Послаблюючий вплив діеколу на гіпертонічну нефропатію у щурів зі спонтанною гіпертензією

Ang II викликає вазоконстрикцію і, як наслідок, гіпертензію [30]. При гіпертензії РААС активується системно, і посилення РААС супроводжується в кількох органах, таких якнирка[31,32]. Гіперактивація внутрішньониркової РААС є важливим механізмом гіпертонічної та хронічної хворобихвороба печінки[31,32]. Як TGF 1, так і Ang II індукують активацію внутрішньониркової РААС і посилюють експресію ангіотензиногену, реніну, АПФ і AT1R, які індукують ЕМТ [33]. У нашому дослідженні систолічний АТ SHRs був значно знижений введенням ECE або DK. Сироватковий рівень Ang II SHRs був значно знижений введенням ECE або DK. Експресія AT1R у корі та мозковій речовині SHR була значно знижена при введенні ECE або DK.

Посилення регуляції РААС, наприклад, підвищення експресії AT1R, активує низхідний сигнальний шлях TGF 1 [34]. Активований РААС, TGF 1 індукує ЕМТ через SMAD-залежний і SMAD-незалежний шляхи [33]. Як SMAD-залежний сигнальний шлях, передача сигналів TGF 1 трансдукується через TGF RII і TGF RI і призводить до активації SMAD2/3. [10]. SMAD4 зв'язується з SMAD2/3 і сприяє транслокації комплексу SMAD в ядро ​​[10]. Транслоковані SMAD посилюють експресію генів EMT, таких як Snail, Twist і ZEB [34]. У нашому дослідженні експресія AT1R була значно вищою в корі та мозковій речовині щурів SHR, ніж у щурів WKY, і була знижена введенням ECE або DK. Експресія TGF та SMAD2/3 у корі та мозковій речовині SHR була знижена введенням ECE або DK.

CISTANCHE ПОКРАЩИТЬ ІНФЕКЦІЮ НИРОК/НИРОК

ЕМТ характеризується втратою епітеліального маркера, такого як Е-кадгерин, і досягненням мезенхімальних маркерів, таких як -SMA, віментин і фібронектин [35]. Е-кадгерин є найбільш вираженим кадгерином в епітеліальних клітинах і, таким чином, часто використовується як епітеліальний маркер [36]. -SMA є фенотиповим маркером клітин міофібробластів, і його експресія є ознакою пізніх стадій ЕМТ [37]. -SMA-експресуючі міофібробласти, які піддаються ЕМТ, індукують синтез надмірного ECM та аномального ремоделювання ECM танирковийфіброз [37]. Гіпертонічна нефропатія індукує гломерулосклероз та інтерстиціальний фіброз, що спричиняє зниженняфункції нирокі значна протеїнурія [6]. У нашому дослідженні експресія віментину та -SMA в мозковій речовині та корі головного мозку SHR була збільшена та зменшена при введенні ECE або DK. Обсяг зони фіброзу в мозковій речовині та корі головного мозку SHR збільшувався та зменшувався при введенні ECE або DK. Індекс гломерулярного склерозу SHRs підвищувався і знижувався при введенні ЕХЕ або ДК.

