Протиалергічна та протизапальна дія неферину на клітини RBL-2H3

Будь ласка зв'яжітьсяoscar.xiao@wecistanche.comдля отримання додаткової інформації

Анотація:Тучні клітини відіграють дуже важливу роль у шкірній алергії та запаленні, включаючи атопічний дерматит і псоріаз. У минулому було встановлено, що референс має протизапальну та антивікову дію на шкіру, але його вплив на тучні клітини ще не вивчено детально. У цьому дослідженні ми використовували огрядні клітини (клітини RBL-2H3) і мишачі моделі для вивчення протиалергічних і запальних ефектів порівняння. По-перше, ми виявили, що референс пригнічує дегрануляцію тучних клітин і експресію цитокінів. Крім того, ми спостерігали, що коли тучні клітини стимулювали A23187/форбол 12-міристат-13-ацетатом (PMA), підвищення рівня внутрішньоклітинного кальцію пригнічувалося за допомогою порівняння. Фосфорилювання шляху MAPK/NF-KB також знижується попередньою обробкою еталонного зразка. Результати досліджень in vivo показують, що референс може покращити появу дерматиту та інфільтрації тучних клітин, спричинених динітрохлорбензолом (DNCB). Крім того, експресія бар'єрних білків у шкірі також відновлюється.цистанчНарешті було виявлено, що посилання може зменшити поведінку подряпин, викликану сполукою 48/80. У сукупності наші результати показують, що референс є дуже хорошим протиалергічним і протизапальним природним продуктом. Його вплив на тучні клітини сприяє його фармакологічному механізму.

Ключові слова:довідковий; натуральний продукт; мастоцит; дерматит; сверблячий

Натисніть тут, щоб дізнатися більше

1. Введення

Багато досліджень підтвердили, що алергічні захворювання є результатом не тільки вродженої імунної активації, але й адаптивної активації. Серед них огрядні клітини відіграють дуже важливу роль у різноманітних алергічних захворюваннях, таких як алергічний риніт, астма та алергічний дерматит. Тучні клітини експресують рецептори IgE (FceRI) на своїх клітинних мембранах, і рецептори FceRI мають високу афінність до антитіл IgE [1,2]. Коли антиген-специфічний IgE зв’язується з FceRI, виникає взаємодія та виникає алергічна реакція. Агрегація FceRI може активувати рецепторні тирозинкінази, ініціювати подальші реакції та сприяти фосфорилюванню різних ключових білків (таких як мітоген-активована протеїнкіназа; MAPK), що в кінцевому підсумку призводить до припливу іонів кальцію (Ca2 плюс), що є ключова подія в дегрануляції тучних клітин [3].cistanche АвстраліяАктивовані тучні клітини дегранулюють і вивільняють хімічні медіатори. Ці хімічні медіатори, що використовуються в алергічних реакціях, можуть викликати запалення [4], тому лікування алергічних симптомів включає інгібітори дегрануляції тучних клітин. Тому інгібування IgE-опосередкованої дегрануляції тучних клітин часто використовують для ідентифікації нових сполук для запобігання та лікування алергічних захворювань. Було встановлено, що анти-динітрофеніл (DNP) IgE антитіла та антигени можуть індукувати реакції пасивної гіперчутливості шкіри (PCA) як типова in vivo модель гіперчутливості негайного типу та як препарат для дослідження потенціалу антиантигенних алергій [5,6]. ]. Крім того, дегрануляція тучних клітин також може бути викликана неімунними стимуляторами, такими як сполуки 48/80 і A23187. Давно відомо, що іонофор кальцію A23187 стимулює секрецію тучних клітин із вивільненням попередньо сформованих медіаторів, таких як гістамін, із їх гранул [4] Сполука 48/80 є змішаним полімером п-метокси-N-метилфенетиламіну зшитий формальдегідом, який широко використовується для незалежної стимуляції тучних клітин [7,8]. Тому відповідні кількості сполуки 48/80 та A23187 зазвичай використовуються як реагенти для вивчення механізму алергічних реакцій. За статистичними оцінками, близько 15-20 відсотків населення страждає на атопічний дерматит. Незалежно від того, чи страждають це захворювання діти чи дорослі, без належного лікування атопічний дерматит може спричинити психологічний стрес пацієнтам і обтяжувати витрати на здоров’я їхніх сімей і суспільства [9]. На жаль, не існує відповідного методу лікування алергічного дерматиту. Сучасні варіанти лікування все ще дозволяють уникнути хвороботворних алергенів, а постійне використання стероїдів є золотим стандартом лікування. Неминучі алергени та побічні ефекти ліків спонукали до термінової розробки нових терапевтичних препаратів. Природні сполуки, виділені з лікарських трав і рослин, є потенційними джерелами терапевтичних засобів для профілактики та лікування запальних захворювань і поліпшення якості життя пацієнтів з алергічними захворюваннями.

