Залежні та незалежні від арилового вуглеводневого рецептора шляхи забезпечують ефект куркуміну проти старіння

Будь ласка зв'яжітьсяoscar.xiao@wecistanche.comдля отримання додаткової інформації

Анотація:Арильний вуглеводневий рецептор (AhR) є ліганд-активованим фактором транскрипції, активність якого може модулюватися поліфенолами, такими як куркумін. AhR і куркумін мають еволюційно збережений вплив на старіння. Тут ми досліджували, чи і як AhR опосередковує ефект куркуміну проти старіння у різних видів. Використовуючи комбінацію аналізів in vivo, in vitro та in silico, ми продемонстрували, що куркумін має AhR-залежні або незалежні ефекти залежно від контексту. Ми виявили, що в Caenorhabditis elegans AhR опосередковує подовження тривалості життя, викликане куркуміном, швидше за все, через ліганд-незалежний інгібуючий механізм, пов’язаний з його антиоксидантною активністю. Куркумін також продемонстрував незалежну від AhR дію проти старіння, таку як захист від білків, схильних до агрегації, і окислювального стресу в C.elegans і сприяння міграційній здатності первинних ендотеліальних клітин людини. Ці незалежні від AhR ефекти значною мірою опосередковуються шляхом Nrf2/SKN-1.

Натисніть тут, щоб дізнатися більше

Ключові слова:арилуглеводневий рецептор; куркумін; окислювальний стрес; Caenorhabditis elegans; миші; ендотеліальні клітини; в природних умовах; в пробірці; in silico

1. Введення

Арильний вуглеводневий рецептор (AhR) є повсюдним ліганд-активованим фактором транскрипції, ідентифікованим як визначальний фактор токсикологічної відповіді на 23,7,8-тетрахлордибензо-п-діоксин (TCDD) у ссавців [1]. Сигнальні шляхи AhR були добре описані в клітинах ссавців. Коротко кажучи, нелігандований AhR локалізується в цитоплазмі та стабілізується різноманітними кофакторами, такими як білок теплового шоку 90-kDa (Hsp90), AHR-взаємодіючий білок (AIP) і шаперон p23. Зв’язування з екзогенними (наприклад, TCDD) або ендогенними (наприклад, кінуренін) лігандами сприяє транслокації цього комплексу в ядро, де AhR дисоціює від своїх кофакторів і збирається в гетеродимер з AHR ядерним транслокатором (ARNT). Отриманий комплекс AHR/ARNT зв’язується з чутливими до ксенобіотиків елементами (XRE) батареї чутливих генів детоксикації фази I та II, що зрештою призводить до деградації лігандів [2]. Окрім своєї ролі в ксенобіотичній відповіді, AhR бере участь у різноманітних патофізіологічних процесах, починаючи від імунітету [3,4], запалення [5,6], метаболізму ліпідів і глюкози [7,8] до серцево-судинних, печінкових та захворювання інших органів [9-12], були відкриті в останні десятиліття. Зростаюча кількість доказів також вказує на різнорідність і, здавалося б, суперечливу роль AhR у процесі старіння, яку, тим не менш, можна узгодити, беручи до уваги вплив на тканини, дози та види [13].Cistanche ЧингісханНегативна роль AhR у старінні та пов’язаних з віком особливостях була описана для різних видів [14,15]. У порівнянні з Caenorhabditis elegans дикого типу, мутантний штам AhR, ahr-1(ju145), має тривалість життя та здоров’я; у мишей дефіцит AhR покращує функцію судин і підвищує активність синтази оксиду азоту і, отже, біодоступність NO; і, нарешті, була виявлена ​​позитивна кореляція між експресією AhR і жорсткістю судин у людей середнього та літнього віку [14]. Крім того, в епідеміологічному дослідженні китайської популяції експресія AhR була пов’язана з частотою ішемічної хвороби серця [16].

