Омолоджуючий вплив екстракту Piper Cambodianum Cistanche на нормальні клітини дермальних фібробластів людини та модель загоєння ран у мишей Ⅱ

Цистанхевитягують захищені клітини NHDF від впливу УФ-опромінення

Клітини шкіри швидко реагують на вплив УФ-випромінювання або цитокінів, таких як інтерлейкін (IL)-4 та IL-13.19Під впливом ультрафіолетового випромінювання стимулюються різні фактори, включаючи EGFR,20,21 TNFR,22мітоген-активовані протеїн (MAP) кінази, ERK і c-Jun амінокінцева кіназа (JNK).23І JNK, і p38 фосфорилюють і активують фактор транскрипції c-Jun, який, у свою чергу, підвищує рівень c-Fos і підвищує рівень білка-активатора фактора транскрипції-1,24який необхідний для транскрипції MMP. Ці рецептори активуються шляхом фосфорилювання MAP-кінази та інших білків, що знаходяться нижче.25MAP-кінази активуються шляхом фосфорилювання специфічних залишків треоніну і тирозину.24,26УФ-опромінення призводить до високої експресії гетеродимерів c-Jun і c-Fos, численних цитокінів і факторів росту, які фосфорилюються JNK і p38.27,28Подібним чином, рівні білка р53 були підвищені, починаючи з 2,5 годин до 24 годин після УФ-опромінення.29Ми продемонстрували, що клітини, піддані УФ-опроміненню протягом 24 годин, експресують рівні білків TNFR1 і EGFR, які знижуються залежно від дози, коли клітини обробляютьсяЦистанхе. Ми досліджували вплив УФ-випромінювання як на фосфорилювання, так і на активність p38 (Thr180/Tyr182). Рівні білків c-Jun і p53 були різко зниженіЦистанхе-оброблені клітини (рис. 4A і B).

Натисніть тут, щоб отримати більше інформації про Cistanche для лікування старіння

Екстракт цистанхе захищав опромінені ультрафіолетом клітини NHDF від АФК

Світло UVB стимулює виробництво ROS,30,31а вплив ультрафіолету на шкіру виробляє АФК, такі як O2 ⋅−, H2 O2, і1 O2. 32Необроблені іЦистанхе-оброблені клітини піддавали УФ-опроміненню протягом 24 годин, і генерацію ROS вимірювали за допомогою флуоресцентно-активованого сортування клітин (FACS).

малюнок 3Регуляція білків ЕСМ вЦистанхе-оброблені клітини.Примітки: (A) Клітини NHDF оброблялиЦистанхепротягом 24 годин. Клітинні лізати аналізували методом імуноблоттингу з використанням анти-колагенових, анти-еластинових, анти-MMP-3 і анти-ERK-2 антитіл. Результати є репрезентативними для трьох незалежних експериментів. (B) Актин, колаген, еластин, MMP-3 і ERK-2 в імунопреципітатах кількісно визначали методом Вестерн-блот. Висота смуги є відповідним середнім± SD трьох незалежних експериментів. *P,0.05; **P,0.01. Скорочення:Конц, концентрація; ECM, позаклітинний матрикс; ERK, кіназа, регульована позаклітинним сигналом; MMP, матриксна металопротеїназа; NHDF, нормальний дермальний фібробласт людини;Цистанхе, Пайпер камбоджійськийП. Фурн.; SDs, стандартні відхилення.

малюнок 4Цистанхе інгібування виробництва АФК в УФ-опромінених клітинах.Примітки: (A) Клітини NHDF піддавали УФ-опроміненню при 40 Дж протягом 180 секунд і оброблялиЦистанхепротягом 24 годин. Клітинні лізати аналізували за допомогою імуноблоттингу з використанням антитіл проти TNFR6, анти-c-Jun, анти-c-Fos, анти-pp38 або анти-p-JNK. Результати є репрезентативними для трьох незалежних експериментів. (B) Загальний і тирозин-фосфорильований p38, JUK, актин і TNFR6 в імунопреципітатах були кількісно визначені за допомогою Western аналізів. Висота смуги є середнім значенням± SD трьох незалежних експериментів. *P,0.05; **P,0.01. Скорочення:Конц, концентрація; EGFR, рецептор епідермального фактора росту; JNK, c-Jun амінокінцева кіназа; JNK, c-Jun N-кінцева кіназа; NHDF, нормальний дермальний фібробласт людини;Цистанхе, Пайпер камбоджійськийП. Фурн.; АФК, активні форми кисню; SD, стандартне відхилення; TNFR, рецептор фактора некрозу пухлини; УФ, ультрафіолет.

