​На основі мережевої фармакології та експериментів на тваринах для вивчення впливу фенілетаноїдного глікозиду Cistanche tubulosa на діабетичну нефропатію

Анотація: Мета Дослідити ефектЦистанхефенілетанолглікозиди(CPhGs) надіабетична хвороба нирок(DKD) на основі мережевої фармакології та експериментів на тваринах. Методи Для аналізу використовували метод UHPLC-QE-MSхімічні компоненти ХФГ. Бази даних TCMSP і Swiss Target Prediction використовувалися для скринінгу основних компонентів. Бази даних OMIM і GeneCards використовувалися для отримання цілей, пов’язаних з DKD. Після отримання загальних цілей веб-сайт STRING був використаний для побудови мережі взаємодії білка. База даних DAVID використовувалася для аналізу шляху GO, KEGG, а програмне забезпечення Cytoscape використовувалося для побудови мережі «CPhGs core component-target-pathway». Десять щурів були випадковим чином відібрані як звичайна група, а решті щурів годували кормом з високим вмістом цукру та жиру та робили одну внутрішньоочеревинну ін’єкцію STZ для встановлення моделі DKD. Їх було розділено на модельну групу, групу дапагліфлозину (1 мг/кг), а також CPhG з високою, середньою та низькою дозами (500, 25{{40}}, 125 мг/кг) групи, 10 тварин у кожній групі, медикаментозне втручання протягом 6 тижнів, спостерігали за загальним станом, визначали масу тіла та перевіряли рівень глюкози в крові щотижня; Після останньої дози збирали 24-годинну сечу. Визначити 24-годинний загальний білок сечі (24-UTP); зібрати кров із черевної аорти та забрати її, відокремити сироватку та визначити азот сечовини (BUN), сечову кислоту (UA), загальний холестерин (TC), тригліцериди (TG) і високий кров’яний тиск. Рівні ліпопротеїнів високої щільності (ЛПВЩ) і ліпопротеїнів низької щільності (ЛПНЩ), фарбування HE та фарбування за Массоном використовувалися для спостереження за патологічними змінами в нирковій тканині, ELISA використовувався для визначення сироваткових IL-1 , IL{{17} } та рівні TNF-, а для виявлення ниркової тканини використовували Вестерн-блот. Експресія білків JAK2, p-JAK2, STAT3, p STAT3, SOCS3. Результати Загалом за допомогою технології UHPLC-QE-MS було виявлено 699 компонентів. Після скринінгу було отримано 16 основних компонентів CPhG та 323 пов’язані мішені. CPhGs і DKD поділили 99 мішеней. Ключовими цілями були STAT3, SRC, EGFR тощо. Аналіз шляху KEGG перевірив 151 сигнальний шлях, показавши, що сигнальний шлях IL-17, сигнальний шлях PI3K/Akt, сигнальний шлях TNF тощо можуть відігравати ключову роль у лікування DKD за допомогою CPhG. CPhGs можуть збільшити масу тіла щурів з DKD (P<0,01), зменшити споживання води (P<0,01), регулювати метаболізм глюкози та ліпідів, знизити 24-рівні UTP і BUN (P<0,01) і покращити ниркову тканину . Патологічні пошкодження зменшили експресію білка p-JAK2/JAK2 і p-STAT3/STAT3 у нирковій тканині (P<0,01) і збільшили експресію білка SOCS3 (P<0,01). Висновок CPhG втручаються в DKD за допомогою кількох компонентів, кількох мішеней та багатьох шляхів, можливо, шляхом інгібування JAK2/

Сигнальний шлях STAT3.

Ключові слова: Цистанхе фенілетанол глікозид; діабетична нефропатія; УВЕРХ-ЯЯ-МС; мережева фармакологія; дослід на тваринах; Сигнальний шлях JAK2 /STAT3

СКІЛЬКИ ЧАСУ ПОТРІБНО, ЩОБ CISTANCHE ДІЯВ НА ХВОРИХ НА НИРКИ?

Діабетична хвороба нирок (DKD), як одне з найважливіших мікросудинних ускладнень діабету, є не лише основним фактором, що призводить дохронічні захворювання нирокале також є основною причиною термінальної стадії ниркової недостатності (ESRD) у всьому світі. Причина [1-2]. Клінічне лікування DKD в основному передбачає, по-перше, контроль рівня цукру в крові, артеріального тиску та ліпідів у крові, а по-друге, захист функції нирок, уникнення використання нефротоксичних препаратів і покращення способу життя [3-4]. Однак через складний патогенез ДЗН і відсутність конкретних цілей втручання, сучасні варіанти лікування мають обмеження та неефективність. Захворюваність на термінальній стадії DKD все ще зростає. Тому дуже важливо знайти ефективні натуральні препарати.