Cistanche може омолоджувати старіння

Слід зазначити, що багато сполук, що впливають на старіння або вікові захворювання [17-19], можуть модулювати активність AhR [20-22]. У той час як активація AhR ксенобіотиками призводить до різних видів раку у ссавців [23, 24], було показано, що фактори харчування та навколишнього середовища мають протилежний AhR-залежний вплив на здоров'я C.elegans [25]. Серед дієтичних модуляторів AhR такі поліфеноли, як куркумін, були значною мірою вивчені щодо їх впливу на здоров’я. Куркумін — це жовтий пігмент із Curcuma longa, який має численні еволюційно збережені корисні властивості, включаючи антиоксидантну, протизапальну та антивікову дію [26]. Куркумін запобігає агрегації білків і збільшує тривалість життя C.elegans і Drosophila шляхом модуляції білкового гомеостазу [27-29].подовження життя cistancheКрім того, при введенні трансгенній моделі миші з хворобою Альцгеймера це значно зменшило загальне навантаження бета-амілоїду (A) [30]. У старих мишей куркумін відновлював біодоступність NO, таким чином зменшуючи окислювальний стрес і покращуючи ендотеліальну дисфункцію та жорсткість артерій, оцінювану за швидкістю пульсової хвилі аорти (PWV) — одним із найважливіших клінічних вимірювань або маркерів жорсткості великої еластичної артерії [31]. Кілька досліджень на людях також показали захисну дію куркуміну на здоров’я серцево-судинної системи [32]. Однак спосіб дії куркуміну все ще залишається незрозумілим, і, що більш важливо, чи опосередкований AhR його благотворний вплив на здоров’я, не було досліджено [33,34]

Модельні організми, такі як нематода C.elegans, відіграли важливу роль у визначенні генетичних та екологічних детермінант старіння. Це пов’язано з його багатьма корисними властивостями, включаючи легке використання в лабораторії, короткий термін служби та виробництво великої кількості потомства шляхом самозапліднення. Геном C.elegans повністю секвенований, і більшість його генів і шляхів є еволюційно консервативними. Білкова послідовність AhR зберігається протягом еволюції, і в C.elegans ортологи AhR і ARNT кодуються AhR-пов’язаними (ahr-1) і ahr-1 асоційованими (aha{{4 }})генів відповідно [35]. Відповідні білки, AHR-1 і AHA-1, приблизно на 40 відсотків ідентичні послідовності з білками ссавців і утворюють гетеродимер (також з аналогами ссавців), який може зв’язувати XRE мішені генів in vitro [36].cistanche нзAHR-1 в основному експресується в типах нейронних клітин, таких як ГАМКергічні нейрони [37l], і відіграє ключову роль у контролі розвитку нейронів [38]. На відміну від AhR хребетних, AHR-1 не зв’язує TCDD та інші споріднені ксенобіотики [35,39], але має спільні риси з AhR ссавців у регуляції нейронних процесів, розвитку та фертильності [37,38,{ {8}}], що зрештою свідчить про те, що предковий AhR не брав безпосередньої участі в контролі генів для деградації токсичних лігандів [44,45]. Таким чином, ми визнали C.elegans унікальною та потужною модельною системою для ідентифікації та вивчення родових функцій AhR, можливо, не пов’язаних з його реакцією на ксенобіотики.

У цьому дослідженні ми досліджували роль AhR у ефектах куркуміну проти старіння різних видів. Завдяки поєднанню аналізів in vivo, in vitro та in silico ми виявили, що куркумін демонструє різні корисні ефекти проти старіння через незв’язані ahr-1-залежні та незалежні механізми. Ми виявили, що виснажені тварини C.elegans ahr-1- є довгожителями, але більш чутливими до окислювального стресу. Хоча куркумін не подовжив тривалість життя мутантів C.elegans ahr-1, він сприяв їх стійкості до окислювального стресу. Куркумін також сприяв антиоксидантній відповіді та міграційній здатності первинних ендотеліальних клітин людини (ЕК) незалежно від AhR, ефект, який в основному залежав від Nrf2/SKN-1 у різних видів. SKN-1 є ортологом C.elegans окисно-відновного транскрипційного фактора Nrt2 (зв’язаного з ядерним фактором еритроїдного 2-фактора 2) людини, який відіграє еволюційно збережену роль у клітинному та організмовому гомеостазі та відповіді на окислювальний стрес [ 46,47] Результати зв’язування в результаті аналізу клітинного репортера та моделювання in silico ліганд-зв’язуючого домену AHR-1 (LBD), потім ми показали, що куркумін, швидше за все, пригнічує активність AHR-1 у ліганд- обов'язково-незалежний спосіб. Примітно, що згідно з даними C.elegans і EC куркумін і прооксиданти демонструють протилежний вплив на активність AHR-1, що означає, що куркумін може модулювати активність AHR-1 через свою антиоксидантну здатність або безпосередньо або опосередковано через регуляцію Nrf2/SKN-1 або інших окисно-відновних регуляторних білків.