УФ-опромінення збільшило виробництво АФК, в той час якЦистанхе екстракт зменшив виробництво АФК у клітинах NHDF. Рівні ROS H2 O2 були виміряні за допомогою клітинних пермеантів 2′,7′-дихлордигідрофлуоресцеїну діацетат (CM-H2 DCFDA) (Малюнок 5A). УФ-опромінення підвищило рівень АФК H2 O2 , тоді як рівні АФК були знижені наЦистанхе екстракт залежно від дози (рис. 5B). Ці результати свідчать про теЦистанхеекстракт захищає дермальні фібробласти від ультрафіолетового випромінювання, зменшуючи утворення АФК.

Макроскопічне спостереження загоєння ран у мишей

На спинах мишей створювали рани, а потім їх лікувалиЦистанхевитяг (0, 1, 10 і 50µг/мл); площі рани вимірювали кожен день протягом 4 днів. На 4 день ділянки навколо ран вЦистанхеМиші, які отримували лікування, показали зменшення почервоніння залежно від дози порівняно з необробленими ділянками рани (рис. 5). Площі рани, оброблені екстрактом, були меншими, ніж площа необробленої рани, демонструючи дозозалежну схему. На 4 добу ранові ділянки обробили 50µг/млЦистанхебули повністю вкриті новим епітелієм. Жодна ділянка рани не була інфікована (рис. 6A і B). Були розраховані співвідношення площ рани в дні 0 і 4 (Рисунок 6C).

Обговорення

Використання трав’яних матеріалів і різних частин рослин зростає разом із супутнім прогресом у фітотерапії. Рослинні матеріали використовувалися в різних формах, таких як моно- або багатотрав’яні препарати, дієтичні добавки та дієтичні інгредієнти, і багато з них стали добре відомими та безпечними комерційними товарами.33Різні рослини, в т.чЦистанхе, були досліджені їх потенційні фармакологічні властивості, але порівняльні дослідження з ними раніше не проводилисьЦистанхе екстракт. Це дослідження було проведено для визначеннянаслідкиЦистанхе екстракт про активність загоєння ран з використанням моделей розрізних ран у мишей. Загоєння ран передбачає відновлення цілісності тканини через процеси, пов’язані зі стадіями запалення, проліферації та ремоделювання.34 Етап ремоделювання шкіри характеризується переформулюванням і реформуванням компонентів колагенових волокон, які покращують міцність на розрив.35Процес загоєння регулюється в основному біосинтезом і відкладенням нового колагену та подальшим дозріванням.36У нашому дослідженні ран,Цистанхе екстракт продемонстрував посилений ефект загоєння ран порівняно з контролем (рис. 1C і 6). Таке загоєння може відбуватися завдяки підвищеній концентрації колагену та стабілізації волокон. У процесі відновлення тканин запальні клітини посилюють міграцію та проліферацію ендотеліальних клітин, що призводить до неоваскуляризації клітин сполучної тканини, які синтезують позаклітинні матриці, включаючи колаген і кератиноцити, що призводить до реепітелізації пошкодженої тканини.37Швидша швидкість звуження рани може збільшити міжклітинну комунікацію у фібробластах і прискорити дозрівання грануляційної тканини.38У моделі розрізної рани миші, які отримувалиЦистанхеекстракт продемонстрував швидше загоєння ран порівняно з контролем (рис. 6). Численні дослідження показали, що зниження регуляції шляху кінази р38 захищає різні клітинні лінії дикого типу, що експресують p53-, від генотоксичного стресу.39,40Наші дані показали, що експресія p38 в клітинах, опромінених ультрафіолетом, була зниженаЦистанхе лікування. томуЦистанхе екстракт, отриманий з листя і стебла, продемонстрував ефективне лікування при загоєнні ран.Цистанхевитягнути зменшену продукцію АФК від УФ-опромінення шляхом поглинання АФК у клітинах NHDF (рис. 5A і B). Крім того,Цистанхеекстракт прискорює загоєння ран після опромінення шкіри ((Рисунок 6A–C). Ці результати припускають, щоЦистанхе екстракт захищає шкіру від пошкодження ультрафіолетовим випромінюванням і може бути корисним як нова сировина в косметиці.