Об’єм сечі щурів SHR прогресивно зменшувався порівняно з об’ємом сечі щурів WKY того ж віку [38]. Відомо, що чим більше виділення натрію з сечею, тим менше виділення калію з сечею. Більше того, у дослідженнях на людях співвідношення Na/K у сечі пов’язують із підвищенням АТ та швидким порушеннямфункції нирок[39]. У нашому дослідженні об’єм сечі щурів SHR був нижчим, ніж у щурів WKY, навіть незважаючи на те, що кількість споживаної води не відрізнялася між щурами SHR і WKY. Співвідношення Na/K у сечі щурів SHR значно відрізнялося серед щурів WKY, SHR та груп, які отримували ECE або DK. Співвідношення Na/K у сечі використовувалося як маркер споживання натрію та калію з їжею в дослідженнях на людях [39]. АТ підвищувався зі збільшенням споживання натрію. Однак підвищене споживання калію знижувало АТ за рахунок збільшення екскреції натрію з сечею [40]. Таким чином, співвідношення Na/K у сечі пов’язане з АТ у людей [40]. У нашому дослідженні всіх тварин не годували дієтою з високим вмістом натрію, що пояснює, чому співвідношення Na/K у сечі між групами не показало істотної різниці. Артеріальна гіпертензія має тенденцію до збільшення протеїнурії [37]. Відомо, що співвідношення альбуміну та креатиніну в сечі пов’язане зі зниженням швидкості клубочкової фільтрації [41]. Попередні дослідження показали, що розвиток мікроальбумінурії у SHR спричинений переважним ушкодженням канальців, яке індукує втрату з сечею білків з низькою молекулярною масою [42, 43]. У нашому дослідженні відношення альбуміну до креатиніну в сечі щурів SHR було вищим, ніж у щурів WKY, і знижувалося при введенні ECE або DK

Попередні дослідження показали, що деякі поліфеноли мають інгібуючу дію на активність АПФ [14–17]. Однак ці дослідження повідомляли лише про інгібіторну активність АПФ як значення IC50, яке є 50-відсотковою концентрацією інгібування позитивного контролю, і вони не показали антигіпертензивного ефекту або захисного ефекту від гіпертонічної нефропатії у тварин. Одне дослідження показало, що ECE знижує АТ у 2-нирка1-clip Goldblatt hypertensive rats [44]. Пірогалол-флороглюцинол-6,6-біеккол знижував АТ на тваринній моделі гіпертензії, викликаної дієтою з високим вмістом жиру, шляхом модулювання судинної дисфункції [45]. Однак ці дослідження показали лише зниження АТ і не оцінювали, чи показав ЕХЕ якийсь ефект послаблення гіпертонічної нефропатії. Наше дослідження показало, що ECE та DK зменшили експресію AT1R/TGF/SMAD2/3 униркаі знизив рівень сироватки Ang II. Крім того, ECE та DK знизили EMT,нирковийфіброз і гломерулосклероз. Здається, ECE та DK можуть бути корисними для послаблення гіпертонічної нефропатії

4. Матеріали та методи

4.1. Підготовка ЕХЕ та Виділення ДК

ECE були отримані від Aqua Green Technology Co., Ltd. (Чеджу, Корея). E. cava ретельно промивали чистою водою і висушували на повітрі при кімнатній температурі протягом 48 год. Її подрібнювали, додавали 50% етанол з наступним нагріванням при 85 ◦C протягом 12 годин. ECE фільтрували, а потім, коли концентрували, стерилізували нагріванням при високій температурі протягом 40–60 хв, а потім сушили розпиленням. Потім був виділений директор, який є одним із репрезентативних флоротанінів E. cava. Коротко, відцентрову розподільчу хроматографію проводили з використанням двофазної системи розчинників, яка змішувала чисту воду, етилацетат, н-гексан і суміш метанолу (співвідношення 7:7:2:3). Органічну стаціонарну фазу заповнювали в колонці, а рухому фазу заповнювали в колонці, дотримуючись порядку зменшення швидкості (2 мл на хвилину), і використовували для розділення. Ми дотримувалися методів Dr. Son та ін. (2019) [45].

