Бензильовані дигідрофлавони та алкалоїди, отримані з ізохіноліну, з кори Diclinanona Calycina (Annonaceae) та їх цитотоксичність

За додатковою інформацією звертайтесьtina.xiang@wecistanche.com

Анотація: Diclinanona calycina RE Фрі, відомий як "enviro", є видом родини Annonaceae, ендемічним для Бразилії. У наших постійних пошуках біологічно активних сполук з рослин Annonaceae Amazon кора D.calycina була досліджена класичними методами хроматографії, що дало тринадцять сполук (алкалоїдів і флавоноїдів), вперше описаних у D. calycina, а також у роду Diclinanona. Структуру цих ізольованих сполук було встановлено шляхом обширного аналізу з використанням 1D/2D-ЯМР спектроскопії в поєднанні з MS. Виділені алкалоїди були визначені як такі, що належать до підкласів: простий ізохінолін, талі онлайн (1); апорфін, анонаїн (2);оксоапорфін, ліріоденін (3); бензилтетрагідроізохіноліни, (S)-(плюс)-ретикулін(4); дегідро-оксоноретикулін (3,4-дигідро-7-гідрокси-6-метокси-1-ізохінолініл)(3-гідрокси-4-метоксифеніл)-метанон)(5 );( плюс )-1S,2R-ретикулін Ng-оксид (6); і ( плюс )-1S,2S-ретикулін N-оксид (7);тетрагідропротоберберин, корексимін(8); і павін, біснорагмонін (9). У той час якфлавоноїдиналежать до бензильованихдигідрофлавони, ізорамнетин (10), дихаманетин (11) і суміш уваринолу (12) та ізуварінолу (13). Сполука 5 вперше описана в літературі як природний продукт. Цитотоксичну активність основних виділених сполук оцінювали проти ракових і неракових клітинних ліній. Серед досліджуваних сполук найбільш багатообіцяючі результати були отримані для бензильованих дигідрофлавонів дихаманетину (10) і суміші уваринолу (12) та ізуварінолу (13), які показали помірну цитотоксичну активність проти досліджуванихракова клітиналінії(<20.0 ug·ml-)="" and="" low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 мкг·мл-І). Діхаманетин (11) продемонстрував цитотоксичну активність проти HL-60 і HCT116 зі значеннями IC50 15,78 мкг·мл-І (33,70 мкмоль·Л) і 18,99 мкг∶мл-（40,56 мкмоль. L-）, відповідно, тоді як суміш уваринолу (12) та ізуварінолу (13) продемонструвала цитотоксичну активність проти HL-60 зі значенням IC5 9,74 мкг/мл-1 та HCT116 з IC50 вартістю 17,31 уг. мл-я. Цю цитотоксичну активність можна пояснити наявністю однієї або кількох гідроксибензильних груп, присутніх у цих молекулах, а також положенням, у якому ці групи з’єднані. Цитотоксична активність ретикуліну, анонаїну та ліріоденіну була встановлена ​​раніше, причому ліріоденін є найпотужнішою сполукою.

Ключові слова: Diclinanona calycina; алкалоїди та бензильовані дигідрофлавони; цитотоксична активність

Натисніть, щоб дізнатися більше про продукти

1. Введення

Annonaceae — велика родина тропічних і субтропічних дерев і чагарників, що включає близько 112 родів і 2440 видів [1]. Кілька видів відомі своїми їстівними плодами та лікувальними властивостями ]2]. Попереднє фітохімічне дослідження деяких видів Annonaceae призвело до виділення та характеристики різних класів вторинних метаболітів, таких як монотерпени, дитерпени, тритерпени, лігнани,флавоноїди, фенілпропаноїди, похідні від азарону, ацетогеніни та головним чином типові алкалоїди, похідні від ізохіноліну [3-7]. Деякі з цих вторинних метаболітів, виділених із видів Annonaceae, виявляли важливу біологічну активність, таку як протизапальні та інгібуючі уреазу властивості [8,9], трипаноцидні [10,11], лейшманіцидні [11,12], протималярійні [4,13] , антимікробну [4,14,15], антиоксидантну та протиревматичну дію [9,15] і, зокрема, цитотоксичну активність проти різних клітинних ліній пухлин людини [4,6,11,16-21].

Незважаючи на те, що родина Annonaceae вважається примітивною та добре вивченою родиною, з її видами було проведено небагато фітохімічних та/або фармакологічних досліджень[3]. Фітохімічні та/або фармакологічні дослідження зосереджені в основному на видах родів Annona, Asimina та Cananga через їх велике економічне значення, а також на деяких видах родів Duguetia, Guatteria та Xylopia [5]. Незважаючи на значне зростання за останні 20 років щодо фітохімічних і фармакологічних досліджень, кількість досліджених видів все ще дуже мала порівняно з великою кількістю визнаних видів. Наразі, згідно з науковими базами даних Web of Science, Scopus і SciFinder, лише близько 15 відсотків описаних видів Annonaceae мають відповідні фітохімічні та/або фармакологічні дослідження.

Серед маловивчених видів є ті, що належать до роду Diclinanona Diels. Цей рід належить до триби Annoneae підродини Annonoideae і зустрічається лише в тропічній частині Південної Америки (переважно в регіоні Амазонки). Це рід, що складається лише з трьох видів, Diclinanona calycina(Diels)RE Fries Diclinanona matogrossensis Maas і Diclinanona tessmannii Diels, які зустрічаються у вигляді дерев [22-24].D.calycina (синонім Xulopia calycina Diels) відноситься до 8-го до Дерево заввишки 30 м, відоме в народі як «енвірейра» та «енвіро», поширене по всьому басейну Амазонки в Бразилії, Перу та Венесуелі [23]. D.calycina зовні схожа на Xylopia своїми квітами з подовженими та вузькими пелюстками, але вона відрізняється своїми дерев’янистими, нерозкривними, кулястими та товстостінними монокарпіями [23,24].