2. Матеріали та методи

2.1. C.elegan1s

2.1.1. C. elegans Штами та культивування

Ми використовували такі штами C.elegans: N2 [дикий тип], CZ2485 [ahr-1(jul45)], NV38b [alhr-1(ju145);unc-54p:Q40 :YFP], NV38wt [unc-54p::Q40:YFP] (оригінальний штам AM141 [48]), NV42a [unc-54p::alphasymuclein::YFP, ahr-1 (jul45)], NV42wt [unc-54p::alphasynuclein::YFPI (оригінальний штам NL5901 [49]), NV35a [ahr-1(ju145);(pAF15)gst-4 p::GFP::NLS], NV35wt (pAF15)st-4p::GFP::NLS] (оригінальний штам CL2166). Для підтримки черв’яків синхронізували відкладанням яєць при 20 градусах на середовищі для росту нематод (NGM) та годували E.coli OP50 згідно з методами, описаними в [25]. Для експериментів черв’яків синхронізували на чашках з додаванням E.coli HT115(DE3) на чашках з додаванням 1 мМ IPTG (Fisher Scientific, Geel, Бельгія).

2.1.2. Приглушення генів за допомогою РНК-опосередкованої інтерференції (RNAi)

Приглушення генів було досягнуто шляхом годування плазмід, що експресують E.coli HT115(DE3), дцРНК проти специфічних генів [50]. Годування RNAi застосовувалося безперервно від народження до смерті. Для аналізу резистентності до юглону з бактеріями HT115(skn-1) черв’яків L4 годували RNAi протягом 24 годин перед перенесенням їх на свіжі чашки з юглоном.

2.1.3. Штами та ріст E.coli

Бактерії вирощували в середовищі LB при 37 градусах протягом ночі. При використанні переносників E.coli середовище LB було доповнено 0.01 відсотком ампіциліну та 0,0005 відсотком тетрацикліну. E.coli HT115(L4440), HT115(ugt{{{8} }),HT115(skn-1) і OP50 були отримані з бібліотеки Ahringer C. elegans RNAi [51].

2.1.4.Тривалість життя

Аналіз тривалості життя розпочали з синхронізованої популяції черв’яків, яку щодня переносили на свіжі чашки NGM протягом періоду фертильності. Після фази фертильності тварин переносили щодня через день. Мертві, живі та цензуровані тварини оцінювалися під час процесу передачі. Тварин вважали мертвими, якщо вони не демонстрували ані руху, ані реакції на ручний подразник платиновим дротом, ані активності глоткового насоса. Тварини з внутрішнім вилупленням (мішками) і вибуховою вульвою або які померли висушеними на стіні піддавалися цензурі. Кількість мертвих і цензурованих тварин використовувалася для аналізу виживання в OASIS[52] або OASIS 2[53]. Для розрахунку середньої тривалості життя та кривої виживання в OASIS та OASIS 2 використовували оцінку Каплана-Майєра, а р-значення розраховували за допомогою логарифмічного рангового тесту між об’єднаними популяціями тварин.

2.1.5. Період руху/здоров'я

Рух був встановлений як параметр здорового старіння, а фаза активного руху називається періодом здоров'я. Його оцінювали в популяціях, використаних для аналізу тривалості життя. Тварини, які або повзали спонтанно, або після ручного стимулу, вважалися рухомими, тоді як мертві тварини або тварини без поведінки повзання вважалися нерухомими. Статистичний аналіз проводили, як описано для тривалості життя.

2.1.6. Лікування куркуміном C. elegans

Куркумін (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Німеччина) розчиняли в ДМСО (Carl Roth, Карлсруе, Німеччина) у концентрації 100 мМ і подали в NGM після автоклавування. Кінцева концентрація куркуміну у середовищі становив 100 мкМ (0,1 відсотка ДМСО). Контрольні планшети містили 0,1% ДМСО. Глисти лікували безперервно, починаючи з яєць.

2.1.7. Кількісна оцінка агрегатів PolyQ

Агрегати PolyQ40 візуалізували за допомогою флуоресцентної мікроскопії (100-кратне збільшення) у 10-денних черв’яків, анестезованих 15 мМ азидом натрію (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Німеччина). Щоб оцінити кількість агрегатів, зображення були зшиті за допомогою плагіна Fiji pair-wise stitching [54] для створення цілих черв’яків, а кількість агрегатів була кількісно визначена на Фіджі [55] за допомогою плагіна «Analyze Particles».

