Застосування аптамерів у нейронауці. Частина 2

Інший нейромедіатор, серотонін, відіграє важливу роль у нейромодуляції, що впливає на сон, агресію, апетит і сексуальну активність. Він виробляється в різних частинах тіла, таких як мозок, спинний мозок, тромбоцити та кишечник [81–84].

Серотонін є нейромедіатором, який відіграє важливу роль у фізичному та психічному здоров’ї людини. В організмі людини серотонін регулює настрій, контролює апетит і сон, а також сприяє відчуттю фізичного задоволення та благополуччя. Однак серотонін також відіграє важливу роль у впливі на пам'ять.

Дослідження показали, що серотонін може сприяти покращенню пам’яті, регулюючи передачу сигналів між нейронами. Коли люди отримують позитивну стимуляцію, організм вивільняє серотонін, який допомагає зміцнити зв’язки між нейронами та покращує ефективність пам’яті. Серотонін також може зробити людей більш креативними, покращити розумову спритність і допомогти людям швидше вчитися та мислити.

Крім того, серотонін може допомогти зменшити симптоми тривоги та депресії, проблеми з настроєм, які можуть негативно вплинути на концентрацію та пам’ять людей. Веселий настрій і психічний стан часто можуть сприяти розпізнаванню та здатності людей вивчати нове.

Підсумовуючи, серотонін відіграє незамінну роль у нашому фізичному та психічному здоров’ї, навчанні та пам’яті. Ми можемо збільшити вивільнення серотоніну та [поліпшити пам’ять], змінивши свої харчові звички, кількість фізичних вправ, методи навчання тощо, розвиваючи позитивний і здоровий менталітет і постійно кидаючи собі виклик постійно сприяти покращенню пам’яті. Можна побачити, що нам потрібно покращити пам’ять, і Cistanche deserticola може значно покращити пам’ять, оскільки Cistanche deserticola має антиоксидантну, протизапальну та антистарільну дію, що може допомогти зменшити окислення та запальні реакції в мозку, тим самим захищаючи здоров'я нервової системи. Крім того, Cistanche deserticola також може сприяти росту та відновленню нервових клітин, таким чином покращуючи зв’язок і роботу нейронних мереж. Ці ефекти можуть допомогти покращити пам’ять, навчання та швидкість мислення, а також можуть запобігти розвитку когнітивної дисфункції та нейродегенеративних захворювань.

Клацніть знати добавки для покращення пам’яті

Дисбаланс рівнів периферичного серотоніну пов’язаний з кількома захворюваннями, включаючи гіпертонію, захворювання нирок і депресію. Таким чином, використання серотоніну для прогнозування стану захворювання та для початку належного лікування має клінічне значення.

Було розроблено плазмонний аналіз серотоніну з кон’югатом аптамер–AuNP, для якого агрегація змінюється в присутності серотоніну. Зміну в агрегації частинок можна виміряти як зміщення пікової довжини хвилі поглинання.

Аналіз показав специфічну реакцію на серотонін і не дав статистично значущого сигналу з його метаболітами, 5-гідроксиіндолоцтовою кислотою (5-HIAA), адреналіном або норадреналіном, коли кожен тестувався в 1 мкМ.

Ембріональна сироватка великої рогатої худоби, як імітація людської сироватки, також не ініціювала сигнал [85]. Нещодавно були розроблені імплантовані нейрозонди аптамер–польовий транзистор (FET) для моніторингу рівня серотоніну в тканині мозку. Ультратонкі поверхні In2O3 нанорозмірних польових транзисторів були модифіковані за допомогою аптамерів, і ці нейрозонди дозволили встановити межі виявлення fM серотоніну in vivo з мінімальним біологічним забрудненням [86].

За допомогою додаткових нейрозондів стане можливим просторово-часовий запис нейронної активності, щоб функції мозку можна було зрозуміти на набагато глибшому рівні. Адреналін — це нейромедіатор катехоламінів із широким спектром фізіологічних функцій, для яких аномальні рівні можуть спричинити проблеми зі здоров’ям, такі як аритмія, інфаркт міокарда, кров підвищення тиску, набряк легенів.