Попередні дослідження з D. calycina повідомляють лише про фармакологічні дослідження. У першому дослідженні описано дослідження антимікробної активності метанольних, хлороформних і водних екстрактів проти мікроорганізмів Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli, Streptococcus sanguis, Streptococcus oralis, Staphylococcus aureus і Candida albicans методом гель-дифузії [25]. У другому звіті повідомляється про дослідження антимікробної активності органічних (дихлорметан:метанол 1:1) і водних екстрактів проти мікроорганізму Enterococcus faecalis за допомогою мікророзведеного бульйонного аналізу (MDBA) і дискового дифузійного аналізу (DDA) [26]. Таким чином, у нашому постійному пошуку нових біологічно активних природних продуктів з Annonaceae з тропічних лісів Амазонки, це дослідження мало на меті вивчити фітохімічні та фармакологічні властивості кори D.calycina. У цьому звіті тринадцять сполук (дев'ять алкалоїдів і чотири бензильованідигідрофлавони) були виділені та ідентифіковані вперше в D.calycina, а також у роду Diclinanona. Крім того, цитотоксичність основних сполук була досліджена проти B16-F10, HepG2, K562 та HL{{ 4}} лінії пухлинних клітин за допомогою аналізу Alamar blue.

2. Результати та їх обговорення

2.1. Структурне з’ясування сполук

Виявивши в метанольному екстракті за допомогою реактиву Драгендорфа наявність азотовмісних сполук, його піддали кислотно-основній обробці за методикою Costa et al. [12], що призводить до алкалоїдної та нейтральної фракцій. У алкалоїдній фракції, яка піддавалася хроматографічному аналізу, спостерігалася висока концентрація азотовмісних сполук. Послідовне хроматографічне розділення, як описано в розділі «Екстракція та виділення», призвело до виділення та ідентифікації тринадцяти хімічних складових (1-13, рис. 1), дев’яти алкалоїдів із ізохіноліну 1-9 та чотирьох бензильованих дигідрофлавонів 10-13. Структури цих ізольованих сполук (рис. 1) були встановлені шляхом обширного аналізу з використанням 1D і 2D ЯМР-спектроскопії в поєднанні з MS (додатковими даними), а також порівняння з даними з літератури.

Сполука 5 була отримана у вигляді коричневого аморфного порошку і виявилася позитивною на реактив Драгендорфа. Він показав протоновану молекулу при m/z328 [M плюс H]' в LR-ESI(плюс)MS-сумісну з молекулярною формулою C18H1NO5. Спектри H і 13C-ЯМР 5 (табл. 1) узгоджувалися зі спектрами ретикуліну (4) [27, за винятком відсутності зв’язаної азотом метильної групи (CH3-N) і сигналу метинова група в положенні 1, яка була замінена сигналом при δc 165,1 у типовому спектрі 13C-ЯМР групи іміну, кон'югованої з карбонільною групою при bc 192,8. У 'H-ЯМР-спектрі три атоми водню слабкого поля при δH 6,88（1H,d, J=8.4 Гц, H-5'）,5H7.57（1H,d, J{{33} }.0Гц, H-2'） і δH 7,60（1H, дд, J=8.4 і 2,0 Гц, H-6'） , виявили наявність системи зчеплення ABX. Два синглетні сигнали при 6H 6,90(1H,s, H-8) і 6,71(1H, s, H-5) вказують на наявність 1,2,4,5-тетразаміщеного фенільного кільця. Крім того, Н-ЯМР-спектр 5 також показав сигнали для двох метоксигруп, резонуючих при bH 3,93 (3H, с) і 6H 3,95 (3H, с), і сигнали для двох метиленових груп, резонуючих при δμ 2,79 (2H, t, J=7.8 Гц） і 6H 3.89(2H,t,/=7.8 Гц), віднесені до H-4 і H-3 відповідно (Таблиця 1) . Ці дані показали, що алкалоїд 5 має бензилтетрагідроізохіноліновий скелет [28-30].

Ці групи були створені на основі карти кореляції з двома та трьома зв’язками 'H-13C з експерименту HMBC-ЯМР (рис. 2 і таблиця 1). Цей аналіз показав, що водень при δH 3,89 （H-3）показав тризонну кореляцію 'H-13C з вуглецями при 6c130.1（4a） і δc165.{ {42}}（C-1）і кореляція двох зв’язків lH-13C з вуглецем при δc 25,4(C-4), що підтверджує наявність імінової групи в молекулі. З іншого боку, сигнали при δH 7,57 （H-2'） і δH 7,60（H-6'） показали кореляцію трьох зв’язків lH-13C з вуглецями при δc 124,3（ C-6'）,5c 151,4（C-4'）і δc192.8（C-7） і 5c116.0（C-2'）,6c 151.4 (C-4') і c 192,8(C-7'), відповідно, встановлюючи карбонільну групу в молекулі (рис. 2 і табл. 1). Отже, на основі цих даних ЯМР, сполука 5

було встановлено як бензилтетрагідроізохіноліновий алкалоїд 34-дигідро-7-гідрокси-6-метокси-1-ізохінолініл)(3-гідрокси-4-метоксифеніл)-метанон, який був називається дегідро-оксоноретикулін. Цей алкалоїд вперше описано в літературі як природний продукт. Його перший і єдиний запис був описаний Dörnyei et al. у 1982 році 【31】 як продукт синтетичного походження. Лише дані Н-ЯМР описані з деякими невизначеними кратностями. Таким чином, повні розподіли для всіх 1H- і 13C-ЯМР хімічних зсувів були встановлені за допомогою кореляційних експериментів з одним зв’язком (HSOC) і двома і трьома зв’язками (HMBC)' H-13C-ЯМР, і були описані в Таблиця 1.