2.1.8. Кількісна оцінка агрегатів х-синуклеїну

-синуклеїнові агрегати в м’язах голови 7-денних черв’яків були візуалізовані за допомогою флуоресцентної мікроскопії (400× збільшення) у черв’яків, анестезованих 15 мМ азидом натрію (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Німеччина, S2002). ). Зображення були сегментовані за допомогою Plastik (версія 1.3.0) (лабораторія Анни Крешук у Європейській лабораторії молекулярної біології, Гейдельберг, Німеччина) (доступно на https://www.ilastik.org/, доступ 10 квітня 2018 р.)[56] . Сегментовані зображення були використані для аналізу кількості агрегатів на Фіджі [55] за допомогою плагіна «Analyze Particles».

2.1.9. Аналіз термінів мікрочіпів та GO

Були зібрані зразки з п’яти незалежних реплікатів із приблизно {{0}}денними черв’яками для кожної умови, а РНК було виділено та завантажено в чіп Affymetrix. Необроблені дані мікрочіпів у форматі CEL аналізували за допомогою програмного забезпечення R (версія 3.4.2) (R Foundation, Відень, Австрія) та Bioconductor (The Bioconductor Project, Bioconductor є відкритим кодом і відкритою розробкою) [57]. Фонову корекцію, нормалізацію та розрахунок експресії виконували за допомогою олігопакету58] та методу RMA. Для контролю якості масиву використовувався пакет arrayQualityMetrics 3.34.0 [59]. Через перевірку якості зразок ahr-1C5 було виключено з подальшого аналізу. Диференційно експресовані гени були ідентифіковані за допомогою пакету limma та лінійної моделі та модерованої t-статистики з FDR для тестування на численні порівняння [6{{20}}]. Було застосовано р-значення 0,1. Диференційовано експресовані гени аналізували для збагачення термінів генної онтології за допомогою Cytoscape (версія 3.6.0) (Консорціум Cytoscape, незалежна некомерційна організація)[61] з плагіном ClueGo (версія 2.5.0) (Лабораторія інтегративного Cancer Immunology, Париж, Франція) [62]. Доступ до даних мікрочипу можна отримати через номер доступу Gene Expression Omnibus. GSE195769.

2.1.10.Кількісна оцінка ROS

MtROS було виявлено у живих мутантних черв’яків wt та ahr-1 за допомогою MitoSOX Red (Ther-moFisher Scientific, Драйайх, Німеччина). Нематоди були синхронізовані шляхом відкладання яєць на пластини IPTG з використанням бактерій HT115(L4440) як їжі. Потім, через 48 годин, 50 тварин на стадії L4 перенесли на свіжоприготовані чашки з 10 мкМ MitoSOX Red, засіяні HT115 (L4440), вбитими УФ-променями. Черв'яків інкубували в темряві при температурі 20 градусів. Після 16 годин інкубації їх перемістили на нові чашки NGM, нанесені живим HT115 (L4440) на 1 годину, щоб видалити залишковий барвник із кишечника. Для візуалізації нематоди встановлювали на предметні скла з 2-відсотковою агарозною подушечкою, анестезували шляхом додавання 10 мМ левамізолу та фіксували за допомогою ProLongTM Glass Antifade Mountant (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Німеччина). Зображення були отримані негайно за допомогою мікроскопа Zeiss Axio Imager M1 (Carl Zeiss, Inc., Кельн, Німеччина) з використанням об’єктива 40× і фільтра DsRed. Після цього область голови хробака була обрана вручну, і інтегрована інтенсивність була розрахована за допомогою програмного забезпечення для обробки зображень Fij 55.

2.1.11. Аналіз етилового ефіру тетраметилродаміну (TMRE).