Cistanche може омолоджувати старіння

Посилання походить від ядра лотоса (зародка насіння) рослини Nelumbo nucifera і є основним бісбензилізохіноліновим алкалоїдом. Є докази того, що референс має широкий спектр фармакологічних властивостей, таких як протираковий, антиоксидантний, протизапальний і нейропротекторний ефекти при багатьох захворюваннях [10-15].переваги cistancheХан та ін. виявлено, що референс спричиняє ефект проти фотостаріння шляхом інгібування УФ-опосередкованого підвищення рівня АФК і малонового діальдегіду (МДА) у кератиноцитах і фібробластах людини [16,17]. Нещодавно ми виявили, що референс має потенціал як альтернативний засіб для лікування атопічного дерматит або інші запальні захворювання шкіри [18]. Проте, чи справді референс діє на тучні клітини проти шкірної алергії, залишається невизначеним. У цьому дослідженні ми мали на меті дослідити вплив референсу на опосередковані тучними клітинами алергічні захворювання з використанням ліній тучних клітин людини (клітини RBL-2H3) і сполуки 48/80- та анафілаксії, спричиненої DNCB модель мишей.

La referencencia proviene del nucleo de loto (el embrión de la semilla) de la planta Nelumbo nucifera y es un importante alcaloide de bisbencilisoquinolina. Existe dokazi de que la referencia tiene una amplia gama de propiedades farmacológicas, como fectos anticancerígenos, antioxidantes, antiflamatorios y neuroprotectores, en muchas enfermedades [10-15]. Beneficios de la cistanche Khan et al. encontró que la referencia produce efectos anti-fotoenvejecimiento al inhibir el aumento de los niveles de ROS y malondialdehído (MDA) mediado por UV en queratinocitos y fibroblastos humanos [16,17] Recientemente, descubrimos que la referencia tiene potencijal como medicina alternativa para el tratamiento de atópica dermatitis u otras enfermedades inflamatorias relacionadas con la piel[18]. Sin embargo, sigue siendo incierto si la referencia tiene un efecto contra la alergia cutánea en los mastocitos. En este estudio, nuestro objektivo fue investigar los efectos de referencia en las enfermedades alérgicas mediadas por mastocitos, utilizando líneas de mastocitos humanos (células RBL-2H3) y un modelo de ratones con anafilaxia inducida por compuesto 48/80 y DNCB .

2. Результати

2.1. Тест на цитотоксичність неферину на тучних клітинах щурів (RBL-2H3)

Оскільки клітини базофільного лейкозу щурів (RBL)-2H3, аналог тучних клітин, що вивільняють гістамін, є придатними клітинами для вивчення ефектів опосередкованого тучними клітинами запалення [19], ми використали ці клітини для дослідження протиалергічних ефекти посилання. Спочатку ми перевірили, чи може референс викликати цитотоксичність у тучних клітинах. Коли клітини попередньо обробляють еталонним вмістом від 1 до 30 мкМ протягом 24 год, життєздатність клітин не постраждає від еталонного лікування (рис. 1).

2.2. Неферин зменшує ефект дегрануляції RBL-2H3, стимульований різними активаторами

Клітини RBL-2H3 зазвичай використовуються для досліджень in vitro дегрануляції [20-22]Стимуляція клітин RBL-2H3 за допомогою анти-динітрофенолового (DNP)IgE та DNP-кон’югованого сироваткового альбуміну людини (HSA) викликає дегрануляцію. Крім того, відомо, що тучні клітини дегранулюють у відповідь на синтетичні сполуки, такі як сполука 48/80 та іонофор кальцію A23187, і ці сполуки використовувалися як зручні реагенти для прямих досліджень механізмів алергічних реакцій in vitro [23, 24]. Результати показали, що цитоплазма RBL-2H3, яка не була активована активатором, містила обмежену кількість секреторних гранул.цистанний холестеринОбробка еталонним （10 мкМ） сама по собі не вплинула на активність RBL-2H3 (рис. 2A, B). Однак додавання різних активаторів, включаючи сполуку 48/80, A23187 та анти-DNP/IgE плюс DNP/HSA, явно заповнило цитоплазму секреторними гранулами. Під електронним мікроскопом можна побачити, що в цитоплазмі є велика кількість секреторних гранул, а деякі секреторні гранули навіть зливаються з клітинною мембраною, що призводить до дегрануляції (рис. 2C-E). Після попередньої обробки еталонним вмістом 10 мкМ секреторні гранули в цитоплазмі були значно зменшені (рис. 2F-H). Ці результати вказують на те, що референс може ефективно пригнічувати активацію та дегрануляцію RBL-2H3, стимульовану активатором.

2.3. Неферин пригнічує PMA/A23187-індуковане підвищення внутрішньоклітинного кальцію в RBL-2H3

Іони кальцію відіграють роль вторинних месенджерів у процесі активації клітин. A23187 є найефективнішим засобом для збільшення проникнення іонів кальцію через клітинні мембрани та стимулювання активації тучних клітин. Форбол міристат ацетат (PMA) може активувати протеїнкіназу Cand і збільшити кількість внутрішньоклітинних іонів кальцію для посилення ефекту A23187. Збільшення іонів кальцію в тучних клітинах також вважається важливим фактором індукції активації тучних клітин, що впливає на дегрануляцію тучних клітин і вивільняє більше запальних цитокінів і хемокінів.побічні ефекти Cistanche deserticola,Тому це дослідження мало на меті з’ясувати, чи може референс пригнічувати концентрацію іонів кальцію в RBL-2H3, коли він пригнічує запалення. Експериментальну групу поділяли на групи з контрольною попередньою обробкою або без неї протягом 20 хвилин і додавали 1 мМ CaClz і PMA/A23187 для стимуляції та активації RBL-2H3. Експериментальні результати показали, що обробка RBL-2H3 різними концентраціями порівняння сама по собі не вплинула на збільшення внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію. У групі PMA/A23187-індукованого притоку Ca2t концентрація внутрішньоклітинних іонів кальцію значно зросла. Клітини RBL-2H3 попередньо обробляли протягом 20 хвилин еталонними концентраціями (3 мкМ і 10 мкМ), і концентрація іонів кальцію була значно знижена (рис. 3).

2.4. Неферин знижує експресію мРНК прозапальних цитокінів у PMA/A23187, стимульованих RBL-2H3

Імунна відповідь шкіри збільшить кількість огрядних клітин в організмі, а огрядні клітини потім вироблятимуть прозапальні цитокіни та прискорять розвиток захворювання. Прозапальні цитокіни, особливо TNF-a, IL-6, IL-1 та IL-8, не тільки індукують запалення, але й викликають лейкоцитарну інфільтрацію, утворення гранульоми та фіброз тканин. PMA/A23187 діє на тучні клітини та спонукає їх виробляти IL-16, IL-6, TSLP і TNF-, викликаючи запалення, пов’язане з алергією. Таким чином, ми попередньо обробили RBL-2H3 еталонним вмістом протягом 20 хвилин і стимулювали PMA/A23187 протягом 6 годин, щоб виявити, чи може еталонний референт знижувати експресію мРНК IL-1, IL{{ 19}}, TSLP і TNF-a. Результати показали, що в групі, яка отримувала лише порівняння, експресія мРНК цитокінів не постраждала, а експресія мРНК у групі, яка індукувала запалення PMA/A23187, значно зросла. У групі, яка отримувала еталонне лікування, спостерігалося, що рівні експресії мРНК IL-1, IL-6, TSLP і TNF-a були значно пригнічені (рис. 4).

2.5. Неферин пригнічує PMA/A23187-індуковане фосфорилювання MAPK шляху в RBL-2H3

Попередні дослідження вказували на те, що тучні клітини повинні вивільняти внутрішньоклітинні іони кальцію, щоб активувати MAPK. Крім того, сигнальний шлях MAPK регулює експресію моноцитів, Т-лімфоцитів, В-лімфоцитів, цитокінів і хемокінів і індукує аутоімунітет. Цей механізм подібний до шляху активації PMA/A23187. У цьому дослідженні ми досліджували, чи може еталон брати участь у регуляції шляхів MAPK. Ми обробляли RBL-2H3 різними концентраціями порівняння (1,3 і 10 мкМ) протягом 20 хвилин, а потім стимулювали PMA/A23187 протягом 30 хвилин, щоб викликати запалення. Результати показали, що коли RBL-2H3 обробляли лише різними концентраціями порівняння, активація білків p38, JNK і ERK не вплинула. У групі, яка отримувала лише PMA/A23187, ми виявили, що білки p38, JNK і ERK були активовані та мають значне фосфорилювання. У групі, попередньо обробленій еталонним, спостерігалося, що при більш високих концентраціях еталонного фосфорилювання білків p38, JNK і ERK було значно знижено (Рис. 5A-C).