Сполуки 6 і 7 були ідентифіковані як бензилтетрагідроізохінолінові алкалоїди (плюс)-1S,2R-ретикулін-N-оксид і (плюс)-1S,2S-ретикулін-N-оксид відповідно. Дані Н-ЯМР цих алкалоїдів порівнювали з даними, описаними Lee et al. [28] з використанням того самого дейтерованого розчинника (CD3OD), і спостерігалися деякі невідповідності (Таблиця 1), головним чином щодо H-1, H-8 і H, C-NO. У літературі немає даних 13C-ЯМР, описаних для цих алкалоїдів. На основі обмежених даних 1H- і 13C-ЯМР, а також неоднозначності, що спостерігається для цих молекул, були проведені 1D- і 2D-ЯМР-експерименти 'H і 13C, щоб визначити їхнє правильне призначення та кратність.

Правильне положення водню H{{0}} і H-1 обох ізомерів 6 і 7 було встановлено на основі кореляційної карти трьох зв’язків 'H-13C з HMBC - ЯМР експеримент （Малюнок 2）. Для ізомеру 6 аналіз показав, що водень при δH 5,78（H-8）показав кореляцію трьох зв’язків 'H-13C з атомами вуглецю при 6c 79,8（C-1）,δc120 .6（4a） і δc 149,4 （C-6）, тоді як водень при δH 4,13 （H-1）показав кореляцію трьох зв’язків 'H-13C з атомами вуглецю при c 60,7（C-3）,6c 115,7 （C-8）,δc 120,6（C-4a） і 131,2 （C-1'）, таким чином встановлюючи правильні положення атомів водню H-8 і H-1 для ізомеру 6. Це віднесення може бути додатково підтверджено аналізом водню при δH 6,76（H-5）, який показав тризв’язок Кореляція H-13C з атомами вуглецю при δc 27,0（C-4）, δc 127,1（C-8a） і δc 145,7 （C-7） (Малюнок 2）). Для ізомеру 7 аналіз показав, що водень при δH 6,30 （H-8）показав кореляцію трьох зв’язків 'H-13C з атомами вуглецю при δc 79,4（C-1）,δc 122,8（ 4a） і δc 148,9 （C-6）, тоді як водень при δH 4,46 （H-1） показав кореляцію H-13C із трьома зв’язками з вуглецями при δc 62,9 （C{ {82}}）,5c 115,5（C-8）, bc 122,8（C-4a） і 131,4（C-1'）, таким чином встановлюючи правильні положення атомів водню H -8 і H-1 для ізомеру 7. Це віднесення також було підтверджено аналізом водню при δH 6,71 （H-5）, який показав три зв’язки lH-13C кореляції з атомами вуглецю при δc26,3（C-4）, δc 126,9（C-8a） і 6c 146,1（C-7）(Малюнок 2). Експеримент NOESY також було проведено для встановлення правильної стереохімії ізомерів6 і 7. У цьому експерименті сильна кореляція NOE H-1（δH 4.13）і H, CN(5 3.15) вказує на -орієнтація кисню в ізомері 6. З іншого боку, в експерименті 2D-NOESY для 7 не було виявлено явної кореляції NOE між H-1(6H 4,46) і HAC-N(5H 3,20), вказує на -орієнтацію кисню в ізомері 7 (рис. 2). Ці невеликі відмінності в хімічних зрушеннях цих ізомерів чітко спостерігаються через стереохімію азоту, на яку впливають положення кисню і . Порівняння даних H- і 13C-ЯМР, отриманих для сполук 6 і 7, з даними молекул з близькими структурами, таких як гексапеталін A і гексапеталін B [30], підтверджує дані, описані в таблиці 1, без двозначності.

Сполуки 1-4 та 8-13 були ідентифіковані як таліфолін (1) [32], анонаїн (2) [33]ліріоденін (3)[10,34], (S)-( плюс )-ретикулін ( 4)[27], корексимін (8) [34,35], біснорагмонін (9)[36], ізохаманетин (10) [37], дихаманетин (11) [37] і суміш уваринолу (12) та ізуварінолу (13) [37] на основі їх спектроскопічних профілів і порівняння зі значеннями в літературі. Спектри 1D і 2D ЯМР lH і 13C, а також мас-спектри всіх виділених сполук доступні як додаткові матеріали.

З точки зору хемофенетики (новий термін для хемосистематики/хемотаксономії рослин) важливо відзначити, що присутність C-бензильованих флаванонів і C-бензильованих дигідрохалконів є особливим типом флавоноїдів, отриманих із добре відомого флаванонового піноцембрину. і були описані, зокрема, у видів роду Uoaria, що належить до родини Annonaceae [3, 38-42]. Наявність цих сполук у D. calycina свідчить про тісні хемофенетичні зв’язки з Uoaria. З іншого боку, слід провести подальші дослідження з іншими частинами рослини, а також іншими видами Diclinanona, щоб підтвердити цей хемофенетичний зв’язок. Флаванони та халкони широко поширені у вищих рослинах, але додавання бензильних груп є досить рідкісним і, здається, обмежується у Annonaceae родом Uoaria [3,39-42], а тепер – родом Diclinanona. Бензильні групи, ймовірно, виникають із шляху C6-C1, але функціональність о-гідрокси є незвичайною. Відсутність замісників у B-кільці у всіх цих флавоноїдах Uoaria та Diclinanona можна пов’язати з попереднім спостереженням щодо флавоноїдів Popowia cauliflora [38].

Ізохінолінові алкалоїди, виділені та описані в цій роботі, вже зареєстровані в кількох видах Annonaceae у різних родах. Деякі з них, такі як ліріоденін і анонаїн, вважаються хемофенетичними маркерами, і присутність цих алкалоїдів у D.calycina ще більше підсилює зв’язок цих хемофенетичних маркерів із родиною Annonaceae [5-7,15,20,27, 33-35,43].

Варто зазначити, що, згідно з Зідорном [44], хемофенетичні дослідження визначаються як дослідження, спрямовані на опис масиву спеціалізованих вторинних метаболітів у даному таксоні, як це вже спостерігалося в кількох опублікованих роботах [5-7,15,20 ,27,33-35,43-46]. Таким чином, хемофенетичні дослідження сприяють фенетичному опису таксонів, подібно до анатомічних, морфологічних і каріологічних підходів, які вже визнані такими, що мають велике значення для встановлення «природних» систем, і які продовжують залишатися надзвичайно важливими для опис класифікованих організмів за допомогою сучасних молекулярних методів [44].