Важливо кількісно визначити циркулюючий адреналін для спостереження за цими пов’язаними хворобливими станами. З цією метою розроблено колориметричний метод детекції, заснований на взаємодії адреналіну з функціоналізованим аптамером Au-NP. Система є менш дорогою та більш специфічною, ніж інші методи кількісного визначення адреналіну, такі як рідинна хроматографія та спектрофотометрія.

Крім того, за допомогою УФ-видимої спектроскопії було визначено межу виявлення 0,9 нМ, що є найнижчою межею виявлення, зареєстрованою для адреналіну за допомогою будь-якого колориметричного методу. Аналоги адреналіну, 3,4-дигідроксифенілоцтової кислоти (DOPAC), триптофану, аскорбінової кислоти, дофаміну, тирозину та гомованілової кислоти показали дуже незначну або не показали жодної відповіді, що свідчить про високу специфічність аптасенсора [87].

Зміна рівня одного нейромедіатора може вказувати на будь-яке з кількох захворювань, що робить дуже малоймовірним те, що діагноз захворювання можна буде поставити на основі вимірювання одного нейромедіатора. Тому здатність більшості аптасенсорів бути інтегрованими в мультиплексну платформу призведе до діагностичних інструментів, які краще підходять для клінік і з потенціалом для підтримки точнішої ідентифікації захворювань.

2.3. Виявлення біомаркерів
Біомаркер — це будь-яка речовина, структура або процес в організмі, який або призводить до результату, або вказує на наявність конкретного захворювання. Багато біомаркерів є речовинами, які можна виміряти в біологічних рідинах, таких як кров, слина та сеча.

Основною проблемою характеристики біомаркерів для неврологічних захворювань є гематоенцефалічний бар’єр (ГЕБ), через який не можуть пройти багато молекул, у тому числі багато білків. Хоча білки є домінуючими біомаркерами певних захворювань, малі пептиди, такі як нейропептид Y або фрагменти білків, з більшою ймовірністю проходять через ГЕБ і виявляються в кровообігу.

Метаболіти є ще однією важливою групою біомаркерів для неврологічних розладів. Компанія NeoVentures Biotechnology Inc. розробила підхід до вибору аптамерів під назвою FRELEX, який дозволяє відбирати аптамери на основі конкуренції між коротким олігонуклеотидом, прикріпленим до поверхні, та мішенню. Подібно до клітинного SELEX та інших форм SELEX із перемиканням структури, цей протокол можна виконати із зразком, що містить суміш компонентів, без попереднього знання мішені (мішеней), для якого будуть обрані аптамери.

За допомогою цих форм SELEX виконується лічильний відбір із конкретними підмножинами компонентів, щоб керувати відбором аптамерів, які відповідають бажаним особливостям. За допомогою FRELEX аптамери відбирали проти сироватки трансгенних мишей, у яких надмірно експресувався білок тау людини.

Щоб спрямувати селекцію аптамерів на людський тау та наслідки надмірної експресії тау, сироватку від мишей дикого типу використовували для контрвідбору. Група ідентифікувала збагачені послідовності аптамерів за допомогою NGS і охарактеризувала певні аптамери для трансгенних мишей на пізній стадії та мишей дикого типу шляхом порівняння їх відносної кількості.

Вони припустили, що різниця в кількості відображає відповідну концентрацію епітопів (підвищених у відповідь на надекспресію тау), з якими можуть взаємодіяти аптамери [29].

3. Діагностичне та терапевтичне застосування

Нейродегенеративні захворювання (НД) включають дегенерацію нейронів у мозку, що призводить до втрати структур і функцій центральної нервової системи. ND може бути спричинений старінням, генетичними факторами та факторами навколишнього середовища.

Деменція, як і хвороба Альцгеймера (AD), є одним із найпоширеніших вікових захворювань. Хвороба Паркінсона (ХП) може бути спричинена генетичними мутаціями та/або токсинами навколишнього середовища. Бічний аміотрофічний склероз (БАС), розсіяний склероз (РС), хвороба Хантінгтона (ХХ) і пріонні захворювання є іншими поширеними НД з генетичними зв’язками.

На жаль, немає ані ефективних ліків, ані стратегій раннього виявлення цих захворювань. Як і широко використовувані антитіла, аптамери стали привабливими агентами для розробки нових біосенсорів для ранньої діагностики НД і лікування цих захворювань [88].

