Очевидна відсутність перехресних розмов скелетних м’язів і нирок1- у мишей

ТРАВ'ЯНИЙ РОЗПІС ДЛЯ ХРОНІЧНА ХВОРОБА НИРОК

Ключові слова: гени циркадного годинника; функції нирок; інтегративна фізіологія

1. Вступ

Циркадні ритми відіграють важливу роль у більшості фізіологічних процесів. Контроль цих ритмів частково опосередковується центральним годинником, який знаходиться в супрахіазматичному ядрі мозку, але периферійні циркадні годинники також впливають на ритми фізіологічної функції [1]. Молекулярний годинник складається з петлі зворотного зв’язку транскрипції та трансляції. Коротше кажучи, основні білки арил-гідрокарбон-рецептор-ядерний транслокатор-подібний білок (ARNTL; або BMAL1) і циркадні локомоторні вихідні цикли kaput (CLOCK) позитивно регулюють транскрипцію генів Period і Cryptochrome; Період (PER) і криптохром (CRY) білки зворотний зв’язок і пригнічують активність BMAL1/CLOCK (переглянуто в [2,3]). Порушення циркадних процесів пов’язане з багатьма патологіями, зокрема серцево-судинними та нирковими [4,5]. На сьогоднішній день перехресний зв’язок між різними системами органів після цілеспрямованого циркадного порушення вивчений недостатньо. Це дослідження зосереджено на видаленні основного білка годинника BMAL1 у скелетних м’язах і потенційних наслідках цього порушення годинника для нирок.

Раніше було описано, що мишача модель BMAL1-inducible-knockout (iMS-BMAL1 KO), специфічна для скелетних м’язів, має характеристики, подібні до тих, що спостерігаються при старінні. Ці миші виявляють змінену ходу, знижену рухливість, м’язову слабкість і порушення засвоєння глюкози [6,7]. Захворювання нирок є синонімом старіння, оскільки поширеність захворювань нирок зростає разом із віком [8]. Ще одна характеристика, про яку повідомляють у мишей iMS-BMAL1 KO, полягає в тому, що вони демонструють підвищену кальцифікацію сухожиль [6]. Роль нирок у кислотно-лужному балансі та мінеральному гомеостазі безпосередньо пов’язує здоров’я кісток із захворюваннями нирок. Отже, ми припустили, що миші iMS-BMAL1 KO потенційно можуть бути моделлю захворювання нирок.

Мета цього дослідження полягала в тому, щоб визначити, чи призводить порушення годинника в скелетних м’язах до дисфункції нирок. Делеція BMAL1 у скелетних м’язах викликає збільшення запальних маркерів у нирках. Однак iMS-BMAL1 KO не впливає ні на функцію нирок, ні на гістологію нирок. Ці дані свідчать про те, що наслідок порушення роботи годинника в скелетних м’язах призводить до мінімальних змін у нирках за перевірених умов.

2. Матеріали та методи

Тварини. Модель миші, використана в цьому дослідженні, була створена з використанням мишей BMAL1 з екзоном 8 з флоксом [9], схрещених із специфічними для скелетних м’язів Cre-рекомбіназними мишами (скелетний актин-Cre людини). Cre активували ін’єкціями тамоксифену (приготованого в 15% етанолі в соняшниковій олії) за 5 тижнів до дослідження (2 мг/день; 5 днів внутрішньовенно) для створення iMS BMAL1 KO. В якості контролю використовували мишей Cre+, яким вводили носій (15% етанол у соняшниковій олії). Самців незайманих молодих мишей досліджували на 17-19 тижні, а старих мишей досліджували на 13-14 місяцях. Усі експерименти були проведені керівництвом Національного інституту охорони здоров’я з догляду та використання лабораторних тварин і схвалені та контрольовані Комітетом з догляду та використання тварин Університету Флориди та Комітетом з догляду та використання тварин Адміністрації ветеранів Північної Флориди/Південної Джорджії. Мишей містили в приміщеннях з контрольованою температурою (20–26 ◦C) і вологістю, 12:12 годин світло-темрява. Мишам надавали довільний доступ до води та стандартної їжі для гризунів з вмістом білка 18% (№ 2918, Harlan Teklad/Envigo, Медісон, Вісконсин, США), якщо не зазначено інше.

Дослідження метаболічної клітини. Когорта молодих самців мишей (5 контрольних і 5 KS-BMAL1 KO) містилася в метаболічних клітках для збору сечі та моніторингу споживання їжі/води [10]. Гелеву дієту на основі порошку (Envigo Teklad Custom Diet), що містить 1% агару, готували та використовували в колекціях метаболічних клітин. Мишам дали 3 дні для адаптації до метаболічних клітин перед початком збирання на контрольній дієті ({{10}}.25% NaCl; 0.6% K; Envigo 99131). Після одного дня запису з контрольною дієтою мишей потім лікували дієтою з дефіцитом калію (0.25% NaCl; 0,0001% K; Envigo 99134) протягом п’яти днів. Зразки сечі збирали кожні 12 годин наприкінці світлового та нічного періодів (час Zeitgeber 0 та 12). Реєстрували виділення сечі, споживання їжі та споживання води. Концентрацію електролітів у сечі вимірювали полум’яним фотометром (модель Cole-Parmer 2655- 00, Vernon Hills, IL, США) відповідно до інструкцій виробника. Мишей піддавали евтаназії, а тканину збирали за 6 часов Zeitgeber.