2.2. Цитотоксичний аналіз

Цитотоксичну активність ізольованих сполук in vitro (табл. 2), за винятком сполук 2, 3, 5 і 8 (через їх низький вихід), оцінювали відносноракова клітиналінії HL-60 (промієлоцитарний лейкоз людини), MCF-7(аденокарцинома молочної залози людини), HepG2 (гепатоцелюлярна карцинома людини), HCT116 (карцинома товстої кишки людини) і неракова клітинна лінія MRC{{5} }(фібробласт легенів людини) за допомогою аналізу Alamar blue після 72 годин інкубації.

Among the compounds evaluated (Table2), the most promising results were verified for benzylated dihydroflavones dichamanetin (10), and the mixture of uvarinol (12)and isouvarinol (13), which showed moderate cytotoxic activity against the tested cancer cell lines and low cytotoxicity against the non-cancerous cell line MRC-5(>25.0 мкг.мл-1). Діхаманетин (11) продемонстрував цитотоксичну активність проти HL-60 і HCT116 зі значеннями IC50 15,78 мкг·мл-1（33,70 мкмоль·л-1） і 18,99 мкг·мл-1（40,56 мкмоль.л-1） відповідно. Суміш уваринолу (12) та ізуварінолу (13) продемонструвала цитотоксичну активність проти HL-60 зі значенням ICs0 9,74 мкг∶мл-1 та HCT116 зі значенням ICs0 17,31 мкг∶мл{ {30}}. Серед бензильованих дигідрофлавонів лише ізорамнетин (10) продемонстрував цитотоксичну активність проти HepG2 зі значенням IC50 19,79 мкг/мл-1(54,65 мкмоль.л-1). Відповідно до літератури описано, що бензильовані дигідрофлавони мають цитотоксичні властивості [39-42]. Серед описаних у цій роботі ізорамнетин (10), діхаманетин (11) і уварінол (12) описані в рамках цитотоксичних властивостей vitro проти людських пухлинних клітинних ліній карциноми носоглотки (KB) і P-388 лімфолейкозу (PS) зі значеннями IC50 5,3 і 4,1, 4,8 і 1,8 і 5,9 і 9,7 мкг/мл-1 відповідно [39,40]. Ці різні активності можна пояснити наявністю однієї або кількох гідроксибензильних груп, присутніх у молекулах, а також положенням, у якому ці групи з’єднані. Однак для підтвердження цього спостереження необхідні додаткові дослідження.

Цитотоксична активність in vitro алкалоїдів ізохінолінового походження анонаїну (2), лірі-аденіну (3) та (S)-(плюс)-ретикуліну (4) була нещодавно описана Menezes та ін. [2{{16] }}], Соуза та ін. [6] і Коста та ін. [43] з акцентом на ліріоденін, який продемонстрував потужну цитотоксичну активність проти ліній ракових клітин B{{10}}F10(меланома миші), HepG2 (гепатоцелюлярна карцинома людини), HL{{13 }} (промієлоцитарна лейкемія людини) і K562 (хронічна мієлоцитарна лейкемія людини） зі значеннями IC5s0 нижче 10,0 мкмоль.л-1【43】. Анонаїн продемонстрував помірну активність проти B16-F10, HepG2, HL60 і K562 зі значеннями IC50 нижче 19,0 мкмоль.л-1[20]. (S)-(плюс)-ретикулін продемонстрував помірну активність лише проти HepG2 зі значеннями IC50 15,35 мкмоль.л-1【 6,20】.

3. Матеріали та методи

3.1. Загальні експериментальні процедури

Оптичні обертання в метанолі (MeOH) реєстрували поляриметром P{{0}} (Jasco, Токіо, Японія) при 589 нм. 1D і 2D ЯМР експерименти були отримані в CDCl. (хлороформ-d) або CDCl плюс крапля CD, OD (метанол-du та CD, COCD3(ацетон-d6) при 298 K на ЯМР-спектрометрі AVANCE I HD (Bruker, Billerica, MA, USA), що працює при 11,75 T (Hand 13C при 500 і 125 МГц відповідно) і на ЯМР-спектрометрі Bruker AVANCE I 600, що працює при 14,1 T('H і 13Cat 60{) {63}} і 150 МГц відповідно). Усі хімічні зсуви 1H- і 13C-ЯМР （δ） представлені в ppm відносно сигналу тетраметилсилану при 0.00 ppm як внутрішнього порівняння, і константи зв’язку (D) подано в Гц. ЯМР-спектрометр був оснащений 5--мм багатоядерним інверсним зондом детектування (1D і 2D ЯМР експерименти) з z-градієнтом. Один зв’язок (HSQC) і два і Кореляційні експерименти з трьома зв’язками (HMBC)1H-13C-ЯМР були оптимізовані для середньої константи зв’язку JcH і LRJ(cH 140 і 8 Гц відповідно. Для аналізу мас-спектрометрії з низькою роздільною здатністю (LC-MS) зразки виділених сполук ресуспендували в метанолі (класу ВЕРХ), створюючи запас k розчинів (1 мг·мл-1). Аликвоти (5 мкл) вихідних розчинів додатково розбавляли до 5 мкг·мл і аналізували прямим вливанням у потрійний квадрупольний мас-спектрометр, модель TSO Quantum Access (Thermo Scientific, Сан-Хосе, Каліфорнія, США), обладнаний електророзпилювальною іонізацією. (ESI) або джерела хімічної іонізації при атмосферному тиску (APCI). Умови ESI-MS: напруга розпилення, 5 кВ; оболонковий газ, 10 довільних одиниць (arb); допоміжний газ, 5 арб; продувний газ, 0 арб; капілярна температура, 250 градусів; капілярна напруга, 40 В; трубчаста лінза, 70 В; діапазон мас, m/z від 100 до 1000. Умови APCI-MS: розрядний струм, 5 мкА; температура випарника, 350 градусів; тиск оболонкового газу, 25 довільна одиниця （arb）; тиск газу іонної розгортки, 0,0 арб.; тиск допоміжного газу, 10 арб; капілярна температура 250 град.С; зміщення лінзи тубуса, 70 В; зміщення скімера,0 В; діапазон мас, m/z від 100 до 1000. Аргон використовувався як газ зіткнення, а спектри MS/MS були отримані з використанням енергій зіткнення в діапазоні від 25 до 30 еВ. Силікагель 60 (Sigma-Aldrich, Сан-Луїс, Міссурі, США, 70-230 меш) використовували для колонкової хроматографії (CC), тоді як силікагель 60 F254 (Macherey-Nagel, Düren, Німеччина, 0,25 мм, алюміній) використовували для аналітичної та препаративної хроматографії (PTLC) (Macherey-Nagel, 1,00 мм, скло). Сполуки візуалізували шляхом опромінення ультрафіолетовим світлом 254/365, розпиленням реагенту п-анізальдегіду з наступним нагріванням на гарячій плиті та розпиленням реактиву Драгендорфа.