Щоб оцінити потенціал мітохондріальної мембрани, нематоди синхронізували шляхом відкладання яєць на пластинах IPTG, засіяних бактеріями HT115(L4440). У день експерименту TMRE (Invitrogen, Юджин, штат Орегон, США) розчиняли в ДМСО до концентрації 5 мМ, а потім розбавляли до 30 мкМ інактивованим нагріванням HT115 (L4440) (30 хв, 65 градусів ）). Загалом 150 мкл цього розчину додавали на чашку та залишали сушитися в темряві приблизно на 30 хв. Шістдесят дорослих синхронних черв’яків на 1, 3 або 5-му днях зрілості збирали на підготовлені пластини TMRE і залишали, щоб пляма поглиналася протягом 2 годин у темряві при 20 градусах. Після фарбування хробаків переносили на чашки IPTG, засіяні термоінактивованим HT115(L4440) та інкубували протягом 1 години в темряві при 20 градусах, щоб видалити залишковий барвник із кишечника.розмір пеніса cistancheДля візуалізації 10 нематод помістили на предметні скла з 2-відсотковим розчином агарози, анестезували шляхом додавання 10 мМ левамізолу та зафіксували за допомогою ProLongM Glass Antifade Mountant (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Німеччина). Для кожного експерименту було підготовлено по 5 слайдів на групу. Зображення були отримані негайно за допомогою мікроскопа Zeiss Axio Imager M1 (Carl Zeiss, Кельн, Німеччина) з використанням об’єктива 2,5 × і фільтра DsRed. Інтенсивність флуоресценції розраховували за допомогою Fiji [55].

2.1.12. Аналіз швидкості кровопостачання глотки та моторики

Нематоди N2 і CZ2485 синхронізували відбілюванням [63] і яйця залишали в буфері для інкубаційних яєць (118 мМ NaCl, 48 мМ KCl, 2 мМ CaCl, 2 мМ MgCl2, 25 мМ Hepes, рН 7,3) на ніч при орбітальному струшуванні. Личинки L1 були помічені на NGM, доповненому 1 мМ IPTG і що містила 0.1% ДМСО або 100 мкМ куркуміну. Бактерії HT115（L4440） використовували як їжу. Молодих дорослих черв’яків збирали з буфером M9, центрифугували (300 g × 3 хв) і двічі промивали для видалення бактерій. Черв’яків інкубували з 0-1 мМ H, O, (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Німеччина) (100 черв’яків/100 мкл) протягом 2 годин при орбітальному струшуванні. Контрольних хробаків інкубували лише з буфером М9. Через 2 години черв’яків перемістили на NGM, доповнений 1 мМ IPTG і містив 0,1 відсотка ДМСО або 100 мкМ куркуміну, і засіяли бактеріями HT115(L4440) як їжу. Швидкість накачування глотки, оцінена шляхом підрахунку кількості скорочень кінцевої цибулини глотки протягом 1-хвилинного інтервалу (насоси/хв), і аналіз рухливості, оцінена шляхом підрахунку кількості ударів тіла (нахилів тіла/хв) у Буфер M9 протягом 1 хвилинного інтервалу оцінювали від 2 до 20 годин пізніше.

2.1.13. Тест на гостру чутливість до Juglone

Нематоди N2 і CZ2485 синхронізували шляхом відкладання яєць на чашки NGM з ДМСО або 100 мкМ куркуміну. Планшети доповнювали 1 мМ IPTG і висівали бактерії HT115(L4440) або HT115(ugt-45) ​​як корм. Щоб оцінити ефект skin-1 RNAi, хробаків синхронізували шляхом відкладання яєць на чашки з ДМСО або куркуміном, засіяні бактеріями HT115(L4440). Коли нематоди досягли личинкової стадії L4, їх переносили на 24 години на чашки з ДМСО або куркуміном, засіяні бактеріями HT115(шкіра-1). Дорослих черв’яків 1-го дня (25 черв’яків) перемістили на свіжі чашки NGM, що містять 200 мкМ Juglone (Merck, Дармштадт, Німеччина) і засіяли 25 мкл 10× концентрованої бактеріальної культури протягом ночі. Виживаність хробака при окислювальному стресі, викликаному юглоном, перевіряли рухом, спровокованим дотиком, щогодини протягом 6 годин. Тварин вважали мертвими, якщо вони не реагували на дотик платиновим дротяним щипцем. Нематоди, висушені на стіні, були піддані цензурі. Було підраховано кількість мертвих і цензурованих тварин, а для аналізу виживання використовувався онлайн-додаток для аналізу виживання OASIS2 [53].