Склад тіла. Склад тіла кількісно визначали у свідомих молодих самців мишей до та через п’ять днів після введення дієти, збідненої калієм. Вимірювання проводили за час Zeitgeber 4–6 за допомогою EchoMRI Quantitative Magnetic Resonance Body Composition Analyzer (Echo Medical Systems, Houston, TX, USA) [11].

Протокол випередження фази. Окрему когорту старих мишей-самців поміщали окремо в клітки, обладнані біговим колесом з довільним доступом до їжі (№ 2918, Harlan Teklad) і води. Клітки зберігали в коробці з контрольованим освітленням з постійним повітрообміном (Actimetrics, Wilmette, IL, USA). Графік освітлення підтримувався за циклом світло-темрява 12:12 з використанням зеленого світлодіода (~200 люкс) джерела світла. Після одного тижня початкового рівня темрявий цикл просунувся на 7 годин, і мишей підтримували за новим графіком циклу світло-темрява 12:12 годин протягом одного тижня. Цей процес було повторено вдруге, щоб отримати 14-h фазу вперед. Мишей евтаназували за час Цейтбегера 2 у групах по 2–3 особи, а тканину збирали через 7–10 днів після другого тижня фази.

Специфічність рекомбінації. Щоб підтвердити специфічність рекомбінації Bmal1, ми завершили ПЛР з використанням 40 нг геномної ДНК скелетних м’язів і праймерів для рекомбінованих і нерекомбінованих алелів. (попередній праймер: ACTGGAAGTAACTTTATCAAACTG, rev праймер: CTGACCAACTTGCTAACAATTA, рекомбінаційний праймер: CTCCTAACTTG GTTTTTGTCTGT). Прямий і зворотний праймери для floxed алеля Bmal1 дають продукт 431-bp. Другий прямий праймер 50 -CTCCTAACTTGGTTTTTGTCTGT-30 був включений для виявлення рекомбінованого продукту, який показує смугу на 572 bp. Продукти реакції ПЛР перевіряли на 1,7% агарозному гелі, і ідентифікація геномної смуги та смуги, специфічної для рекомбінації, підтвердила, що всі тварини, які отримували тамоксифен, були тканиноспецифічними KO, як описано раніше [7,12].

Імуногістохімія. Після анестезії інгаляційним ізофлураном праві нирки збирали та негайно розрізали навпіл, а потім зберігали в періодат-лізин-2% параформальдегіді протягом приблизно 48 годин при 4 ◦C. Потім рідина була замінена на PBS для підготовки до обробки. Зразки нирок кожної тварини занурювали в парафін, а зрізи товщиною 4-мікрометра вирізали та встановлювали на предметне скло. Зрізи або пофарбували гематоксиліном та еозином, або пофарбували 3,30 -діамінобензидиновим хромогенним субстратом (Вектор) для націлювання на BMAL1 (D2L7G Cell Signaling; 1:3000; RRID: AB_2728705, Денверс, Массачусетс, США). Зрізи спостерігали за допомогою світлової мікроскопії (Nikon E600, обладнаний цифровою камерою Nikon DXM1200F, Мелвілл, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США). Ідентифікатори групвидаляли з кожного предметного скла, і досліджували експресію BMAL1 або предметні скла оцінювали на пошкодження канальців за такими критеріями: відсоток канальців, які мали ознаки некрозу канальців, відсутність щіткової облямівки, розширення канальців і утворення білкового зліпка.

інкубували з вторинним антитілами проти кролика, кон’югованими пероксидазою хрону. Після додаткового промивання TBS-T протягом 30 хвилин виявлення проводили за допомогою реагенту SignalFire ECL (технологія сигналізації клітин) із часом експозиції 30 с для візуалізації. Денситометрію проводили за допомогою Фіджі, а вміст білка нормалізували відповідно до фарбування за Понсо.

Мультиплексні імунологічні аналізи. Кортикальні та медулярні області були вирізані з половини нирки у старих самців мишей. Тканину гомогенізували в 300 мкл (кора головного мозку) або 250 мкл (мозкова речовина) буфера (1% суміші інгібіторів протеази та фосфатази (Thermo Scientific) 1% 1 М етилендіамінтетраоцтової кислоти, 0,1% Твіну 20 у фосфатно- буферний фізіологічний розчин). Концентрацію білка для кожного зразка визначали BCA (Pierce, Thermo Scientific). Гомогенати вимірювали у двох примірниках для вибраних аналітів за допомогою комерційних мультиплексних наборів для імунологічного аналізу (MCYTOMAG-70K, MBNMAG-41K та MKI1MAG-94K; EMD MilliporeSigma) на MILLIPLEX® Система Analyzer 3.1 xPONENT (Luminex 200, Остін, Техас, США) з аналізом даних за допомогою програмного забезпечення MILLIPLEX Analyst. Середні внутрішньопробні CV становили<5% and the average inter-assay CVs were <15%. The data were converted from pg/mL to pg/mg, using the previously determined protein concentrations. 

