Антиоксидантний потенціал пептидного складу (Gal2–Pep), кон’югованого з галовою кислотою, для запобігання старінню

Шкіра дуже вразлива до передчасного старіннячерез зовнішній стрес, тому в цьому дослідженні пептидний склад (галоїл)2–KTPPTTP (гал2–Pep) був синтезований шляхом поєднання пептиду TPPTTP і галліюкислота (GA). Усі пептиди були синтезовані на 2-хлортритилхлоридній смолі з використанням твердофазного пептидусинтезу (SPPS), і проаналізовано за допомогою електророзпилювальної іонізації (ESI)/квадрупольного часуflflпряма (Q-TOF) тандемна система мас-спектроскопії (MS). Спочатку Гал2–Пеп не виявляв токсичності нижче концентрації 100mM з виживаністю клітин 88 відсотків для кератиноцитів іфібробласти. Theактивні форми кисню(ROS) активність гал2–Pep був більш стабільним порівняно з одним GA; і після чотирьох тижнів у кімнатітемпература, їїАктивність поглинання АФКзалишався вищим за 50 відсотків. Крім того, пептидний склад,гал2–Pep також продемонстрував інгібуючий ефект еластази в CCD-1064Skфібробластклітини. На основі результатів RT-qPCR в цьому дослідженні було доведено, що Gal2–Пеп посилив експресію PGC-1a дозапобігтиокислювальний стрес, і підтвердив його потенціал якзасіб проти старіннязапідвищення експресіїколаген I типуі зазниження експресії матриксної металопротеїнази-1 (MMP1). Theвисновки отримані підкріплюють припущення, що пептидний склад, синтезований у цьому дослідженні, може бути використаний як aприродний антиоксидантізасіб проти старіннядля його косметичного застосування.

Натисніть тут, щоб отримати більше інформації про продукти проти старіння Cistanche

1. Введення

Старіння шкіривиникає в результаті поступового зменшення і остаточної зупинки поділу клітин кератиноцитів і бромів.вибухи всередині шкіри. Зморшки на шкірі розвиваються, коли кількість клітин зменшується, в результаті чого відбувається денатурація позаклітинного матриксу, що призводить до сухості та втрати пружності.попрілості на шкірі.1 Пошкодження внутрішньоклітинної мітохондріальної ДНКа також відбувається зниження швидкості синтезу білкав процесі старіння шкіри.2 Старіння шкіри має два основних шляхивнутрішніми та зовнішніми шляхами, з ультрафіолетовим (УФ) опроміненням

основний драйверзовнішнє старіння. УФ-проміння реагує на основні компоненти шкіри, включаючи ліпіди, білки та нуклеїнові кислоти, для виробництва активних форм кисню (АФК), які призводять до клітинисмерть.3–5 Надмірні рівні ROS також призводять до розщеплення іаномальне зв’язування ланцюгів колагену або еластину та сприяють експресії матриксних металопротеїназ (ММР), таких як ММП-1, які розщеплюють колаген, що призводить до зморшок шкіри таприскорення старіння шкіри.6,7 Тому необхідна антиоксидантна терапія для видаленняАФК і активація мітохондріального потенціалу мають переваги для захисту шкіри від старіння.

Крім АФК, еластаза відіграє значну роль у втратіеластичність шкіри, яка розщеплює еластин, важливий білокпозаклітинний матрикс.8 Еластин, завдяки значній пружній віддачівластивості, забезпечують еластичність шкіри, тоді як еластаза маєздатність розщеплювати еластин та інші білки.8 Тому інгібіВироблення ферменту еластази може бути ключовою стратегією проти в’ялості шкіри запобігання втрати еластичності шкіри.