2.6. Неферин інгібує PMA/A23187-індуковане фосфорилювання NF-B шляху в RBL-2H3

Експресія прозапальних цитокінів залежить від активації фактора транскрипції NF-kB в тучних клітинах. Коли білок IKB фосфорилювався та розкладався, NF-kB вивільнявся та мігрував у ядро, зв’язуючись із відповідними реагуючими на ДНК елементами та сприяючи транскрипції прозапальних медіаторів. Було вироблено багато цитокінів і хемокінів, які регулюють імунну відповідь, диференціацію та запалення. Таким чином, ми дослідили, чи впливає попередня обробка еталонним вмістом на фосфорилювання білка, індуковане PMA/A23187. Ми обробили різні концентрації порівняння (1,3 і 10 мкМ) до RBL-2H3. Через 20 хвилин PMA/A23187 стимулював RBL-2H3 протягом 1 або 2 годин, щоб викликати запалення. Результати показали, що обробка RBL-2H3 різними концентраціями порівняння не вплинула на фосфорилювання IKBa та NF-KB. Коли PMA/A23187 використовували для стимуляції, спостерігалося значне збільшення фосфорилювання IkBo та NF-KB. Було виявлено, що в групі, попередньо обробленій за допомогою порівняння, фосфорилювання IkBa (Фіг. 6A) і NF-KB (Фіг. 6B) було значно знижено.

2.7. Вплив неферину на атопічний дерматит, викликаний 2,4-динітрохлорбензолом (DNCB)

Тваринна модель для дослідження захворювань, DNCB є типовим подразником, який викликає атопічний дерматит [25]. У нашому експерименті використовується 1-відсотковий динітрохлорбензол (DNCB), розчинений у 75-відсотковому спирті, щоб викликати першу стадію реакції сенсибілізації. Еталон (3 мг/кг і 10 мг/кг) і дексаметазон (Dexa, {{10}}.2 мг/кг), розчинені в ДМСО, вводили внутрішньочеревно на п’ятий день протягом десяти днів . На 8, 1 і 14 добу застосовували 0,5% ДНКБ як другий етап індукції запалення. Мишей розділили на чотири групи — контрольну групу, групу DNCB, групу порівняння та групу лікування дексаметазоном — а потім, після порівняння між групами, відзначили відмінності. Ми спостерігали, що DNCB індукував реакцію атопічного запалення шкіри на шкірі мишей. Після застосування DNCB було виявлено, що на шкірі мишей посилилося почервоніння та лущення. Усе це пов’язано з аномальною проліферацією кератиноцитів, інфільтрацією та агрегацією імунних клітин. Група, яка отримувала еталонну дозу 3 мг/кг і дексаметазон 0,2 мг/кг протягом чотирьох днів, зменшила почервоніння. Ми продовжували спостерігати за станом спинної шкіри мишей до 15-го дня. Порівняно з контрольною групою, група DNCB мала сильні почервоніння та набряк шкіри, а також була лупа та рани, які, здавалося, викликані свербінням і болем . Ми можемо виявити тенденцію до зменшення ступеня після лікування еталонним і дексаметазоном (рис. 7A). Фарбування толуїдиновим синім використовували для спостереження за кількістю агрегованих тучних клітин. Під мікроскопом тучні клітини виглядали фіолетовими. Можна кількісно продемонструвати, що кількість тучних клітин, інфільтрованих і накопичених у дермі в експериментальній групі DNCB, значно збільшилася порівняно з контрольною групою. У групі, яка отримувала референс і дексаметазон, інфільтрація, агрегація та кількість огрядних клітин зменшилися (Рис. 7B, C).

2.8. Неферін покращує експресію мРНК бар’єрних молекул після лікування DNCB

Пов’язане зі шкірою запалення, спричинене AD, може спричинити порушення функції шкірного бар’єру. Якщо шкірний бар’єр несправний, антигенам або подразникам легше проникнути через епідерміс шкіри та потрапити в організм, щоб викликати реакції, пов’язані з імунною системою. При цьому буде пригнічуватися продукція білків диференціації, зокрема філагрину, лорікрину та інволюкрину. Тому відновлення пошкодженого шкірного бар’єру є дуже важливим для профілактики та лікування БА [26]. У нашому дослідженні ми використовували посилання для втручання в тваринну модель атопічного дерматиту, індукованого DNCB. Після умертвіння мишей дорсальну тканину шкіри об’єднали для аналізу RI-qPCR, щоб оцінити, чи може еталон покращити зниження експресії мРНК у філагріні, лорикрині та інволюкрині після лікування DNCB. Результати показали, що експериментальна група DNCB значно знизила експресію мРНК філагрину, лорикрину та інволюкрину порівняно з контрольною групою. Експресія мРНК філагрину, лорикрину та інволюкрину була значно збільшена в групі, яка отримувала референс і дексаметазон, порівняно з групою DNCB (рис. 8).

Крім того, ми довели, що референс має протиалергічний ефект подряпин. Ми використовували агент дегрануляції тучних клітин, сполуку 48/80, щоб викликати поведінку подряпин у мишей BALB/c. Як показано на малюнку 9, ми виявили, що обробка порівняння пригнічує поведінку подряпин, спричинену сполукою 48/80 (50 мкг/місце). Повторне введення нижчих і вищих доз порівняння (3 і 10 мг/кг) протягом 5 послідовних днів значно зменшувало кількість подряпин, спричинених сполукою 48/80.