3.2.Рослинний матеріал

У цьому дослідженні ботанічний матеріал (кору) D.calycina було зібрано 27 травня 2017 року в заповіднику Adolpho Ducke (географічні координати: 02 градус 53'36.1S і 59 градус 58'28.9"W), Манаус, штат Амазонас , Бразилія та ідентифікований професором, доктором Антоніо Карлосом Веббером, систематиком рослин Департаменту біології Федерального університету до Амазонас (DB/UFAM). Ваучерний зразок номер 10 810 було збережено в гербарії DB/UFAM. доступ (зразок) було зареєстровано в Sistema Nacional de Gestao do Patrimonio Genetico e do Conhecimento Tradicional Associado (SISGEN) із записом A70EDCD.

3.3. Екстракція та ізоляція

Кору D.calycina спочатку сушили при кімнатній температурі протягом 24 годин, а потім сушили в печі з циркуляцією повітря протягом 48 годин при температурі 40 градусів, а потім подрібнювали в подрібнювачі з чотирма ножами (Marconi, Piracicaba, SP). , Бразилія) з отриманням порошкоподібного матеріалу (1340 г). Потім проводили вичерпну мацерацію гексаном (8×4 л), а потім MeOH (8×4 л). Отримані екстрактивні розчини концентрували в роторному випарнику при зниженому тиску (40-50 градус), отримуючи екстракти гексану (24,85 г) і MeOH (199,43 г), відповідно.

Аналіз ТШХ, виявлений за допомогою реактиву Драгендорфа, вказав на високу присутність алкалоідів в екстракті MeOH. Тому аліквоту екстракту MeOH (188,30 г) спочатку піддавали кислотно-основній екстракції, щоб отримати алкалоїдні (5,46 г) і нейтральні (4,47 г) фракції. Згодом частина алкалоїдної фракції (5.0g) була піддана хроматографічній колонці з силікагелем (CC), попередньо обробленою 10-відсотковим розчином NaHCO3 [12], елююваним гексаном (100 відсотків), гексаном-CHCl, (90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 і 10:90, об./о), CH2Cl2 (100 відсотків), CH2Cl 2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 та 10:90,0/м), EtOAc (100 відсотків), EtOAc-MeOH (95:05, 90:10, 85:05, 80:10, 75:25, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70,20 :80 і 10:90, об’єм/о) і, нарешті, МеОН, що дає 250 фракцій (по 30 мл кожна). Після ТШХ оцінки з використанням суміші CH2Cl2-MeOH у пропорціях 95:05, 90:10, 85:15 і 80:20 як систему елюентів (об’єм/проміжок), подібні зразки об’єднували, щоб отримати 16 фракцій (від F1 до F16).

Фракцію F5 (181,2 мг) із початкової СС, елюйованої гексаном-CH,Cl2 (50:50 до 10:90, об’єм/о), піддали новому силікагелю СС, використовуючи ту саму методологію, елюовану гексаном (100 відсотків), гексаном -CH,Cl2 (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 і 10:90, об./о), CH,Cl ,(100 відсотків), CHCl2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 та 10:90 ,o/), EtOAc (100 відсотків), EtOAc-MeOH (85:15, 70:30, 50:50, 30:70 і 15:85, /o) і MeOH (100 відсотків), що дало 118 фракцій ( 15 мл кожна), які об’єднували в 12 підфракцій (F5.1 до F5.12), згідно з оцінкою ТШХ аналізу з використанням суміші CH2Cl2-MeOH у пропорціях 95:05 і 90:10. Субфракція F5 .1 (28,9 мг), елюйований гексаном (100 відсотків), піддавали препаративній ТШХ, елююваній CH, Cl-MeOH (95:05, об’єм/об’єм, два елюювання), що давало 2 (1,4 мг) і 3 (1,7 мг), відповідно. Субфракції F5.4 (21,5 мг) елююють гексаном-CH,C (80:20, об.), F5.5 (16,7 мг) елююють гексаном-CH,Cl (80:20,70:30,60; 40 і 50:50). ,v/), і F5.6 (15,4 мг), елюйований гексан-CHCl2 (50:50, 40:60 і 30:70, v/o), об’єднували (53,6 мг) і також піддавали препаративній ТШХ з елююванням з CH,Cl-MeOH (95:05, об./м., два елюювання), що дає 3 (8,9 мг).