Cistanche Deserticola Y. C. Ма абоСістанш К.Висушені м'ясисті стеблаCistanche tubulosa (Schenk) Wightз лускатим листям [5] були вперше зареєстровані в "Shen Nong's Materia Medica" і були занесені до списку вищого сорту. Вони відомі як «женьшень пустелі» [6]. Вони бувають солодкими, солоними і теплими. , повертається до меридіанів нирок і товстого кишечника, живить нирковий ян, відновлює есенцію і кров, зволожує кишечник і діє проносно. Дослідження показують, що фенілетаноїдні глікозиди (CPhG) є одними з його основних активних інгредієнтів і відповідають за його розвиток.

Матеріальна основа для здійснення фармакологічної дії; Екстракт цистанхи має протидіабетичну [7-8], проти раку печінки [9], захищає нирки [10-11], нейропротекторну [12-13] та інші фармакологічні ефекти, але наразі CPhGs не ефективні при лікуванні DKD. Його вплив і механізми неясні.

У цьому дослідженні використовувалися методи мережевої фармакології та молекулярного докінгу [14], взявши CPhGs як об’єкт дослідження, передбачивши та проаналізувавши його основні активні інгредієнти та потенційні мішені для лікування DKD, а потім встановивши комбінацію стрептозоцину (STZ)-індукованого високого рівня. Модель щурів DKD, яких годували ліпідним кормом, використовували як об’єкт дослідження in vivo, щоб забезпечити довідку для клінічного розширення та застосування відповідних методів лікування та подальших досліджень механізму дії.

1 матеріал

1.1 Тварини

70-тижневих самців щурів SD із рівнем SPF, масою тіла (240±20) г було придбано в Експериментальному центрі на тваринах Сіньцзянського медичного університету [Ліцензія на використання експериментальних тварин № SYXK (нова) {{4} }], у Тварин адаптивно вирощували протягом 1 тижня при температурі (22 ±2) градуси, відносній вологості від 50% до 70% і 12 годин/12 годин циклу чергування світла та темряви. Експеримент був схвалений Комітетом з етики тварин Медичного експериментального центру тварин Сіньцзянського медичного університету (етичний номер IACUC-20220127-19).

1.2 Реактиви та препарати

CPhGs (batch number 201610, purity >80%) було надано Xinjiang Hotan Dichen Co., Ltd. Дапагліфлозин (номер партії NB2248) був придбаний у AstraZeneca, Великобританія. Корми з високим вмістом цукру та жиру (Кат. № Boaigang-B1135DM) і STZ (Партія № 2021110307) були придбані у Beijing Boai Port Biotechnology Co., Ltd.; мікроальбумін сечі (номер партії 20220611), азот сечовини (номер партії 20220626), кислота сечова (номер партії 20220613), холестерин загальний (номер партії 20220615), тригліцериди (номер партії 20220616), ліпопротеїни високої щільності (номер партії 20220614) ), і ліпопротеїни низької щільності (номер партії 20220615) були придбані в Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute; інтерлейкін-6 (IL-6, номер лоту JL20896), інтерлейкін-1 (IL-1 , номер лоту JL20884) і фактор некрозу пухлини (TNF- , номер лоту 13202) ) були придбані у Shanghai Jianglai Biotechnology Co., Ltd.; Кроляче поліклональне антитіло JAK2 (номер партії 22v9316), кроляче поліклональне антитіло p-JAK2 (номер партії 78g9360), кроляче поліклональне антитіло STAT3 (номер партії 15x8824), поліклональне антитіло кролика p-STAT3 (номер партії 74m1478), поліклональне антитіло кролика SOCS3 (партія номер 31d4841) усі були придбані у Jiangsu Qianke Biotechnology Research Center Co., Ltd.; HRP-мічене козяче анти-кроляче поліклональне антитіло IgG (номер партії 20000758) було придбано у Wuhan Mitaka Biotechnology Co., Ltd.; кроляче моноклональне антитіло до актину (номер партії AC230205001), буфер для лізису RIPA (номер партії 20220416), набори для визначення концентрації білка BCA (номер партії 20230401) були придбані у Beijing Solebao Technology Co., Ltd.

1. 3 Інструменти

Надвисокоефективна рідинна хроматографія Vanquish, мас-спектрометр високої роздільної здатності Q Exactive Focus, центрифуга Heraeus Fresco17, автоматичний рідер мікропланшетів FC (Thermo Fisher Scientific, США); JXFSTPRP-24 м’ясорубка (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd.); УФ-лічильник чистої води Mingche D24 (Німеччина, компанія Merck Millipore); Колонка ACQUITY UPLC BEH C18 (1,7 мкм, 2,1 мм×100 мм) (American Waters Company); Глюкометр Accu Chek Performa (Швейцарська компанія Roche); Кріостат CM1850UV, вертикальний флуоресцентний мікроскоп DM300 (компанія Leica, Німеччина); GL-88B вихровий вимірювач (Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.); електронні аналітичні ваги (компанія Bio-Rad, США).