У цьому дослідженні ми розробили новий матеріал, який поєднує в собігамма-коактиватор рецептора, активованого проліфератором пероксисом1-альфа (PGC-1a)-похідний пептид TPPTTP і галова кислота (GA)для використання в косметиці проти старіння. ГК – це фітохімічна речовина, що міститься в різних фруктах і овочах, включаючи виноград, помідори та зелений чай, яка, як відомо, має високі антиоксидантні та антибактеріальні властивості. effects.9 Хоча GA використовується в косметичній та харчовій промисловості через ці корисні effects, його формулювання має тенденцію бути нестабільним.10 Таким чином ми розробили (галоїл)2–KTPPTTP (гал2–Pep), щоб підвищити стабільність GA шляхом зв’язування його з PGC-1a-похідний пептид TTPTTP.

У цьому дослідженні ми синтезували (галоїл)2–KTPPTTP (гал2– Pep) пептидний склад у кон’югації з галовою кислотою та підтвердженойого потенціал як антиоксиданту та засобу проти старіння.

2. Матеріали та методи

2.1. Матеріали

Модифікований ДульбеккоСередовище Ігла (DMEM), пеніцилін/стрептоміцин, фетальна бичача сироватка (FBS), фосфат-буffередфізіологічний розчин (PBS) і трипсин були придбані у Gibco (Carl

погано, Каліфорнія). Гідроксибензотриазол (HOBt), диізопропілкарбодиімід (DIC), 1,8-діазабіцикло[5.40]ундец-7-ен (DBU),N, N-діізопропілетиламін (DIEA), галова кислота таN-сукциніл-три-аланіл-pнітроанілід були отримані від Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).L-Утворює амінокислоти (Fmoc-Lys (Boc)–OH, Fmoc-Thr (tБу)–OH і Fmoc-Pro–OH) були придбані у Bead-Tech (Сеул,Корея).

2.2. Синтез пептидів і пептидів, зв'язаних з галовою кислотою

Усі пептиди були синтезовані на 2-хлортритилхлоридній смолі (200mмольна шкала, величина заміщення¼ 1,46 ммоль г 1) за допомогою HOBt–ДВЗ-опосередкований твердофазний пептидний синтез (SPPS).

Синтез пептидів методом SPPS проводили з незначними модифікаціямикатіони з посиланням на попередні дослідження.11–13 2-смола хлортритилхлориду (CTC) набухала в дихлорі

метану (DCM, 8 мл) протягом 30 хв. Смолу промивали сдиметилформамід (DMF). Усі реакції проводили при кімнатній температурі. Fmoc захищені похідні амінокислот (2 екв(Екв.), дляфіпершу приєднану амінокислоту або 5 еквів., для інших амінокислот) з’єднували або з DIEA (5 екв., для приєднаної амінокислоти), або з HOBt/DIC (6 екв./5 екв.) у DMF aфутіверпроведення зняття захисту з Fmoc за допомогою 2 відсотків (об./об.) DBU в ДМФ (2 рази, 2 хв., 8 мл). І всі ступені були промиті 5 разів DMF. Кінцеву галову кислоту з'єднували з пептидами, приєднаними до лізину.Після сполучення галової кислоти смола булаaфільтрований, промитий,і сушать під високим вакуумом. Розчин для розщеплення (TFA:деіонізована [DI] вода: TIS¼ 95 : 2,5 : 2,5, об./об./об. відсотки) обробляли протягом 2 год.для отримання неочищених пептидів. Неочищені пептиди осаджували і тричі промивали холодним діетиловим ефіром.

Аналітична обернено-фазова високоефективна рідинна хроматографія(RP-HPLC) проводили на Waters 2695 SeparationsМодуль з колонкою Capcell Pak C18 (4,6 мм 250 мм, 5mм, Shiseido). Рухома фаза складалася з 0,05% TFA у H2O (рухома фаза A) і 0.05% TFA в ацетонітрилі (рухома фаза B).

Елюювання було досягнуто шляхом використання лінійного градієнта для мобільногофаза B від 5 до 65 відсотків протягом 30 хвилин при aшвидкість потоку 1.0 мл хв 1. Піки пептидів були виявлені при довжині хвилі 230 нм. Напівпрепаративну ОФ-ВЕРХ проводили на системі Waters HPLC (насос 600E, детектор УФ-484) з Gemini RP-C18колонка (21,2 мм 250 мм, 5mм, Phenomenex). Рухома фаза складалася з 0,05% TFA у H2O (рухома фаза A)і 0.05 відсотків TFA в ацетонітрилі (рухома фаза B). Елюювання було досягнуто шляхом використання лінійного градієнта для рухомої фази B7 відсотків до 22 відсотків протягом 15 хвилин на alшвидкість потоку 10 мл хв 1. Theпептидні піки виявляли спектрофотометрично при довжині хвилі 230 нм.

Синтезовані пептиди розчиняли у 5% мурашиної кислоти у воді та аналізували за допомогою електророзпилювальної іонізації (ESI)/квадрупольний час-lпряма (Q-TOF) тандемна мас-спектроскопія(MS) (TripleTOF6600, ABSciex, Фостер Сіті, Каліфорнія). Зразки вводили в оснащену систему Q-TOFджерело нано-розпилення на alставка 1mL хв 1. Іон ESIПараметри джерела були наступними: напруга іонного розпилення 1,5 кВ, завісний газ при 10 фунтів на квадратний дюйм і оболонковий газ при 5 фунтів на квадратний дюйм. Спектри врежим повного сканування та MS/MS були зібрані в діапазоніm/z

100–1200 Да при часі накопичення 25 мс на спектр.Енергію зіткнення було збільшено від 10 до 80. Результатдані були отримані за допомогою Analyst TF такпосуд і автоматичнопризначається центроїдом 80 відсотків із мінімальним піком, зменшенням шуму на 10 відсотків, середнім деізотопуванням із 3-відсотковим порогом, без зменшення шуму та без згладжування. Синтезовані пептиди ідентифікованоз масовим допуском 0.05 Da та секвеновано вручну за допомогою MS/MS толерантності 0.01 Da.

2.3. Культури клітин і аналізи на життєздатність

Клітини дорослої людини з низьким вмістом кальцію та високою температурою (HaCaT).і CCD-1064Sk (нормальна шкіра людиниклітини фібробластів буликультивують у DMEM з 10% FBS та 1% пеніциліну/стрептоміцин. Клітини інкубували при 37 C в камері зволоженого повітря з 5% CO2.Для аналізів життєздатності використовувався набір для підрахунку клітин-8 (CCK-8, Dojindo Co. Ltd. Пекін, Китай). Клітини HaCaT і CCD-1064Skвисівали в 96-лункові мікропланшети (5 103 клітин на лунку) та інкубували при 37 C у 5% CO2 протягом 24 год. Потім культури піддавали впливу різних концентрацій синтезованих пептидів або ГА та інкубували при 37 C у 5% CO2 протягом 24 год. Життєздатність клітинзгодом було виміряно за допомогою CCK-8 відповідно до вказівок виробника.

2.4. Визначення антиоксидантної активності

2.4.1. DPPH аналіз.Антиоксидантна активність синтезпептидів і GA оцінювали окремо за допомогою аналізу DPPH. Аналіз DPPH проводили згідно з раніше повідомленим

методологія з незначними модифікаціямикатіон.12,14–16 По-перше, 0.12 мг мл 1 Розчин DPPH готували в метанолі, потім 100mл розчину ДПХГ і 100mЛ синтезованих пептидів або ГА змішували в різних концентраціях ({{0}}.1 мМ, 0.05 мМ, 0,01 мМ та 1mM) у 96-лункових мікропланшетах. В орбітальному струшуючому інкубаторісуміші реагували протягом 30 хв при 37 C і 100 об/хв безсвітло. Потім виміряли поглинання при 517 нм і розрахували антиоксидантну здатність.

2.4.2. Активність поглинання АФК.

Внутрішньоклітинну активність поглинання АФК оцінювали за допомогою набору з 20,70-діхлорофлуоресцеїну діацетату(DCF-DA, Abcam, США). Клітини HaCaT висівали в 96-лункові мікропланшети (5 103 клітин на лунку) та інкубували при 37 C протягом 24 год.Aфутівпісля інкубації культури піддавали впливу синтезованих пептидів або ГА (100mM) та інкубували при 37 C протягом 24 год. Потім клітини піддавали впливу 10mM розчину DCF-DA та інкубували протягом 30 хв. АфутівПісля інкубації розчин промивали PBS. Theклітини аналізували за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів при збудженні та

довжини хвилі випромінювання 485 нм і 530 нм відповідно.

Рис. 1Стадія синтезу та підтвердження послідовності пептидів за допомогою квадрупольного часуполіт(Q-TOF) мас-спектрометрія: (a) детальна процедура синтезу (b) TPPTTP, (c) галоїл–TPPTTP і (d) (галоїл)2–КТППТТП.

2.5. Аналіз потенціалу мітохондріальної мембрани

Для мітохондріального використовувався барвник JC-1 (Thermo Fisher, США).аналіз мембранного потенціалу (MmP). Клітини CCD-1064Sk і HaCaT висівали в 96-лункові мікропланшети (5 10 3клітин на лунку)

та інкубували при 37 C і в 5% CO2 протягом 24 год. Кормоваінкубація,культури піддавали впливу різних концентрацій синтезованих пептидів та інкубували при 37 C у 5% CO2 протягом 24 год.До клітин CCD-1064Sk і HaCaT додали барвник JC-1, щобвиробляти a кінцева концентрація 10mM. AфутівЧерез 10 хвилин інкубації клітини двічі промивали 37 C PBS. Зелений і червонийфлуоресценціябули виміряні за допомогою Varioskan LUXMultimode Microplate Reader (ThermoFisher, США) на ексtation (lПр)/емісія (lЕм) 475/530 нм і alПр/lЕмз 475/590 нм відповідно.

2.6. Аналіз інгібіторної активності еластази

Клітини CCD-1064Sk висівали в 6-лункові планшети та інкубували при 37 C у 5% CO2 протягом 24 год. Потім культури піддавали впливу концентрації 100mM синтезованих пептидів або GA та інкубували при 37 C у 5% CO2 протягом 24 год. Клітини двічі промивали dPBS, і ми збирали кожну клітину за допомогою клітинного скребка. Аer додавання 0.2 M Tris–HCl (pH 8.0) з 0.1 відсотка Triton-X до зібраногоклітини, клітини гомогенізували ультразвуковим апаратом. Гомогенізований розчин центрифугували 20 хв при 3000 об/хві 4 C. Тоді, aфутівer беручи надосадову рідину, кількість білка-катіон проводили за допомогою аналізу білка BCA. Білок для кожногозразок був виданий нафікінцева концентрація 100mгмл 1, іN-сукциніл-три-аланіл-p-нітроанілід був доданий вкінцева концентрація 1,6 мМ і прореагувала при 36 С протягом 1 год.Потім виміряли абсорбцію при 405 нм за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів.

2.7. RT-qPCR

Рівні мРНК маркерів антистаріння в клітинах CCK-1064Skбули оцінені за допомогою RT-qPCR. Загальну РНК збирали за допомогою реагенту TRIzol (Life Technologies, Карлсбад, Каліфорнія) і зворотного

транскрибовано за допомогою набору реагентів PrimeScript RT (Takara BioInc., Кусацу, Японія). Система CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) та iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Labora

торії) використовували для RT-qPCR.b-Актин використовувався для нормалізації рівнів мРНК колагену типу I, MMP-1 і PGC-1a. 

2.8. Статистичний аналіз

 Дані представлені як середнє стандартне відхилення відтри незалежні вимірювання та аналіз за допомогою методу Стьюдентаt-тести, з аp < 0.05 considered to be a signiніяка різниця.

Запитуйте ще:

Електронна пошта:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: плюс 86 15292862950