CISTANCHE ПОКРАЩИТЬ НИРКОВУ/НИРКОВУ НЕДОСТАТНІСТЬ

4.2. Тваринна модель гіпертензії

Самці щурів SHR (віком 8 тижнів) і самці щурів WKY (віком 8 тижнів) були придбані в Orient Bio (Sungnam, Корея) і зберігалися при постійній температурі приблизно 24 ◦C, відносній вологості 50–55 відсотків і світлі/ темний цикл 12 год/12 год. Сублімацію щурів проводили протягом 1 тижня. Щурів випадковим чином розділили на шість груп (по п'ять щурів у групі): (i) група WKY, у якій щурам перорально вводили питну воду протягом 4 тижнів; (ii) група SHR, у якій щурам перорально вводили питну воду протягом 4 тижнів; (iii–v) Група SHR, у якій щурам перорально вводили ECE (iii) 50 мг/кг/добу, (iv) 100 мг/кг/добу та (v) 150 мг/кг/добу протягом 4 тижнів; (vi) Група SHR, у якій щурам перорально вводили 2,5 мг/кг/день DK протягом 4 тижнів. Через 4 тижні споживання води, об’єм сечі та хімічний аналіз сечі перевіряли за допомогою метаболічної клітки протягом 24 годин. Після завершення метаболічного аналізу всіх щурів умертвили відповідно до етичних принципів Інституційного комітету з догляду та використання тварин Університету Гачон (номер схвалення: LCDI-2019-0121).

4.3. Імуногістохімія

Тканина нирокПарафінові блоки розділяли на 8 мкм, поміщали на предметні скла з желатиновим покриттям і сушили при 37 ◦C протягом 3 днів. Theниркаслайди тканин депарафінували, а потім інкубували з 0,3% перекисом водню (Sigma-Aldrich, MO, США) протягом 10 хв. Після цього предметні скла тричі промивали фосфатно-сольовим буфером (PBS) та інкубували з тваринною сироваткою для інгібування неспецифічного зв’язування антитіл. Крім того, їх інкубували з первинними антитілами (анти-AT1R, анти-E-кадгерин, анти- -SMA та антивіментин) і тричі промивали PBS. Потім предметні скла тканини інкубували з біотинільованими вторинними антитілами з набору ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, США), інкубували протягом 3 годин із блокуючим розчином і тричі промивали PBS. Тканинні слайди були проявлені з 3,3-діамінобензидином як субстратом протягом 3 хвилин, змонтовані в розчині DPX на основі ксилолу (Sigma-Aldrich) і візуалізовані за допомогою світлової мікроскопії (Olympus Optical Co., Токіо, Японія) .

4.4. Екстракція РНК і кількісна полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі (qRT-PCR)

РНК щураниркатканин виділяли за допомогою реактиву RNAiso Plus (TAKARA, Японія) згідно з інструкцією виробника. Theниркатканини вперше були розділені на дві частини, а саме: коркову частину та мозкову частину. Тканини нирок дрібно нарізали та подрібнювали в порошок, а порошки ресуспендували в 1 мл реагенту RNAiso Plus, змішаному з 0.1 мл чистого гладкого хлороформу (Amresco, Солон, Огайо, США), а потім центрифугували при 13,000× g протягом 20 хв при 4 ◦C. Після центрифугування супернатант змішували з 0,25 мл чистого ізопропілового спирту Glade, а екстраговані осадки РНК промивали 70-відсотковим спиртом і центрифугували при 7500 × g протягом 5 хвилин при 4 ◦C. Висушені гранули розчиняли в 10–30 мкл чистої води, обробленої діетилпірокарбонатом, і РНК кількісно визначали та перевіряли за допомогою NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, MA, США). Комплементарну ДНК (кДНК) готували з РНК за допомогою набору для синтезу кДНК (PrimeScript™, TAKARA). Кількісна полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі (qRT-PCR) визначила рівні РНК зниркатканини. Прямий і зворотний праймери змішували з дистильованою водою, а потім 10 мкл суміші поміщали в 384-лунковий планшет для qRT-PCR. Згодом додавали кДНК і зелений SYBR (TAKARA), а потім перевіряли за допомогою апарату для ПЛР-ПЛР (Bio-Rad, Геркулес, Каліфорнія, США). Гени, що представляють інтерес, перераховані в додатковій таблиці S1. Ми дотримувалися методів Dr. Son та ін. 2019 [45].

4.5. Імуноферментний аналіз (ELISA)

Щоб підтвердити рівень Ang II у сироватці, аліквоту відібраної крові (1,5-1,7 мл) додавали в пробірки для сепарації сироватки (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, США), а потім центрифугували при 2000 × g протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. . Після цього відокремлену сироватку перемістили в нову пробірку і зберігали в морозильній камері. Набір Ang II ELISA (MyBioSource, Сан-Дієго, Каліфорнія, США) використовували для аналізу присутності сироватки відповідно до інструкцій виробника. Ang II вимірювали протягом 1 тижня після взяття крові у тварин.

4.6. Гістологічний аналіз

4.6.1. Трихромна пляма Массона (MT).

Трихромне фарбування за Массоном (MT) підтверджує фібрознирка.Блоки парафінованіниркатканини нарізали до товщини 8 мкм, поміщали на предметне скло для покриття та сушили при 37 ◦C протягом 3 днів. Предметні скла тканини депарафінізували ксилолом і спиртом, повторно фіксували розчином Буена протягом 24 год і промивали проточною водопровідною водою протягом 3 хв. Предметні скла занурювали в розчин гематоксиліну заліза Вейгерта на 10 хвилин і в розчин фуксину червоної кислоти Бібріха на 15 хвилин, а потім диференціювали розчином фосфорно-вольфрамової кислоти протягом 10 хвилин. Нарешті предметні скла переносили в розчин анілінового синього на 3 хв, а потім промивали водою. Пофарбовані предметні стекла монтували розчином DPX на основі ксилолу (Sigma-Aldrich) і візуалізували за допомогою світлової мікроскопії (Olympus). Колагенові волокна в зоні фіброзу мають синій колір, тоді якнирковийепітелій має червоний колір. Площі фіброзу, пофарбовані МТ, вимірювали за допомогою програмного забезпечення ImageJ. Оригінальні зображення пофарбованої МТ нирки були перетворені в зображення RGB, а потім ці зображення були деконволюційні за допомогою програмного забезпечення ImageJ за допомогою плагіна деконволюції кольорів.

4.6.2. Періодична кислота-Шиффова фарба (PAS).

Періодичне фарбування кислотою-Шиффом (PAS) підтвердило пошкодження клубочківнирка. Блоки парафінованіниркатканини нарізали до товщини 8 мкм, поміщали на предметне скло для покриття та сушили при 37 ◦C протягом 3 днів. Предметні скла тканин депарафінізували ксилолом і спиртом, гідратували водою, окислювали 0.5% розчином періодної кислоти протягом 5 хвилин і промивали водою. Скела занурювали в реактив Шиффа на 15 хв, а потім промивали теплою водопровідною водою протягом 5 хв. Нарешті предметні скла переносили в розчин гематоксиліну Майєра на 1 хв, а потім промивали водою. Пофарбовані предметні стекла монтували розчином DPX на основі ксилолу (Sigma-Aldrich) і візуалізували за допомогою світлової мікроскопії (Olympus).

Гломерули були відібрані випадковим чином, а пошкодження клубочків оцінювалося за допомогою напівкількісного методу підрахунку балів (класи 0–4) за допомогою PAS-фарбуванняниркаслайди тканини.

(1) Ступінь 0: нормальні клубочки; (2) 1 ступінь: мінімальний склероз (склеротична ділянка до 25 відсотків); (3) Ступінь 2: помірний склероз (склеротична ділянка від 25% до 50%); (4) Ступінь 3: помірно-важкий склероз (склеротична ділянка від 50 до 75 відсотків); (5) Ступінь 4: важкий склероз (склеротична ділянка від 75 до 100 відсотків); Гломерулосклеротичний індекс (GSI) розраховували за таким рівнянням: (4 × n4) плюс (3 × n3) плюс (2 × n2) плюс (1 × n1) / n4 плюс n3 плюс n2 плюс n1 плюс n0, де n ( x) є числомнирковийгломерулярний склероз кожного ступеня [46]. Цей аналіз проводився в групах лікування спостерігачем у масці.

4.7. Вимірювання систолічного артеріального тиску, діастолічного артеріального тиску та середнього артеріального тиску

Систолічний АТ, діастолічний АТ і середній артеріальний АТ вимірювали за допомогою неінвазивної системи CODA tail-cuff (Kent Scientific Corp., Torrington, CT, USA). Сублімацію щурів проводили протягом 20 хв протягом 5 днів, а в останній день вимірювали АТ.