Фракція F6(2099,1 мг) із початкової CC, елюйованої гексаном-CHCl(10:90,v/)), CH2Cl, (100 %), і CH,Cl2-EtOAc (від 90:10 до 10:90, о/о) піддавали новій CC силікагелю, використовуючи ту саму методологію, наведену вище, елююючи тими самими системами розчинників, що дало 140 фракцій (30 мл кожен). Після TLC-оцінки з використанням суміші CH2Cl2-MeOH у пропорціях 95:05, 90:10 та 85:15 як системи елюентів (о/о), подібні зразки об’єднували, щоб отримати 13 субфракцій (F6 .1 до F6.13). Субфракція F6.6 (1541,3 мг) була піддана новій CC силікагелю з використанням тієї ж методології, наведеної вище, з елююванням тими самими системами розчинників, що дало 120 фракцій (по 30 мл кожна), які були проаналізовані за допомогою ТШХ (з використанням тієї ж методики, наведеної вище), що дало 12 нових підфракції (F6.6.1 до F6.6.12). Субфракцію F6.6.2 (17,0 мг), елюовану гексан-CH,Cl (60:40 і 50:50, об./об.), піддавали препаративній ТШХ, елюювали CH2Cl2-MeOH (90:10, v/o, одне елюювання), що призводить до 3 (1,4 мг). Субфракція F6.6.3 (643,3 мг) елююється гексан-CH2Cl2 (50:50, 40:60, 30:70, 20:80 і 10:90, o/v), CH2Cl2 (100 відсотків) і CH2Cl2-EtOAc (90:10 і 80:20,o/o) піддавали препаративній ТШХ, елююючи CH2Cl2-MeOH (90 :10, vfo, одне елюювання), що дає нову субфракцію F6.6.3.1 (161,8 мг), яку піддають новій препаративній ТШХ, елююючи EtOAc-MeOH (90:10, об’єм/о, одне елюювання), що дає 4(148,2 Субфракція F6.6.4 (90,2 мг), елюована CH2Cl2-EtOAc (70:30 і 60:40, o/o), була піддана препаративній ТШХ з елююванням CH2Cl-MeOH (90:10, v/o, одне елюювання) з отриманням 1 (1,4 мг) і 4 (50,1 мг) відповідно. Субфракцію F6.6.5 (83,4 мг), елюовану CH,Cl-EtOAc (60:40 і 50:50, o/o), також піддавали препаративній ТШХ, елююючи CH,Cl2-MeOH (90:10, ufo, одне елюювання), знову одержуючи 1 (1,5 мг) і 4 (45,5 мг), відповідно. Підфракцію F6.6.6 (101,4 мг), елюовану CH,Cl2-EtOAc (50:50 і 40:60, об./)), піддавали препаративній ТШХ, елююючи CH,Cl-MeOH (90: 10, vfo, одне елюювання) з отриманням 8 (3,4 мг) та іншої субфракції F6.6.6.1 (48,8 мг). Цю субфракцію (F6.6.6.1) піддавали препаративній ТШХ, елююючи спочатку EtOAc-MeOH (85 :15, vo, одне елюювання) і ззаду CHCl-MeOH (90:10, об’єм/об’єм, одне елюювання), що знову призводить до 4 (37,4 мг). Для цієї процедури хроматографічну пластину спочатку елюювали рухомою фазою EtOAc-MeOH (85:15, об’єм/проміжок, одне елюювання). Після цього елюювання хроматографічну пластинку висушували для повторного видалення розчинника, а потім піддавали новому елююванню рухомою фазою CH, Cl, -MeOH (90:10, vf, одне елюювання), що дало 4. Субфракція F6.6.7 ( 109,0 мг) з елююванням CH,Cl2-EtOAc (40:60, 30:70, 20:80 та 10:90, vfo) піддавали препаративній ТШХ з елююванням CH,Cl2-MeOH (90:10, об., одне елюювання), утворюючи іншу субфракцію F6.6.7.1 (24,8 мг), яку піддавали новій препаративній ТШХ, елююючи спочатку EtOAc-MeOH (85:15, об./о, одне елюювання), а потім CH2Cl2-MeOH (90:10, vfo, одне елюювання), що призводить до 9 (11,1 мг). Процедура виділення, використана для 9, була такою ж, як описана раніше для 4. Підфракцію F6.6.10 (92,0 мг), елюовану EtOAc-MeOH (60:40 і 50:50, об./об.), піддавали препаративній ТШХ, елююючи CH, Cl,-MeOH (90:10, об’єм/проміжок, одне елюювання), що дає 5 (1,7 мг) і 6 (7,8 мг) відповідно. Підфракцію F6.6.11 (326,0 мг), елюовану EtOAc-MeOH (50:50, 40:60, 30:70, 20:80 і 10:90, об./об.), піддавали препаративній ТШХ, елюювали CHCl- MeOH (90:10, об’єм/проміжок, одне елюювання) з отриманням 1 (2,4 мг) і 7 (12,5 мг) відповідно.

Фракцію F7 (692,4 мг) із початкової CC, очищену EtOAc (100 відсотків) і CHCl2-EtOAc (95:05, 90:10, 85:15 і 75:25, ofo), піддали новому силікагелю CВикористовуючи таку саму методологію, як описано для початкової CC з тими самими системами розчинників, одержуючи 110 фракцій (30 мл кожна). Після оцінки TLC із використанням суміші CH2Cl2-MeOH у пропорціях 95:05, 90:10 і 85 :15 як систему елюентів (о/о), подібні зразки об’єднували, щоб отримати 12 субфракцій (F7.1 до F7.12).F7.8(147,4 мг), елюованих CH,Cl2- EtOAc (50:50, 40:60 і 30:70, об’ємний відсоток) піддавали препаративній ТШХ, елююючи CHCl-MeOH (95:05, об’ємний ефір, одне елюювання), отримуючи 10 (5,4 мг) і 11( 120,6 мг) відповідно. F7.9 (144,2 мг) з елююванням CHCl2-EtOAc (30:70, 20:80 і 10:90, об’ємний відсоток) також піддавали препаративній ТШХ з елююванням CH,Cl,-MeOH( 95:05, об., одне елюювання), що дає 11 (91,2 мг) і суміш 12 і 13 (39,4 мг), відповідно.

Таліфолін (1): коричневий аморфний порошок; Н-ЯМР та 13С-ЯМР згідно з літературою [32]; LR-ESI(плюс)-МС [M плюс H]* плюс m/z 208.

Анонаїн (2): коричневий аморфний порошок; 1H-ЯМР та 13C-ЯМР згідно з літературою [33]; LR-ESI(плюс)-МС [M плюс H] плюс m/z 266.

Ліріоденін (3): жовті кристали (CH,Cl-MeOH 3:1); 1H-ЯМР та 13C-ЯМР відповідно до літератури [10,34]; LR-ESI(плюс)-МС [M плюс H] плюс m/z 276.

(S)-(плюс)-ретикулін(4): коричневий аморфний порошок; []p25 плюс 71,60(c 0,05 г/100 мл, MeOH); 1H-ЯМР та 13C-ЯМР відповідно до літератури [27; LR-ESI(плюс)-МС [M плюс Н] плюс m/z 30.

3,4-дигідро-7-гідрокси-6-метокси-1-ізохінолініл)(3-гідрокси-4-метоксифеніл)-метанон (дегідро-оксоноретикулін)(5 ): коричневий аморфний порошок; Дані H та 13C-ЯМР див. таблицю 1; LR-ESI(плюс)-МС [M плюс H] плюс m/z 328.

( плюс ){{0}}S,2R-ретикулін N-оксид(6): коричневий аморфний порошок; [lp25 плюс 136,4 (c0,146 г/100 мл, MeOH); Дані 13C-ЯМР 1 руки, див. таблицю 1; LR-APCI(плюс)-МС [M плюс H] плюс m/2346

( плюс ){{0}}S,2S-ретикулін N.-оксид (7): коричневий аморфний порошок; []p25 плюс 394,5 (c 0,03 г/100 мл, MeOH); Дані H і 13C-ЯМР див. таблицю 1; LR-APCI(плюс)-MS [M плюс H] плюс m/z346.

Корексимін (8): світло-жовтий аморфний порошок; []p25 плюс 201,1 (c 0,08 г/100 мл, MeOH)'H-ЯМР та 13C-ЯМР відповідно до літератури [34,35]; LR- ESI(плюс)-МС [М плюс Н] плюс m/z 328.

Біснораггемонін (9): коричневий аморфний порошок; 1H-ЯМР та 13C-ЯМР згідно з літературою [36]; LR-APCI(плюс)-МС [M плюс H] плюс m/z 328.

Ізохаманетин (10): світло-жовтий аморфний порошок; [p25-12.4(c 0,5 г/100 мл, MeOH)'H-ЯМР та 13C-ЯМР відповідно до літератури [37; LR-APCI(-)-MS [MH]-m/z361.

Діхаманетин (11): жовтий аморфний порошок; [ ]D25-10.7(c 0.5g/100 мл, MeOH);1H-ЯМР та 13C-ЯМР згідно з літературою [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]-m/z467.

Суміш уваринолу(12) та ізуварінолу(13): жовтий аморфний порошок; Н-ЯМР та 13С-ЯМР згідно з літературою [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]- m/z 573.

3.4. Цитотоксичний аналіз in vitro

3.4.1.Клітини

HL-60 (промієлоцитарний лейкоз людини), MCF-7 (аденокарцинома молочної залози людини), HepG2 (гепатоцелюлярна карцинома людини), HCT116 (карцинома товстої кишки людини) і MRC-5 (фібробласт легені людини) клітинні лінії були отримані з Американської колекції типових культур (ATCC, Манассас, Вірджинія, США) і культивувалися відповідно до рекомендацій керівництва ATCC з культур клітин тварин. Усі клітинні лінії перевіряли на наявність мікоплазми за допомогою набору для фарбування мікоплазми (Sigma-Aldrich), щоб підтвердити використання клітин, вільних від контамінації.

3.4.2. Аналіз на цитотоксичність

Для аналізу цитотоксичності життєздатність клітин кількісно визначали методом Alamar blue, як описано раніше [{{0}}]. Для всіх експериментів клітини поміщали в 96-лункові планшети. Хімічні компоненти розчиняли в диметилсульфоксиді (DMSO, Vetec Ouimica Fina Ltda., Duque de Caxias, RJ, Бразилія) і додавали до кожної лунки та інкубували протягом 72 год. Доксорубіцин (доксорубіцину гідрохлорид, чистота більше або дорівнює 95 відсоткам, лабораторія IMA SAIC, Буенос-Айрес, Аргентина) використовувався як позитивний контроль. Наприкінці лікування 20 мкл основного розчину (0,312 мг/мл) резазурину (Sigma-Aldrich Co.) додавали до кожної лунки. Поглинання при 570 нм і 600 нм вимірювали за допомогою зчитувача мікропланшетів SpectraMax190 (Molecular Devices, Саннівейл, Каліфорнія, США). Напівінгібуючу концентрацію (IC50) отримували за допомогою нелінійної регресії з 95-відсотковим довірчим інтервалом (CI95 відсотків) за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism (Intuitive Software for Science; Сан-Дієго, Каліфорнія, США).

4. Висновки

Фітохімічне дослідження кори D.calycina призвело до виділення та ідентифікації тринадцяти сполук (1-13); дев'ять ізохінолінових алкалоїдів (1-9) і чотирифлавоноїди(10-13). Алкалоїди належать до наступних підкласів: простий ізохінолін, талі онлайн (1); апорфін, анонаїн (2); оксоапорфін, ліріоденін (3); бензил-тетрагідроізохіноліни, ( плюс )-ретикулін(4), де гідрооксоноретикулін(3,4-дигідро-7-гідрокси-6-метокси-1-ізохінолініл)({{13} }гідрокси-4-метоксифеніл)метанон)(5), 1S,2R-ретикулін Ng-оксид(6) і 1S,2S-ретикулін N.-оксид (7); тетрагідро протоберберин, корексимін (8); і павін, біснорагмонін (9). У той час як флавоноїди належать до бензильованих дигідрофлавонів, ізорамнетин (10), дихаманетин (11) і суміш уваринолу (12) та ізуварінолу (13). Виділені сполуки вперше описані в D.calycina, а також у роду Diclinanona.

Цитотоксичну активність ізольованих сполук (крім анонаїну, ліріоденіну, 1,2-дигідрооксоноретикуліну та корексиміну) оцінювали проти раку (HL-60, MCF-7, HepG2 та HCT116) і неракові (MRC-5) ​​клітинні лінії. Серед них найбільш багатообіцяючі результати спостерігалися для бензильованих дигідрофлавонів дихаманетину (10) і

суміш уваринолу (12) та ізуварінолу (13), яка показала помірну цитотоксичну активність проти досліджуваних ліній ракових клітин （<20.0μg.ml-1）and low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 мкг·мл-'). Діхаманетин (11) продемонстрував цитотоксичну активність проти HL-60 і HCT116 зі значеннями IC50 15,78 мкг·мл-1 （33,70 мкмоль-л-1) і 18,99 мкг·мл-I（40,56 мкмоль .L-1）, відповідно, тоді як суміш уваринолу （12） та ізуварінолу (13) продемонструвала цитотоксичну активність проти HL-60, зі значенням IC50 9,74 мкг∶мл-І, та HCT116, з IC50 значення 17,31 мкг·мл-1. Ці результати на клітинних лініях пухлин також вперше описані для бензильованих дигідрофлавонів. Раніше була встановлена ​​цитотоксична активність ретикуліну, анонаїну та ліріоденіну, серед яких ліріоденін є найпотужнішою сполукою.

Результати, отримані в цій роботі, свідчать про те, що види родини Annonaceae є перспективним джерелом біологічно активних сполук із цитотоксичними властивостями, і дозволяють продовжити їх дослідження на інших моделях біологічних аналізів.

Список літератури

1. Couvreur, TLP; Пірі, доктор медичних наук; Chatrou, LW; Сондерс, РМК; Su, YCF; Річардсон, JE; Erkens, RHJ Рання еволюційна історія родини квіткових рослин Annonaceae: стійка диверсифікація та бореотропічне георозподіл. J. Biogeogr. 2011, 38, 664–680. [CrossRef]

2. Corrêa, MP Dicionário das Plantas Úteis do Brasil e das Exóticas Cultivadas; IBDF Ministrério da Agricultura: Ріо-де-Жанейро, Бразилія, 1984.

3. Лебеф, М.; Печера, А.; Bhaumik, PK; Мукерджі, Б.; Мукерджі, Р. Фітохімія Annonaceae. Фітохімія 1982, 21, 2783–2813. [CrossRef]

4. Рупрехт, Ю.К.; Хуей, Ю.-Х.; McLaughlin, JL Annonaceous acetogenins: огляд. J. Nat. Виробник 1990, 53, 237–278. [CrossRef]

5. Лусіо, ASSC; Алмейда, JRGDS; Да-Кунья, EVL; Таварес, Дж. Ф.; Filho, JMB Алкалоїди Annonaceae: поява та підбірка їхньої біологічної активності. В Алкалоїди; Knolker, H.-J., Ed.; Elsevier: Амстердам, Нідерланди, 2015; Глава 5; Том 74, стор. 233–409. [CrossRef]

6. Соуза, Каліфорнія; Нарделлі В.Б.; Пас, WHP; Пінейро, MLB; Родрігес, ACBC; Бомфіфім Л.М.; Соарес, MBP; Безерра, Д.П.; Чаар, Дж.С.; Кулен, HHF; та ін. Фенілпропаноїди, отримані з азарону, і алкалоїди, отримані з ізохіноліну, з кори Duguetia pycnastera (Annonaceae) та їх цитотоксичність. Quim. Nova 2020, 43, 1397–1403. [CrossRef]

7. Араухо, MS; Сільва, ФМА; Кулен, HHF; Коста, Е. В. Ізохінолінові алкалоїди з кори Guatteria olivacea (Annonaceae). Біохім. сист. Ecol. 2020, 92, 104105. [CrossRef]

8. Нгоуонпе, AW; Мбобда, ASW; Хаппі, Г.М.; Мбіантча, М.; Татуедом, OK; Алі, MS; Латіф, М.; Tchouankeu, JC; Kouam, SF Натуральні продукти з лікарської рослини Duguetia staudtii (Annonaceae). Біохім. сист. Ecol. 2019, 83, 22–25. [CrossRef]

9. Сантос, RC; Соуза, А.В.; Андраде-Сілва, М.; Круз, KCV; Кассуя, штат Каліфорнія; Кардозо, Каліфорнія; Вієйра, MC; Formaggio, ASN Антиоксидантне, протиревматичне та протизапальне дослідження екстракту та дицентринону з Duguetia furfuracea (A. St.-Hil.) Benth. & Гачок. f. J. Етнофармакол. 2018, 211, 9–16. [CrossRef]

10. Коста Є.В.; Пінейро, MLB; Соуза, ADL; Барісон, А.; Кампос, Франція; Вальдес, RH; Уеда-Накамура, Т.; Діас Фільо, BP; Nakamura, CV Трипаноцидна активність оксоапорфіну та піримідин- -карболінових алкалоїдів з гілок Annona foetida Mart. (Annonaceae). Молекули 2011, 16, 9714–9720. [CrossRef]

11. Сільва, Д. Б.; Туллі, ЕКО; Міліта, GCG; Коста-Лотуфо, LV; Пессоа, С.; Moraes, MO; Альбукерке, С.; Siqueira, JM Протипухлинна, трипаноцидна та антилейшманіальна активність екстракту та алкалоїдів, виділених з Duguetia furacea. Фітомедицина 2009, 16, 1059–1063. [CrossRef] [PubMed]

12. Коста Є.В.; Пінейро, MLB; Ксав'єр, CM; Сільва, ЮРА; Амарал, ACF; Соуза, ADL; Барісон, А.; Кампос, Франція; Феррейра, А.Г.; Мачадо, GMC; та ін. Піримідин- -карболін та інші алкалоїди Annona foetida з антилейшманіальною активністю. J. Nat. Виробник 2006, 69, 292–294. [CrossRef]