3.1. Хвороба Альцгеймера

Як пов’язане з віком прогресуюче захворювання мозку, що призводить до розумової недостатності, AD є найпоширенішою формою деменції. Його патологія характеризується агрегацією амілоїду (А), що походить від білка-попередника амілоїду (АРР) і ініціюється в мозковій області гіпокампу.

Хоча вчені припустили, що нейротоксичність, спричинена А, корелює з нерозчинними А-бляшками (AP) і фібрилами (AF), нещодавно отримані дані вказують на те, що розчинні А-олігомери (AO) також пов’язані з початком AD.
Тому АО було визначено як привабливий біомаркер для ранньої діагностики AD, а A і тау вважаються важливими терапевтичними мішенями для лікування AD [89].

3.1.1. Діагностика AD

Раніше описані аптамери проти AO мали низьку спорідненість і специфічність, але пізніші дослідження були більш успішними в ідентифікації аптамерів, які вибірково розпізнавали фібрили 40-залишкової форми A (A 40), але не A 40 полімерів [90].

Проте аптамерам бракувало високої специфічності для фібрил A 40 порівняно з фібрилами кількох інших амілоїдогенних білків, які були протестовані. Було також показано, що аптамер ДНК, обраний для взаємодії з олігомером -синуклеїну (-syn) з 68-нМ афінністю, зв’язує АО з 25-нМ афінністю [91]. У 2019 році з використанням тих самих аптамерів, отриманих Цукакоші та ін., був розроблений електрохімічний аптасенсор без міток для більш специфічного розпізнавання АО [92].

Аптамер самостійно збирає золоті стрижневі електроди за допомогою тіолової (-S) взаємодії, і система має межу виявлення 30 ppm, визначену EIS. Це був перший аптасенсор, успішно використаний для моніторингу агрегації протеїну A на основі EIS, що стало можливим завдяки високій селективності аптамера серед видів A. Завдяки легкому виготовленню та ефективній регенерації цей аптасенсор може бути багатообіцяючим діагностичним інструментом для раннього виявлення AD і для демонстрації накопичення білка A [92].

Аптасенсор для виявлення А-олігомерів був розроблений з використанням аптамера -syn ДНК [91] у комплексі з метиленовим синім (MB) і прикріпленого до нанопористого анодікалюмінію. Високий коефіцієнт поглинання MB для білого світла призвів до низької інтенсивності відбитого білого світла.

У присутності олігомерів А комплекс аптамер/МВ дисоціював, і збільшення відбитого світла було виявлено за допомогою інтерферометричної спектроскопії відбиття (IRS) [93]. Аптасенсор мав межу виявлення 8 пМ і гарну реакцію на олігомери А в діапазоні концентрацій від 0.5 до 50 нМ. Нейрофібрилярні клубки (NFT) є патологічними ознаками AD.

Утворення NFT ініціюється в гіпокампі, і ступінь утворення NFT пов’язана з тяжкістю деменції при AD. Гіперфосфорилювання білка тау, асоційованого з мікротрубочками, сприяє його здатності рекрутувати та організовувати нормальний тау у філаменти, які стають NFT. Таким чином, гіперфосфорилювання тау вважається однією з основних причин AD.

На додаток до його нормальної ролі у сприянні зборці мікротрубочок і стабілізації зібраних мікротрубочок, за допомогою нерівноважного капілярного електрофорезу (CE) спостерігалося зв’язування тау з трьома випадково вибраними олігонуклеотидами оцДНК, один з яких, оцДНК1, зв’язувався з тау381 з високою афінністю (Kd {{ 3}} nM) [94].

Для виявлення фемтомолярних концентрацій протеїну тау в плазмі людини методом поверхневого плазмонного резонансу (SPR) був розроблений сендвіч-аналіз аптамер/антитіло з використанням ssDNA1 [95].

В іншому дослідженні ДНК-аптамери були відібрані проти цілого білка тау з 441 амінокислоти (tau441) за допомогою техніки швидкого відбору, заснованої на розподілі капілярного електрофорезу з трьома раундами відбору, завершеними протягом одного дня. П’ять аптамерів, вибраних із результатів високопродуктивного секвенування, були оцінені SPR на їх здатність розпізнавати тау.

Аналітичний потенціал аптамеру з вищою спорідненістю було продемонстровано за допомогою аналізу анізотропії однорідної фази флуоресценції. Цей високоафінний аптамер зв’язував білок tau441 і коротші ізоформи tau352, tau381 і tau383 з межами виявлення 28 нМ, 6,3 нМ, 3,2 нМ і 22 нМ відповідно в цьому аналізі [96].

3.1.2. AD Therapeutics

В якості одного з потенційних методів лікування були обрані аптамери РНК для інгібування агрегації A 40 . Під час відбору олігомер A був кон’югований з наночастинками золота (A-AuNPs), і два аптамери були ідентифіковані як кандидати в аптамери після SELEX.

Діти 10–20 nM. Ці аптамери інгібували утворення бляшок і фібрил А, як було виявлено за допомогою трансмісійної електронної мікроскопії та твердофазного імуноферментного аналізу А 40 (ELISA) [97].

Приманний пептид (DP) алкогольдегідрогенази (ABAD), який взаємодіє з A, антагонізує цитотоксичність A-пептиду. Послідовність ABAD-DP була вставлена ​​між двома тіолами, які утворюють дисульфідний зв’язок у тіоредоксині (TRX), щоб створити пептидний аптамер TRX1-ABAD-DP-TRX2. Його стабільну експресію в клітинах NIH 3T3 з використанням аденоасоційованих вірусів було перевірено за допомогою імунофлуоресцентного фарбування.

Експресований аптамер може зв'язувати пептид А і покращувати життєздатність клітин. Це дослідження підтвердило ефективне інгібування цитотоксичної дії пептиду А пептидними аптамерами [98]. Тау-білки зазвичай асоціюються з мікротрубочками та стабілізують їх, але їх гіперфосфорилювання може призвести до білкових агрегатів, які називаються «тауопатією», що є токсичним.

ДНК-аптамер Tau-1, який був відібраний проти людського tau441, інгібує олігомеризацію Tau1 in vitro [99]. Це інгібування також підтверджено в дослідженнях культур клітин з використанням клітин HEK293 [100]. Бета-секретаза (BACE1) відіграє певну роль у виробленні A, і інгібування експресії BACE1 є летальним для мишей. Лікування AD може включати модуляцію BACE1.

Однак його великий активний центр робить BACE1 складною мішенню для інгібіторів малих молекул. Щоб обійти це, аптамери нуклеїнових кислот можуть бути новими інструментами для інгібування активності BACE1. Цей фермент має цитоплазматичний хвіст, B1-CT, який служить місцем приєднання для білків, таких як мідний шаперон для супероксиддисмутази-1 (CCS) і білок, що зв’язує фактор рибозилювання ADP (GGA1).

Фізіологічна роль B1-CT здебільшого невідома. РНК-аптамер, спрямований на B1-CT, зв’язував проксимальну з мембраною половину С-кінця BACE1, перешкоджав рекрутуванню CCS, водночас дозволяючи GGA1 зв’язуватися з BACE1 і регулювати транспорт BACE1 до ендосом, що переробляються [101].

Для специфічного націлювання на BACE1 були створені ДНК-аптамери BI1 і BI2 проти BACE1, які інгібували BACE1, але не інгібували ні альфа-, ні гамма-секретазу. Використовуючи стабільно трансфіковану клітинну лінію HEK293, вони експресували попередник амілоїдного білка (АРР) і, використовуючи аналіз флуоресцентного резонансного переносу енергії (FRET) in vitro, вони показали, що рівень A був знижений, і клітинний дефіцит був урятований у первинно культивованій лінії нейрональних клітин. [102]. Ефективність аптамеру була додатково покращена додаванням холестерилтетраетиленгліколю (ТЕГ).

3.2. Хвороба Паркінсона

Хвороба Паркінсона (ХП) є другим за поширеністю нейродегенеративним захворюванням, яке вражає близько семи мільйонів людей у ​​всьому світі. Будучи прогресуючою хворобою, яка характеризується руховими та немоторними особливостями, вона має значний клінічний вплив на пацієнтів через втрату ними рухливості та контролю над м’язами.

Втрата дофамінергічних нейронів смугастого тіла та втрата нейронів у недофамінергічних областях характеризують PD. Втрата нейронів зазвичай пов'язана з характерним формуванням тілець Леві. Таким чином, наявність тілець Леві, що містять -син-олігомери, у мозку вважається можливою терапевтичною та діагностичною мішенню для БП.

3.2.1. Діагностика ПД

Перший аптамер, "M5-15", обраний проти -syn, не мав специфічності для олігомерів і міг також зв'язуватися з -syn мономерами [103]. Було показано, що потім відібрані аптамери ДНК взаємодіють з -syn-олігомерами, а не з -syn-мономерами, але зв'язували олігомери A 1–40.

Дослідники також досліджували специфічність аптамера для -син-олігомерів порівняно з іншими білками зі структурами, які переважно є -листовими, такими як -листова пропелерна структура піролохінолін-хінін-глюкозодегідрогенази (PQQH), і продемонстрували, що аптамер не зв'язував PQQH [91]. Повідомляється, що аптасенсори здатні кількісно визначати -синолігомери.

Колориметричний аптасенсор, який використовує аптамер ДНК проти -синолігомеру, був адсорбований на наночастинках золота (AuNP), що запобігало спричиненій сіллю агрегації наночастинок. Його зв'язування з -син-олігомером запобігає поглинанню аптамеру на поверхні AuNP, що дозволяє ініціювати агрегацію AuNP у високих концентраціях солі та призводить до зміни кольору.

Повідомлялося, що ця система має LoD 10 нМ. Однак сироватка (навіть у 2%) сприяла поглинанню сполук у діапазоні зміни кольору в аналізі та перешкоджала залежній від солі агрегації аптамер-Au-NP.

Аптасенсори з використанням EIS і SPR були більш чутливими, з LoD 1 пМ і 8 пМ відповідно [104]. Виявилося, що аптасенсор EIS високоспецифічний для олігомерів над мономерами і не впливає на присутність сироватки [104]. Розроблена конструкція електрохімічного аптасенсора для виявлення -syn-олігомеру включала гібрид, утворений комплементарною послідовністю до -syn-олігомерного аптамеру, зв'язаного з поверхнею золота через тіоловий зв'язок, і включала кінцеву дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT) і dTTP для розширення 30-кінців аптамеру та його доповнити додатковим поліпом.

Подовжена оцДНК зв’язувала метиленовий синій і сприяла його асоціації з золотою поверхнею, створюючи таким чином електрохімічний сигнал. Крім того, система містила екзонуклеазу I (Exo I), яка є специфічною для оцДНК. Коли аптамер було видалено з бінарного комплексу з його комплементом шляхом його зв’язування з -син-олігомером, комплементарні нитки були розщеплені Exo I, запобігаючи накопиченню метиленового синього на поверхні золота і, таким чином, зменшуючи електрохімічний сигнал.

Межа виявлення становила 10 PM (S/N=3), а відновлення сигналу в присутності 10% і нижчих концентрацій сироватки було дуже прийнятним 95,3–107% [105]. Однак її складність і включення ферментів роблять цю систему менш стабільною для зберігання та відтворюваною в польових умовах. Комбінація капілярного електрофорезу-мас-спектрометрії (CE-MS) із твердофазною екстракцією (SPE) для попереднього концентрування мішені з мікрокартриджем, модифікованим аптамером, у великому об’ємі введених зразків зменшив межу виявлення 100-в рази порівняно з системами CE-MS.

У цій новітній системі зразок очищається, а об’єм мінімізується для покращеного аналізу завдяки використанню мікрокартриджа, який вибірково утримує мішень. Виявлено, що аптамерний афінний (AA) сорбент у картриджі є кращою альтернативою антитілам імуноафінний (IA) сорбент як фонові електроліти, необхідні для промивання системи, також денатурують антитіла.

Розробка AA-SPE-CE-MS була досягнута шляхом модифікації мікрокартриджа з M5-15 ДНК-аптамером. Система продемонструвала LoD 2,8 нМ і лінійний діапазон виявлення від 7 до 140 нМ -syn у зразку крові.

Крім того, ідентифікація вільних і N-ацетильованих -syn протеоформ стала можливою в результаті високоточної масової детекції та роздільної здатності МС. Нарешті, мікрокартридж був визнаний стабільним навіть з кислим BGE, і його можна було використовувати приблизно для 20 аналізів з низьким шансом помилкової кількісної оцінки мішені [106].

For more information:1950477648nn@gmail.com