4.8. Моделювання in vitro з використанням клітин TCMK-1

Клітини TCMK-1, лінію клітин проксимальних канальців миші, були придбані в American Type Culture Collection (Вашингтон, округ Колумбія, США). Середовище для культивування використовували модифіковане середовище Ігла за Дульбекко з високим вмістом глюкози (Gibco; Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США), 10% фетальної бичачої сироватки (FBS) і 1% пеніцилін-стрептоміцину. Для підтвердження інгібіторних ефектів ЕХЕ та ДК у клітинах TCMK-1, оброблених ангіотензином ІІ, ми обробили ЕХЕ (5, 25, 50 мкг/мл) і ДК (1,8 мкг/мл) 100 нмоль/л ангіотензину ІІ (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) протягом 12 год. Телмісартан (1 мкмоль/л, Sigma-Aldrich) використовували як антагоніст рецептора AT1 і попередньо обробляли перед ангіотензином II протягом 3 годин [47].

CISTANCHE ПОКРАЩИТЬ БІЛЬ У НИРКАХ/НИРКАХ

4.9. Підготовка протеїну та Вестерн-блот

Для виділення білка з клітин TCMK-1, оброблених ангіотензином II, клітини зіскрібали за допомогою буфера для лізису RIPA з інгібітором фосфатази та протеїнази (EzRIPA; ATTO; Токіо, Японія) та інкубували на льоду протягом 20 хв. Після центрифугування при 13,000× g протягом 20 хвилин при 4 ◦C чисті супернатанти перемістили в нову пробірку, а концентрацію супернатантів проаналізували за допомогою набору для аналізу біцинхонінової кислоти (набір BCA; Thermo Fisher Scientifific, Inc.; Waltham, MA, США). Щоб підтвердити експресію білка з клітин TCMK-1, було проведено блот. Рівну кількість білків лізату (30 мкг/доріжку) розділяли за допомогою 10% додецилсульфату натрію-поліакриламідного гелю за допомогою електрофорезу. Потім біжучі білки переносили на полівініліденфторидні мембрани, які інкубували з розведеними первинними антитілами (анти- -актин, AGTR1, TGF-, SMAD2/3 і pSMAD2/3) при 4 ◦C. Інкубовані мембрани з антитілами ретельно промивали за допомогою трис-буферного фізіологічного розчину з 0,1% Tween 20 та інкубували з вторинними антитілами протягом 2 годин при кімнатній температурі. Усі мембрани були розроблені методом розширеної хемілюмінесценції (LAS-4000s; GE Healthcare, Чикаго, Іллінойс, США). Інформацію про антитіла, використану в цьому дослідженні, можна знайти в таблиці S2.

4.10. Статистичний аналіз

Результати представлені як середнє ± стандартне відхилення та р-значення<0.05 mean="" it="" is="" statistically="" significant.="" the="" kruskal–wallis="" test="" was="" used="" to="" validate="" the="" differences="" among="" the="" groups,="" and="" the="" mann–whitney="" u="" test="" was="" used="" in="" the="" spss="" ver.="" 22="" software="" (ibm="" corporation;="" ny,="" armonk,="" usa)="" completed="" post="" hoc="" comparisons.="" means="" denoted="" by="" a="" different="" letter="" indicate="" significant="" differences="" between="">

5. Висновки

На завершення, AT1R був активований у SHR, і сигнальний шлях збільшив TGF і SMAD2 або 3, що індукувало EMT. ECE або DK зменшили сигнальний шлях і зменшили EMT. Тому ECE або DK зменшували маркери мезенхімальних клітин, такі як експресія віментину та -SMA, фіброзної тканининирка, а також співвідношення альбумін/креатинін у сечі та ослаблений ЕМТ. Крім того,нирковийфіброз призвело до відновленняфункції нирок(Малюнок 7).