2 методи

2. 1 UHPLC-QE-MS аналіз

2.1.1 Приготування досліджуваного розчину

Зважте 100 мг CPhGs, додайте 500 мкл 80% метанолу, перемішайте протягом 30 с, обробляйте ультразвуком на бані з крижаною водою протягом 1 години, дайте постояти при -40 градусах протягом 1 години, центрифугуйте при 4 градусах , 12 000 об/хв протягом 15 хв, аспіруйте супернатант, 0. Відфільтруйте через мікропористу мембрану 22 мкм і зберігайте в холодильнику -80 градусів.

2.1.2 Умови хроматографії

Колонка ACQUITY UPLC BEH C18 (1,7 мкм, 2,1 мм × 100 мм); рухома фаза ацетонітрил (A) -1% мурашина кислота (B), градієнтне елюювання (0 ~ 11 хв, 15% ~ 75% A; 11-12 хв, 75%-98% A; 12-14 хв, 98% A; від 14 до 14,1 хв., від 98% до 15% A; Об'ємна витрата 0 . 5 мл/хв; температура колонки 35 градусів; об'єм ін'єкції 5 мкл.

2.1.3 Умови мас-спектрометрії

режим повного сканування ddMS2; об'ємна витрата оболонкового газу 45 арб. об'ємна витрата допоміжного газу 15 арб.; капілярна температура 400 градусів; енергія зіткнення в режимі NCE 15% ~ 30% ~ 45% циклу; напруга розпилення ± 4,0 кВ.

2.2 Дослідження мережевої фармакології

2. 2. 1 ХФГ

Скринінг цільового компонента: відсортуйте хімічні компоненти, проаналізовані UHPLC-QE-MS, відповідно до відносного вмісту та видаліть ті, хімічну структуру яких ще не визначено. Введіть серійний номер InChIKey перевірених інгредієнтів у базу даних TCMSP, щоб отримати фармакокінетичні параметри кожного інгредієнта. Виходячи з умов пероральної біодоступності (OB) > 30% і схожості з препаратом (DL) > 0,18, кандидати, які відповідають вимогам, будуть перевірені. Введіть номер SMILES кожного компонента в базу даних Swiss Target Prediction, щоб передбачити ціль і отримати цільовий хімічний компонент CPhGs.

2. 2. 2 DKD

Скринінг цільового захворювання Використовуйте «діабетична нефропатія» як пошуковий термін для пошуку цільового захворювання в базах даних OMIM, GeneCards і NCBI.

2. 2. 3 Побудова мережі компонент-мішень-захворювання

Перехресні цілі компонентів і захворювань CPhGs були отримані за допомогою програмного відображення R, а програмне забезпечення Cytoscape 3.7.2 використовувалося для побудови мережевої системи компонент-ціль, у якій аналітичний плагін виявляв основні цілі.

2. 2. 4 Побудова мережі білок-білкової взаємодії (PPI)

Імпортуйте цільові білки перетину компонентів і захворювань у базу даних STRING, побудуйте мережу взаємодії білок-білок (PPI), видаліть білки без підключених вузлів у мережі та встановіть рівень достовірності найнижчої оцінки взаємодії білків на {{1} }.700. Побудуйте мережу PPI, завантажте її результати у форматі TSV, імпортуйте їх у програмне забезпечення Cytoscape 3.7.2 і використовуйте плагін аналізу для подальшого відбору основних цілей.

2. 2. 5 GO, аналіз KEGG

Використовуйте розділ Functional Annotation у базі даних DAVID, щоб виконати аналіз збагачення на цілях перетину компонентних захворювань. Спочатку встановіть параметри аналізу, введіть ціль перетину в поле Gene List, виберіть офіційний-ген-символ як цільовий ідентифікатор, виберіть Gene List як тип даних (List Type) і виберіть «Homo Sapiens (Species)» як цільове джерело (Species). Race)", почніть аналіз після підтвердження параметрів аналізу, отримайте результати аналізу GO та KEGG, а потім скористайтеся онлайн-платформою малювання ImageGP, щоб намалювати бульбашкову діаграму результатів аналізу KEGG та GO. Програмне забезпечення Cytoscape 3.7.2 створює компонент - картина мережі цільового шляху.