Виділення ниркових мітохондрій і респірометрія. Свіжу кортикальну тканину нирок вирізали у мишей після переходу фази. Мітохондрії виділяли за допомогою набору Mitochondria Isolation Kit for Tissue (#ab110169; Abcam, Waltham, MA, USA) відповідно до інструкцій виробника. Концентрацію білка в мітохондріальному препараті визначали за допомогою набору BCA Protein Assay Kit (Pierce, Thermo Scientific). Мітохондріальне дихання ізоляту визначали у двох примірниках у попередньо відкаліброваній ксилографічній камері, підтримуваній при 37 ◦C (Oroboros O2K; Oroboros Instruments, Інсбрук, Австрія), що містить дихальний буфер (MiR05; 0).5 mM EGTA, 3 mM MgCl2·6H2O, 60 mM лактобіонової кислоти, 20 mM таурину, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM D-сахарози та 1 г/л БСА практично без жирових кислот, pH 7,1) [13]. Концентрацію кисню в дихальному буфері підтримували між насиченням повітря (~200 мкМ) і 50 мкМ. Швидкість споживання кисню (OCR; ρмоль O2/с/мг мітохондріального білка) вимірювали за допомогою наступного протоколу субстрат-роз’єднувач-інгібітор-титрування (SUIT) (концентрації реагентів, зазначені в дужках, є остаточними всередині камер): (1) ВИТІК (L) ) дихання оцінювали після стимуляції циклу TCA NADH-пов’язаними субстратами піруватом (5 мМ), малатом (2 мМ) і глутаматом (10 мМ) для підтримки потоку електронів через комплекс I (CI) системи транспорту електронів (ETS; E). ); (2) окисне фосфорилювання (OXPHOS; P) стимулювали аденозиндифосфатом (ADP; 2,5 мМ) і записували як PCI; (3) додавання сукцинату (10 мМ) підтримувало конвергентний потік електронів через комплекси I і II ETS (PCI+II); (4) якість мітохондріального препарату оцінювали шляхом перевірки цілісності зовнішньої мембрани мітохондрій шляхом додавання цитохрому с (10 мкМ); (5) роз’єднувальний карбонілціанід 4-(трифторметокси) фенілгідразон (FCCP; 0,5 мкл-кроки 0,1 мМ основного розчину) титрували поетапно, доки не було досягнуто максимального незв’язаного дихання та зареєстровано як максимальну ємність ETS (ECI+ II); (6) додавання ротенону (0,5 мкМ) інгібувало комплекс I ETS, а решта OCR була записана як максимальна ємність ETS, підтримувана субстратом комплексу II (ECII); (7) додавання антиміцину А (2,5 мкМ) пригнічувало комплекс III ETS і, таким чином, увесь транспорт електронів до комплексу IV, а залишок OCR реєструвався як залишкове немітохондріальне споживання кисню (ROX) і віднімався від усіх попередніх OCR. ; (8) споживання кисню потім знову стимулювали додаванням дигідрохлориду N,N,NO,N0 -тетраметил-п-фенілендіаміну (TMPD; 0,5 мМ; у присутності аскорбату (2 мМ), щоб уникнути неконтрольованого автоокислення TMPD) як штучний субстрат для відновлення цитохрому с; (9) Швидкість окислення хімічного фону в присутності TMPD/аскорбату оцінювали шляхом додавання інгібітора комплексу IV азиду натрію (100 мМ) і віднімали його від попереднього потоку, що дало максимальну потужність цитохром-с-оксидазної активності (ECIV). Дані про споживання кисню були отримані та проаналізовані за допомогою DatLab проти 7.4 (Oroboros Instruments). Коефіцієнти контролю потоку (FCR) розраховувалися як споживання кисню при будь-якому заданому стані дихання відносно максимальної ємності ETS (ECI+II).

Проточна цитометрія. Легеневу тканину перетравлювали, і проводили проточний цитометричний аналіз, як описано раніше [14].

Статистичний аналіз. Графічні дані представлені як середнє ± SEM. Для аналізу відмінностей між чотирма групами використовувався двосторонній дисперсійний аналіз із повторними вимірюваннями, коли це було можливо. Тест множинних порівнянь Sidak використовувався для порівняння груп мишей з групами лікування. Для порівняння двох груп використовувався t-критерій Стьюдента. Аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism версії 9.2 (GraphPad Software Inc., Сан-Дієго, Каліфорнія, США).

Статистична значущість була визначена як p < 0,05.

Служба підтримки Wecistanche:

Електронна адреса:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Тел.:+86 15292862950