2.1.14. Кількісна оцінка інтенсивності GST-4:GFP

NV35wt і NV35a були синхронізовані шляхом відкладання яєць на чашки NGM, додані 1 мМ IPTG і містять 0.1% ДМСО або 100 мкМ куркуміну. Бактерії HT115（L4440）, HT115(ugt-45) і HT115(skin-7) використовували як їжу. Щоб візуалізувати флуоресценцію GFP, дорослих черв’яків на 1 день анестезували 10 мМ розчином гідрохлориду левамізолу та встановлювали на 2-відсоткові агарозні подушечки. Зображення були негайно отримані за допомогою мікроскопа Zeiss Axio Imager M1 (Carl Zeiss, Кельн, Німеччина), 2,5-кратне збільшення), а потім проаналізовані за допомогою програмного забезпечення CellProfiler (команда проекту CellProfiler, лабораторія Cimini в Широкому інституті MIT і Гарвард, Массачусетс, США). Коротше кажучи, зображення були оброблені за допомогою конвеєра, щоб сегментувати черв’яків на кожному зображенні зі світлопольної мікроскопії та відокремити їх від фону. Потім вимірювали інтегровану інтенсивність GFP на хробака.

2.1.15. Напівкількісна ПЛР у реальному часі (qPCR) у C. elegans

Було зібрано зразки з 3 незалежних реплікатів із приблизно 1000 3-денними черв’яками для кожної умови та виділено РНК. Після промивання та елюції вміст РНК визначали кількісно за допомогою спектрофотометрії, і 1-2 мкг РНК використовували для синтезу кДНК (набір Omniscript RT (Qiagen, Hilden, Німеччина).порошок цистанчіПари праймерів наведено в таблиці S1. Для кПЦР у реальному часі кДНК розводили 1:20 у 10 мМ TRIS (рН 8,0). Для реакції використовували набір qPCR Green Core (Jena Biosciences, Єна, Німеччина) або набір GoTaq⑧ qPCR (Promega, Walldorf, Німеччина). Зразки досліджували в циклері MyiQ2 (BioRad, Feldkirchen, Німеччина), і експресію кожного зразка вимірювали в двох примірниках на тому самому багатолунковому планшеті. Експресію розраховували відносно еталонних генів act-1 і CDC-42 за допомогою програмного забезпечення iO5. Усі зібрані дані були включені для дослідження генів відповідно до інструкцій користувача BioRad, і експресія була розрахована за допомогою нормалізованої експресії (ddCr). Ефективність кожної реакції пари праймерів була додана для правильного кількісного визначення нормалізованої експресії. Ефективність оцінювали за розведеннями кДНК 1:20, 1:100, 1:500 і 1:2500. З нормалізованих значень експресії розраховували кратність зміни порівняно з диким типом для кожної повторності.

2.2. Клітини ссавців

2.2.1. Культивування клітин Cos7

Клітини Cos7 (ATTC, #CRL-1651) культивували при 37 градусах і 5% CO в модифікованому середовищі Ігла за Дульбекко (DMEM) (Gibco/ThermoScientific, Dreieich, Німеччина) з 1% пірувату, 1% глутамаксу та 1% 0 відсотків фетальної бичачої сироватки (FBS) (Gibco/ThermoScientific, Dreier-ich, Німеччина) і додаткові пеніциліни (10.000 одиниць/мл)/стрептоміцин （10.000 мкг/ мл).Як тільки клітини утворювали конфлюентний клітинний газон, їх відокремлювали від основи за допомогою 0,05% трипсину/EDTA (Thermo Scientific, Dreieich, Німеччина).

2.2.2. Трансфекційні плазміди

Для трансфекції клітин Cos7 ми використовували наступні плазміди: pcDNA3, pcDNA3-Ahr-1-VP16,pcDNA3-AhA-1-VP16,pcDNA3-AhR -1(jul45)-VP16, p1A1-FL, Perl-TK. Плазміди описані Larigot et al. (подається разом з цим дослідженням). Плазміда p1A1-FL містить XRE-індуковану люциферазу, Perl-TK містить люциферазу реннілли, а pcDNA3-Ahr-1-VP16 і pcDNA3-AhA{{24 }}VP16 несуть послідовності для експресії C.elegans AHR-1 та AHA-1 відповідно. Для цього дослідження ми створили pcDNA3-AhR-1(LBD)-VP16 шляхом сайт-спрямованого мутагенезу плазміди pcDNA3-Ahr-1-VP16 за допомогою QuikChange II Site-Directed Набір для мутагенезу (Agilent, Санта-Клара, Каліфорнія, США). Наступну пару праймерів використовували для створення заміни L на A в L363 та H на Q в H365 AHR-1:LBD-F5'-GAGAGCATCGGCGCGACCCAACGGCTGCTGAACGAG 3'andLBD-R5'-CTCGTTCAGCAGCCGTTGGGTCGCGCCGATGCTCTC-3 '.Суперкомпетентні клітини XL1-Blue були трансформовані отриманою плазмідою для ампліфікації. Послідовність плазміди перевіряли секвенуванням Сенгера.