малюнок 5Цистанхе-опосередковане інгібування продукції АФК в УФ-опромінених клітинах.Примітки: (A) Клітини обробляли UVB-опроміненням (40 Дж) протягом зазначеного часу, а потім інкубували з 2′,7′-дихлордигідрофлуоресцеїну діацетат протягом 30 хвилин. Генерацію ROS вимірювали за допомогою FACS. (B) Клітини піддавали дії UVB (40 Дж) протягом 180 секунд і обробляли вказаною концентрацієюЦистанхепротягом 24 годин. Продукцію АФК оцінювали за допомогою фарбування 2′,7′-дихлордигідрофлуоресцеїну діацетат і аналізували за допомогою FACS.Скорочення:FACS, сортування клітин, що активується флуоресценцією; FITC, флуоресцеїну ізотіоціанат; NHDF, нормальний дермальний фібробласт людини;Цистанхе, Пайпер камбоджійськийП. Фурн.; АФК, активні форми кисню; УФ, ультрафіолет; UVB, ультрафіолет B.

Малюнок 6Ранозагоювальний вплив на пошкоджену шкіру миші.Примітки: (A) Рани діаметром 5- мм були створені на дорсальній шкірі 7-тижневих самців мишей C57Bl/6 (n=3). Відновлення ран оцінювали за допомогоюЦистанхелікування в різних концентраціях (негативний контроль і післяранова обробкаЦистанхена 1, 10 і 50µг/мл). (B) Площу рани визначали шляхом вимірювання діаметра відкритих ран. (C) Площа рани була розрахована за розміром відкритих ран; *P,0.05; **P,0.01. Скорочення:Цистанхе, Пайпер камбоджійськийП. Форн; Конц, концентрація.

Висновок

Це дослідження досліджувалопотенційний омолоджуючий і ранозагоювальний ефект екстракту стебла та листя цистанхив клітинах NHDFі мишача модель загоєння ран. Theобробка клітин NHDF Cistanche екстрактисприяє відновленню подряпаної ділянкидозозалежним чином, а також посилення експресії гена ECM. Крім того, Cistancheекстрактизмоглизахищають клітину від ультрафіолетового випромінювання, зменшуючи виробництво АФК. Нарешті, ці спостереження додатково оцінюються та підтверджуються на моделі мишей для загоєння ран in vivo. томуЕкстракт цистанчі є перспективним новим терапевтичним засобом для лікування старіння та ранозагоєння.

Подяки:Це дослідження було підтримано Програмою фундаментальних наукових досліджень через Національний дослідницький фонд Кореї (NRF), що фінансується Міністерством освіти (NRF-2014R1A1A3050752). Автори хотіли б подякувати Корейському науково-дослідному інституту біонауки та біотехнології (KRIBB) за наданняЦистанхеекстракти.

Розкриття Автори повідомляють про відсутність конфлікту інтересів у цій роботі.

Список літератури

1. Сломінський А.Т., Змієвський М.А., Семак І та ін. Цитохроми p450 і рак шкіри: роль локальних ендокринних шляхів.Протипухлинні агенти Med Chem. 2014;14(1):77–96. 

2. Гілчрест Б.А. Старіння шкіри та фотостаріння.Дерматол Нурс. 1990; 2(2):79–82. 

3. Ha TY. Розробка функціональних харчових матеріалів для здорового життя.Корейська J Crop Sci. 2006;51:26–39.

4. Makrantonaki E, Zouboulis CC. Молекулярні механізми старіння шкіри: сучасний рівень.Ann NY Acad Sci. 2007;1119:40–50. 

5. Seo MY, Chung SY, Choi WK та ін. Ефект рисового вина проти старіння в культивованих фібробластах і кератиноцитах людини.J Biosci Bioeng. 2009; 107(3):266–271. 

6. Клігман А.М. Рання руйнівна дія сонячних променів на шкіру людини.ДЖАМА. 1969;210(13):2377–2380. 

7. Oikarinen A, Karvonen J, Uitto J, Hannuksela M. Зміни сполучної тканини шкіри під дією природного та терапевтичного УФ-випромінювання.Фотодерматол. 1985;2(1):15–26. 

8. Бех-Томсен Н., Вульф Х.К. Канцерогенні та меланогенні ефекти відфільтрованого джерела UVA з галогенідом металу та трубчастого флуоресцентного джерела UVA для засмаги з додатковим імітованим ультрафіолетовим випромінюванням або без нього у безшерстих мишей.Фотохім Фотобіол. 1995;62(4):773–779.

9. De MS, Lahiri SC. Дослідження на листках соковитої.Bull Calcutta Sch Trop Med. 1971;19(3):69–72.

10. Ферререс Ф., Олівейра А.П., Гіл-Іск’єрдо А., Валентау П., Андраде П.Б. Листя собачки: профілювання фенольних сполук за допомогою HPLC/DAD-ESI/MS(n) та антихолінестеразної активності.Phytochem Anal. 2014;25(5): 453–460.