2. 2. 6 Молекулярний докінг

Спочатку завантажте тривимірну структурну діаграму активного інгредієнта у форматі SDF із бази даних PubChem, потім завантажте тривимірну структурну діаграму мішені перетину у форматі PDB із Глобальної бази даних білків США (PDB) і, нарешті, завантажте її в CB-Dock. веб-сайт для молекулярного докінгу. Відкрийте домінантні конформації стикування та візуалізуйте їх за допомогою Pymol.

2.3 Експерименти на тваринах

2.3.1 Моделювання, групування та введення ліків

10 щурів випадковим чином відібрали як звичайну групу та годували звичайним кормом, а решту щурів годували кормом з високим вмістом цукру та жиру. Через 6 тижнів їм зробили одноразову внутрішньоочеревинну ін’єкцію 30 мг/кг STZ (0,1 ммоль/л STZ, розчиненого в натрій-цитратному буфері рН 4,5), а через 72 години взяли кров із хвостової вени. для визначення рівня глюкози в крові натще (ГКГ). Якщо FBG більше або дорівнює 16,7 ммоль/л, модель діабету була успішно встановлена ​​[15]; продовжити Їх годували кормом з високим вмістом цукру та жиру протягом 2 тижнів. Моделювання DKD було визнано успішним на основі позитивного рівня глюкози в сечі та 24-годинного загального білка в сечі (24-UTP), що перевищує або дорівнює 20 мг. Серед них 3 загинули в процесі моделювання і 7 були невдалими. , загалом 50 були успішними. Щурів, які були успішно змодельовані, випадковим чином розділили на модельну групу, групу дапагліфлозину (1 мг/кг) і групи високої, середньої та низької дози CPhG (500, 250, 125 мг/кг). Кожній групі введення вводили внутрішньошлунково. Щурам у нормальній групі та модельній групі давали відповідні препарати, а щурам у нормальній групі та модельній групі давали однакову кількість нормального фізіологічного розчину через зонд один раз на день протягом загалом 6 тижнів. Протягом періоду введення щурам у кожній групі, крім нормальної групи, продовжували давати корм з високим вмістом жиру.

2.3.2 Виявлення біохімічного індикатора

Після 6 тижнів втручання CPhG у щурів збирали 24-годинну сечу та вимірювали 24-годинний загальний білок сечі (24-UTP); відбирали кров із хвостової вени натщесерце для виявлення рівнів FBG; кров забирали з черевної аорти 4 ст., 1500 об/хв. Центрифугуйте протягом 10 хвилин, щоб відокремити сироватку та виявити азот сечовини сироватки.

BUN), сечова кислота (UA), загальний холестерин (TC), тригліцериди (TG), ліпопротеїни високої щільності (HDL), ліпопротеїни низької щільності (ліпопротеїни низької щільності LDL).

2.3.3 Спостереження за патологічною морфологією ниркової тканини

Щурів анестезували пентобарбіталом натрію і забивали. Нирки очищали, зважували, фіксували 4% параформальдегідом, зневоднювали, прозорі, занурювали у віск, заливали та розрізали для фарбування гематоксилін-еозином (HE).

Після фарбування за Массоном морфологію тканини спостерігали під мікроскопом і використовували програмне забезпечення Image-Pro Plus 6.0 для аналізу інтегрованої оптичної щільності та кількісного визначення відносної площі колагенових волокон.

2. 3. 4 ІФА

Метод використовували для виявлення рівнів сироваткових факторів запалення у щурів. Рівні IL-6, IL-1 і TNF- були виявлені відповідно до інструкцій набору.

2. 3. 5 Вестерн-блоттинг для виявлення експресії спорідненого білка

Відбирали тканину нирки щура, додавали лізат RIPA для екстракції загального білка та визначали концентрацію методом BCA.

Після електрофорезу в додецилсульфаті натрію в поліакриламідному гелі перенести на мембрану PVDF і після блокування JAK2 (1: 2000), p-JAK2 (1: 1000), STAT3 (1: 2000), p-STAT3 (1: 2000), Антитіла SOCS3 (1:2000), -актину (1:2000), інкубувати при 4 градусах протягом ночі, додати мічене HRP вторинне антитіло IgG (1:5000) та інкубувати при кімнатній температурі протягом 1 години, проявити за допомогою електролюмінесцентного набору, експонувати за допомогою білкового гелю, використовуючи програмне забезпечення Image J

Кількісний аналіз штук. Використовуючи -актин як внутрішній еталон, співвідношення сірого значення цільової смуги та внутрішньої еталонної смуги є відносною експресією білка.

2.4 Статистичний аналіз

Дані були оброблені програмним забезпеченням SPSS 25.0, і дані були виражені як (x±s). Для порівняння між групами використовували односторонній дисперсійний аналіз. П<0.05 indicates that the difference is statistically significant.