-динітробензолом (CDNB). Вимірюється спектрофотометрично при 340 нм. Реакційна суміш містить калій-фосфатний буфер 0,1 М, pH 6,5, GSH, розчинений у калій-фосфатному буфері (140 мг/100 мл), і CDNB 4 мг/мл в етиловому спирті. Одна одиниця активності ферменту визначається як кількість ферменту, яка каталізує утворення 1 мкмоля S-кон’югату за хвилину [11].

2.4.3 Малоновий діальдегід (MDA)

Малоновий діальдегід у цілісних гомогенатах визначали як реакційноздатні речовини з тіобарбітуровою кислотою (TBARS) відповідно до стандартного методу Ohkawa et al. [37]. Реакційна суміш включала 0.1 мл гомогенату тканини, рівний об’єм розчину додецилсульфату натрію, 0.75 мл оцтової кислоти, 0.75 мл тіобарбітурової кислоти, і 0.3 мл дистильованої води. Ці компоненти змішували у вортексі та інкубували на киплячій водяній бані протягом 1 години, потім охолоджували до кімнатної температури. Десять 0,5 мл дистильованої води та 2,5 мл н-бутанолу додавали в кожну пробірку та енергійно перемішували за допомогою вортексу, а потім обертали в центрифузі при 2500×g протягом 10 хвилин. Поглинання зчитували при 532 нм.

2.5 Визначення гормонів

2.5.1 Тестостерон

Тестостерон визначали за допомогою набору для імуноферментного аналізу тестостерону (ІФА) (Кат. №: ADI-900-065; Enzo Life Sciences, Нью-Йорк, США). Тестостерон є основним андрогеном, який впливає як на первинний, так і на вторинний статевий розвиток як статевий потяг. 100 мкл стандартного розріджувача (буфер для аналізу 3 або культуральне середовище тканини) піпетували в лунки неспецифічного зв’язування та максимального зв’язування (0 пг/мл стандарту). Після цього 100 мкл стандарту №1-№5 у відповідні лунки. Зразок (100 мкл) піпеткою вносили у відповідні лунки, а 50 мкл буфера для аналізу 3 — у лунки неспецифічного зв’язування. Крім того, 50 мкл жовтого антитіла додавали в кожну лунку, за винятком порожньої лунки, лунки загальної активності та лунки неспецифічного зв’язування. Інкубація планшета при кімнатній температурі на планшетному шейкері протягом 1 год при 500 об/хв. Після цього в кожну лунку додавали 50 мкл блакитного кон’югату, за винятком лунок загальної активності та порожніх лунок. Після спорожнення лунок від вмісту проводили промивання, додаючи 400 мкл промивного розчину в кожну лунку 3 рази. Блакитний кон’югат (5 мкл) додавали до лунок загальної активності та 200 мкл розчину п-нітрофенілфосфату додавали до кожної лунки та інкубували при 37° протягом 1 години без струшування. Зчитування планшета при 405 нм проводили після додавання 50 мкл стоп-розчину в кожну лунку [12, 48].

2.5.2 Естрадіол

Естрадіол визначали за допомогою набору ELIZA для естрадіолу (Кат. №: 501890; Cayman Chemical, Мічіган, США) згідно з протоколами виробника. Принцип цієї реакції заснований на тому, що концентрація індикатора естрадіолу ацетилхолінестерази (AChE) є постійною, але концентрація нативного естрадіолу змінюється, тому кількість індикатора естрадіолу ацетилхолінестерази (AChE), який зв’язується з сироваткою проти естрадіолу, обернено пропорційна концентрації нативного естрадіолу. в колодязі. 100 мкл буфера ELISA додавали до лунок неспецифічного зв’язування та максимального зв’язування. Додавання 50 мкл із пробірки №8 до обох найнижчих стандартних лунок (Стандарт 8) і 50 мкл із пробірки №7 до кожної з наступних стандартних лунок (Стандарт 7). До кожної лунки додавали зразок (50 мкл). Естрадіол AChE Tracer (50 мкл) додавали до кожної лунки загальної активності та порожніх лунок. Після цього в кожну лунку додавали антисироватку Естрадіол ELISA (50 мкл) за винятком загальної активності, неспецифічного зв’язування та порожніх лунок. Після інкубації на орбітальному шейкері (2 години при кімнатній температурі) абсорбцію вимірювали при 414 нм [52].

2.6 Визначення ферментів імунного потенціалу

2.6.1 Мієлопероксидаза (MPO, EC 1.11.2.2)

Одна одиниця активності MPO визначається як кількість ферменту, який гідролізує субстрат і генерує таурин-хлорамін для споживання 1.0 мкмоль TNB за хвилину при 25 градусах. MPO визначали за допомогою набору для визначення колориметричної активності мієлопероксидази (Кат. №: MAK068; Sigma-Aldrich, MO, США). Поглинання вимірювали при 412 нм.

2.6.2 Аденозиндезаміназа (ADA, EC 3.5.4.4)

ADA є ферментом, який каталізує перетворення аденозину і 2'-дезоксиаденозину в інозин і 2'-дезоксиинозин. ADA визначали відповідно до принципів набору для аналізу активності аденозиндезамінази технічного бюлетеня (Кат. №: MAK400; Merck KGaA, Дармштадт, Німеччина). Одна одиниця аденозиндезамінази - це кількість ферменту, який гідролізує аденозин з утворенням 1,0 мкмоль інозину за хвилину при 37 градусах. Реагенти: 1 × буфер для аналізу ADA (41 мкл), конвертер ADA (2 мкл), проявник ADA (2 мкл) і субстрат ADA (5 мкл).

2.7 Диференційне число гемоцитів

Гемолімфу відбирали від равлика (контроль, експонована) за Смініа [47]. Після торкання пастерівською піпеткою до голови та стопи равлик був змушений глибоко втягнутися в свою мушлю та видавити гемолімфу, яку зібрали для диференціального підрахунку гемоцитів. Гемолімфу наносили на предметне скло мікроскопа для розтікання. Після фіксації в 99,8% метанолі протягом 5 хвилин предметне скло повертали під кутом 45 градусів для сушіння при кімнатній температурі та фарбували фарбою Гімзи протягом 20 хвилин. Встановлено, що диференціація гемоцитів пропорційна рахунку 100.

2.8 Гістологічні дослідження

Гістологічні дослідження проводили після 7 днів впливу 8 та 16 мкл/л RIPEX. Травні залози та ovotestis були вирізані та негайно фіксовані в рідині Буена. Після 1 дня фіксації зразки потім зневоднювали через серію спиртів і очищали в ксилолі. Виготовляли парафінові блоки [42]. Десять сект. (товщина 5–7 мкм) розрізали та фарбували гематоксиліном та еозином (Н та Е Майєра). Після фарбування слід добре промити водопровідною водою. Гістологічні зрізи фотографували фотоавтоматизованою камерою (Optika, Італія).

2.9 Статистичний аналіз

Дані були виражені як середнє ± стандартне відхилення та проаналізовані за допомогою статистичного програмного забезпечення соціальних наук (SPSS; IBM Corp. Armonk, Нью-Йорк, США). Двосторонній дисперсійний аналіз дисперсійного аналізу використовувався для виявлення відмінностей між контрольною групою та групами, які піддавалися впливу, між різними концентраціями та моментами часу впливу. Рівень значущості було встановлено на p Менше або дорівнює 0.05.

Механізм Cistanche підсилює дію тестостерону

Було виявлено, що цистанхе підвищує рівень тестостерону кількома способами. По-перше, він містить сполуки, відомі як ехінакозид і актеозид, які, як було показано, посилюють вироблення лютеїнізуючого гормону (ЛГ) у гіпофізі. ЛГ стимулює клітини Лейдіга в яєчках виробляти тестостерон. Цистанхе також містить полісахариди та фенілетаноїдні глікозиди, які, як було показано, мають антиоксидантні та протизапальні властивості. Це може допомогти зменшити окислювальний стрес і запалення в яєчках, що може погіршити вироблення тестостерону. Крім того, було виявлено, що Cistanche посилює експресію генів, залучених до синтезу тестостерону, і знижує активність ферментів, які розщеплюють тестостерон, таких як {{1} }альфа-редуктаза. Загалом вважається, що комбінація цих механізмів сприяє підвищенню рівня тестостерону у Цистанчі.

Хода Х. Абдель-Азім1*, Азза Х. Мохамед1 і Мохамед Р. Хабіб2