2.2.3.Транзиторна трансфекція клітин Cos7

За 24 години до трансфекції 20 000 клітин/лунку висівали в 48-лунковий планшет у 400 мкл DMEM (плюс 10 відсотків FBS плюс антибіотики) та інкубували при 37 градусах. Потім клітини трансфікували такими концентраціями плазміди з використанням ліпофектаміну 200 (Invitrogen, Юджин, Орегон, США): p1A1-FL (244 нг/лунка), Phil-TK (36нг/лунка), pcDNA3- AhA-1-VP16 (5 нг/лунка), або pcDNA3-VP16 (10 нг/лунка), pcDNA3-Ahr-1-VP16 (5 нг/лунка) або pcDNA 3-AhR-1(ju145)-VP16 (5 нг/лунку), як описано Larigot et al. (подається разом з цим дослідженням). Ліпофектамін 2000 використовували в концентрації 1 мкл/лунку та попередньо інкубували з відповідними плазмідами в DMEM протягом 20 хвилин перед використанням. Для тимчасової трансфекції клітини Cos7 інкубували із сумішшю ліпофектаміну/плазміди for3hin DMEM (плюс 10 відсотків FBS) без антибіотиків, щоб уникнути індукованої антибіотиками токсичності. Потім трансфекційне середовище видаляли та замінювали 400 мкл/лунку DMEM（ плюс 10 відсотків FBS плюс антибіотики）. Трансфіковані клітини інкубували при 37°С. На кожному планшеті 2 лунки клітин не трансфікували і, таким чином, використовували для нормалізації. 2.2.4. Лікування клітин Cos7

Для всіх сполук готували базові розчини з концентраціями, які в 1000-разів перевищували бажану концентрацію для обробки. Куркумін (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Німеччина), бензо(а)пірен (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Німеччина), лефлуномід (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Німеччина) і лютеїн (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Німеччина) були розчинені в ДМСО ( Carl Roth, Karlsruhe, Німеччина), тоді як ресвератрол (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Німеччина) і ротенон (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Німеччина) були розчинені в етанолі (Carl Roth, Karlsruhe, Німеччина). Через 24 години після трансфекції середовище для культивування клітин замінювали середовищем для культивування клітин, що містило розведення відповідної сполуки 1:100. Клітини обробляли протягом 24 годин перед оцінкою активності люциферази.

2.2.5. Аналіз люциферази (активність AhR)

Транскрипційну активність AhR оцінювали шляхом вимірювання активності XRE-керованої люциферази [64]. Для цього використовували репортерну систему аналізу подвійної люциферази (Promega, Wall Dorf, Німеччина). Після 24-годинної обробки клітини Cos7 двічі промивали PBS, а потім лізували протягом 15 хвилин при кімнатній температурі з використанням буфера для пасивного лізису, включеного в набір Dual-Luciferase Reporter Assay. Загалом 20 мкл лізованих клітин поміщали в білий 96-лунковий планшет і використовували для вимірювання люмінесценції. Субстрати люциферину (LARII) і ванілі (Stop&cGlo) готували згідно з описом виробника. Зразки завантажували на люмінометр (EG&G Berthold microplate Luminometer LB 96V Microluminomat plus (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Німеччина), а субстрати приєднували до системи трубок люмінометра. Спочатку до кожної лунки додавали 65 мкл LARII зразка та вимірювали люмінесценцію, створювану люциферазою світляка, потім додавали 65 мкл реагенту Stop&clo та вимірювали люмінесценцію, створювану люциферазою Renilla.Щоб оцінити активність AhR за вимірюваннями люмінесценції, ми виконали наступну постобробку кроки: спочатку люмінесценцію нетрансфікованих клітин віднімали від люмінесценції кожного зразка для корекції фону.На наступному кроці ми нормалізували люмінесценцію люциферази до люмінесценції реніли того самого зразка, щоб усунути відмінності у швидкості трансфекції та клітині. Інший етап нормалізації трансфікованих клітин pcDNA-VP16 був виконаний для кожної групи лікування для видалення AhR-indep. кінцевий вплив на XRE-керовану люциферазу.

Ця стаття взята з Antioxidants 2022, 11, 613. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants