Протизапальні принципи з хвої Pinus Taiwanensis Hayata та In Silico Дослідження їх потенційного ефекту проти старіння

Анотація:Соснахвойний чай дуже популярний у східних країнах, таких як Японія, Росія, Корея та Китай. Вважається, що чай із соснових голок має значнуантивіковий ефект,але досі немає чітких доказів, які підтверджують це. У цьому дослідженні п'ятнадцять неописаних сполук (1–5), а також сімдесят дві відомі сполуки були очищені та охарактеризовані з біоактивної фракції метанольних екстрактівP. тайванськийголки.

Найкращі трави для лікування старіння Cistanche

Більшість ізолятів досліджено на наявністьпротизапальну біоактивністьза моделлю клітинних нейтрофілів і шість сполук (45, 47, 48, 49, 50, і51) виставлено aзначне пригнічення генерації супероксид-аніонуі вивільнення еластази зі значеннями IC50 в діапазоні від 3,3± 0.9 до 8.3± 0.8 µМ. Ціпротизапальні інгредієнтибули піддані док-обчисленням для оцінки їх спорідненості зв’язування з рецептором греліну, який відіграє важливу роль у регуляції метаболізму, зантивіковий ефект. Сполуки49, 50, і51 утворював стабільний комплекс з рецептором греліну за допомогою водневих зв’язків і різних типів взаємодій.

1. Введення

Соснарід (Pinaceae), що включає понад 100 видів і в основному поширений у Північній півкулі, зазвичай є вічнозеленими деревами, а деякі є чагарниками [1]. Соснова деревина легка і часто використовується для меблів. Однак різні фармакологічні ефекти хвої на пагони сосни були зафіксовані в старовинних книгах традиційної китайської медицини. У «The Divine Husbandman's Herbal Foundation Canon» хвоя сприяла росту волосся, продовжувала життя та втамовувала спрагу. У «Taiping Shenghui Fang» було записано, що соснову хвою можна готувати з алкоголем, і вона має ефект омолодження. Зараз хвою обробляють як чай і користуються популярністю в Азії. У Кореї складові вP. densifloraчай з хвої, а також їїантиоксидантну та антибактеріальну біоактивність були широко досліджені [2,3]. З початку минулого століття було ідентифіковано понад сімсот сполукХвоя сосни. Більшість повідомленої літератури стосується ефірної оліїP. densiflflora[4,5], P. halepensis[6,7], P. nigra[4,8] іP. sylvestris[4,9]. Охарактеризовані компонентиСоснахвоя складається переважно з бензоїдів, дитерпеноїдів, флавоноїдів, лігнанів, монотерпеноїдів і сесквітерпеноїдів [10]. Голки оP. densifloraіP. morrisonicolaповідомлялося про їх антиоксидантну біоактивність [11–14]. Крім того, етилацетатний екстракт хвоїP. morrisonicolaпригнічує експресію білка та мРНК NO таiNOS в LPS-індукованих макрофагах RAW 264.7, демонструючи значну протизапальну біоактивність [13]. Надкритичний рідкий екстрактP. densifloraголки продемонстрували інгібуючу дію на LPS-індуковану продукцію NO шляхом зниження експресіїiNOS та зниження експресії IL-6 та IL-1 та активація білків STAT1 і STAT3 в макрофагах, індукована LPS [15]. Етанольний екстрактP. thunbergiiголки показали значну протизапальну дію на макрофаги та пригнічували індукований арахідоновою кислотою набряк вуха та пригнічували ферментативну активність мієлопероксидази [16]. Причому ферментованийP. morrisonicolaхвоя показала свою чудову антиоксидантну та протизапальну біоактивність шляхом модуляції NF-κB сигнальний шлях [17]. 

Грелін — це пептидний гормон, що складається з двадцяти восьми амінокислот і спочатку був виявлений у шлунку [18,19]. Це ендогенний ліганд для стимулятора секреції гормону росту (GHSR), який є членом -гілка GPCR класу A (рецептори, пов’язані з білком G) [18,19]. Грелін є єдиним пептидним гормоном, який викликає відчуття голоду для підвищення апетиту [20]. Багато досліджень показали, що грелін відіграє важливу роль у регулюванні метаболізму, енергетичного балансу, пам’яті, серцево-судинних і шлунково-кишкових функцій в організмі людини.21–23]. Грелін також бере участь у різних фізіологічних і патофізіологічних механізмах в організмі людини, таких як старіння [24,25], і це може бути пов’язано з протизапальною активністю [26,27]. У 2014 році унікальні ацильовані флавоноїдні тетраглікозиди, названі тегрелінами, були вперше ідентифіковані нашою групою в чаї Chin-shin oolong і продемонстрували їх активність у вивільненні гормону росту (GH) [28]. Дві інші подібні сполуки були очищені в чаї Shy-ji-chuen oolong, і їх біоактивність на рецептор греліну також була перевірена [29]. Чотири тегреліни викликають почуття голоду через той самий регуляторний шлях, що й грелін. Не обмежуючись чаєм, сполуки зі структурою або подібною біоактивністю до тегрелінів також були досліджені вГорець багатоквітковий(Hes houwu) [30], Гінкго білоба[31], Морус білий[32] іЦистанка трубчаста [33]. Ці результати підтримують нас у пошуку природних принципів запобігання старінню шляхом перевірки греліноподібних сполук чаю, які мають протизапальну дію. На додаток до безпосереднього виконання активності стимулювання вивільнення гормону росту в клітинних моделях, молекулярне моделювання деяких потенційних сполук було б більш ефективним у дослідженні можливих кандидатів [34]. Обчислювальні методи були застосовані для розробки та оцінки фармакологічних гіпотез. Молекулярний докінг є одним із найбільш часто використовуваних методів, який передбачає конформацію та афінність зв’язування ліганду з активною кишенею з високою точністю [35,36]. Методи стикування ефективно шукають багатовимірні простори для можливої ​​взаємодії та використовують функцію підрахунку балів, яка належним чином ранжує кандидатів [37]. 

У 2018 році з хвої очищено три сполукиP. morrisonicolaі виявляли значну судинорелаксуючу активність, і серед цих компонентів повідомлялося про одну зі структурою, подібною до греліну чаю [38]. на Тайвані,P. тайванськийхвою зазвичай сушать і запікають, а потім обробляють як чай через їх знамениту біоактивність.P. тайванськийХаята є одним з місцевих та ендемічних видів Тайваню. Її також називають тайваньською червоною сосною або сосною хуаншань. Є дві хвої в пучку 8–11 см завдовжки, злегка жорсткі та прямі, і вони ростуть по всьому острову від низьких до великих висот і часто утворюють чистий ліс [39]. При попередньому дослідженні етилацетатний шар метанольних екстрактівP. тайванськийголки показали значне пригнічення утворення супероксид-аніону та вивільнення еластази за допомогою IC50 значення 0.8± {{0}}.2 і 1.0± 0.1 µг/мл відповідно (Таблиця S1). Тому в цьому дослідженні біологічно активні компонентиP. тайванськийголки досліджували, а очищені сполуки оцінювали на їх протизапальну дію біоактивність на моделі клітинних нейтрофілів. Крім того, ізоляти зP. тайванськийголки з протизапальною біоактивністю були піддані док-обчисленню тадосліджено їх взаємодію з рецептором греліну.

2. Матеріали та методи

2.1. Загальні експериментальні процедури

ультрафіолетові (УФ) спектри були отримані за допомогою спектрометра Hitachi U-2001 UV/V. TheІнфрачервоні (ІЧ) спектри досліджували за допомогою спектрофотометра Jasco FT/IR-4100.1H-, 13C-, і 2D спектри ядерного магнітного резонансу (ЯМР) були записані на Bruker AV-400ЯМР спектрометр. Хімічні зрушення показані вδ значення (ppm) з тетраметилсиланомяк внутрішній стандарт. TheδH іδC значення були для хімічних зсувів сигналів,відповідно. Іонізаційна мас-спектрометрія з електророзпиленням високої роздільної здатності (HR-ESI-MS).проведено за допомогою спектрометра JEOL JMS-700 (працює в режимі негативних іонів).

2.2. Рослинний матеріал

Голки оP. тайванськийбули зібрані в Пулі, Наньтоу, Тайвань та ідентифікованіПрофесор Шенг-Ян Ван (Департамент лісового господарства Національного університету Чун-Сінг,Тайчжун, Тайвань). Зразок ваучера (PCKuo_2016003) було збережено в HerbarФармацевтичний факультет Національного університету Ченг Кунг, Тайнань, Тайвань.

2.3. Екстракція та ізоляція

2.4. Спектральні та фізичні дані 1–5

2.4.2. 1-[(70 R,80 S)-70 ,90 -Дигідрокси-70 -(4-гідрокси-3-метоксифеніл)пропан-80 -ілокси]-2-гідроксибензойна кислота (2)Безбарвний сироп; [ ]25 D плюс 5,3 (c 0.1, MeOH); УФ (MeOH)λмакс(журналε) 284 (3.59), 253 (3,80) нм; ECD (c 3.51 × 10−4 M, MeOH)λмакс(∆ε) 248 (плюс 1,33), 224 (плюс 1,03),214 (плюс 1,10) нм; ІЧ (чистий)νмакс3425, 2927, 1541, 1384, 1271 см−1;1H і13C ЯМР; ХРЕСІМСm/z 349.0936 ([M − H]− обчислено для C17H17O8, 349.0923).

2.4.3. (13E,12R)-12-гідроксиагатова кислота (3)

Безбарвний порошок; Т.пл.: 263◦C (дек.); [ ]25 D плюс 30,8 (c 0.1, MeOH); УФ (MeOH)λмакс(журналε) 225 (ш) (3,83) нм; ІЧ (чистий)νмакс3450, 2937, 1648, 1252 см−1;1H-ЯМР (CD3OD,400 МГц) δ 0.63 (3H, s, CH3-20), 1,09 (1H, ддд,J = 13.6, 13,6, 3,6 Гц, H-3a), 1,21 (3H, с, CH3-18), 1.21 (1H, m, H-1a), 1.42 (1H, m, H-5), 1.51 (1H, m, H-2a), 1.59 (2H, m, H-11),1.79 (1H, m, H-1b), 1.91 (1H, m, H-2b), 1.91 (1H, m, H-6a), 1.98 (1H, m, H-7a), 2.01 (1H, m,H-6b), 2,08 (3Н, с, СН3-16), 2.12 (1H, m, H-9), 2.14 (1H, m, H-3b), 2.43 (1H, m, H-7b), 4.03 (1H, дд,J = 9.2, 2,8 Гц, H-12), 4,53 (1H, с, H-17a), 4,91 (1H, с, H-17b), 5,88 (1H, br s, H-14);13С-ЯМР (CD3OD, 100 МГц)δ 13.5 (CH3-20), 14,9 (CH3-16), 21.2 (C-2), 27.6 (C-6), 29.6 (CH3-18), 31.5 (C-11), 39.4 (C-3), 40.0 (C-7), 40.3 (C-1), 41.2 (C-10), 45.3 (C-4), 53.1 (C-9), 57.6 (C-5), 75.5 (C-12), 106.9 (C-17), 117.8 (C-14), 150.2 (C-8), 159.5 (C-13), 167.2 (C-15), 181.5 (C-19); ХРЕСІМСm/z 349.2024 ([M − H]− обчислено для C20H29O5, 349.2015).

2.4.4. 5-Ізопропіл-3-оксоциклогекс-1-ен-1-карбонова кислота (4)

Безбарвний пластинчастий кристал; Т.пл.: 235◦C (дек.); [ ]25 D плюс 28,6 (c 0.3, MeOH); УФ (MeOH)λмакс(журналε) 237 (ш) (3,40) нм; ІЧ (чистий)νмакс3456, 2925, 1635, 1395 см-1;1H-ЯМР (CD3OD,400 МГц) 0,88 (3H, d,J = 6.8 Гц, канал3-9), 0.98 (3H, d, J = 6.8 Гц, канал3-10), 1.84 (1H, m, H-4a), 2,02 (1H, м, H-4b), 2,09 (1H, м, H-5), 2,31 (1H, гепт,J = 6.8 Гц, H-8), 2.50 (1H, dddd,J = 19.2, 9,2, 4,8, 2,4 Гц, H-6a), 2,70 (1H, dddd,J = 19.2, 5,2, 5,2, 1,2 Гц, H-6b), 6,32 (1H, дд,J = 2.4, 1,2 Гц, H-2);13С-ЯМР (CD3OD, 100 МГц)δ 19.0 (C-9), 20.9 (C-10), 24.3 (C-4), 27.0 (C-6), 27,1 (C-8), 53,7 (C-5), 128,7 (C-2), 160,6 (C-1), 174,8 (C-7), 205,7 (C-3); ХРЕСІМСm/z 181.0855 ([M − H]− обчислено для C10H13O3, 181.0865).

2.4.5. Стираксинолова кислота (5)

Безбарвний сироп; УФ (MeOH)λмакс(журналε) 308 (2,89), 237 (ш) (3,37), 222 (ш) (3,70) нм;ІЧ (чистий)νмакс3421, 2926, 1572, 1395, 1268 см-1;1H-ЯМР (CD3OD, 400 МГц) 1,82 (2H, tt,J {{0}}.0, 6,8 Гц, H-8), 2,61 (2H, т,J {{0}}.0 Гц, H-7), 3,56 (2H, т,J = 6.8 Гц, H-9), 3.83 (3H, с, OCH3-3), 6.86 (1H, d, J = 2.4 Гц, H-4), 7.31 (1H, d,J = 2.4 Гц, H-6);13С-ЯМР (CD3OD,100 МГц)δ 32,7 (C-7), 35,6 (C-8), 56,6 (OCH3-3), 62.3 (C-9), 116.3 (C-4), 120.1 (C-1), 122.8 (C-6), 131,9 (C-5), 149,2 (C-3), 150,7 (C-2), 176,2 (C-10); ХРЕСІМСm/z 225.0767 ([M − H]−обчислено для C11H13O5, 225.0763).

2.5. Дослідження протизапальної біоактивності

2.5.1. Препарат нейтрофілів людини

Дослідження було проведено за схваленням інституційної ревізійної ради меморіальної лікарні Чанг Гун (IRB № 201800369A3). Зразки крові відбирали у здорових донорів (віком від 20 до 30 років), нейтрофіли виділяли та очищали згідно з протоколами, описаними раніше [40]. 

2.5.2. Генерація супероксид-аніону

Вимірювання Тест для вимірювання генерації супероксид-аніонів ґрунтувався на інгібованому SOD відновленні ферицитохромуc як описано раніше [40].

2.5.3. Аналіз вивільнення еластази

Дегрануляцію азурофільних гранул визначали шляхом вимірювання вивільнення еластази, як описано раніше [40]. 

2.5.4. Статистичний аналіз Результати виражені як середні± стандартна помилка середнього (SEM). Розрахунок 50 відсотків інгібуючої концентрації (IC50) проводили за допомогою програмного забезпечення PHARM/PCS v.4.2. Статистичні порівняння проводили між групами за допомогою Стьюдентаt-тест. Цінностіp < 0.05 were considered to be statistically significant. 

2.6. Дослідження молекулярного докінгу

Thein silicoоцінка проводилася на програмному забезпеченні AutoDock Vina [41]. Кристалічна структура рецептора греліну була охарактеризована [42] і a . Файл PDB було завантажено з Protein Databank (PDB ID: 6KO5). Тривимірні структури лігандів побудовано в програмі Chem3D. Було проведено додавання водню, вимірювання заряду Гаштайгера для атомів білка та вибір гнучких торсіонів для лігандів від AutodockTools (ADT вер. 1.5.6). Розмір сітки був розроблений на рівні 18,5 Å× 18.5 Å × 18,5 Å та визначено центр сітки за розмірами (x, y та z відповідно): 9,7, –19,2, 14,6. Енергію спорідненості зв'язування надано як показники докінгу та показано в ккал/моль. Найкращою взаємодією вважалася лише найрезультативніша поза. Візуалізацію найкращих взаємодій стикування було проаналізовано в клієнті Biovia Discovery Studio 2020 [43].