Омолоджуючий ефект екстракту калюсної культури Leontopodium Alpinum (Edelweiss) завдяки профілюванню транскриптомів. Частина 3

Будь ласка, натиснітьoscar.xiao@wecistanche.comдля отримання додаткової інформації

3.4. Оцінка in vitro екстракту LACCE, пов’язаного із зволожуючим ефектом

Ми перевірили зволожуючий ефект LACCE на клітини HaCaT, використовуючи експресію аквапорину 3 (AQP3), який кодує протеїн, що транспортує воду та гліцерин, експресований у клітинах шкіри, за допомогою RT-PCR у реальному часі (рис. 3C). Порівняно з негативним контролем, ген AQP3 значно посилювався завдяки додаванню екстракту LACCE.Переваги та побічні ефекти cistanche tubulosaЦікаво, що зі збільшенням концентрації екстракту LACCE експресія AQP3 поступово зросла з 3,19 (0.1 відсоток LACCE) до 4,5 (1 відсоток LACCE).

Натисніть тут, щоб дізнатися більше

3.5. Оцінка in vitro екстракту LACCE як засобу проти зморшок

Ми протестували дію LACCE проти зморшок за допомогою маркерного гена, що кодує матричну металопротеїназу-2(MMP-2), який сприяє росту клітин, за допомогою RT-PCR у режимі реального часу (рис. 3D). УФ-опромінення значно збільшило експресію MMP-2порівняно з негативним контролем без будь-якого УФ-опромінення (кратна зміна 0.67 зі значенням менше ніж0.05). Експресія MMP-2 була знижена шляхом додавання LACCE проти UVB-опромінення. Загалом, експресія MMP-2 поступово знижувалася зі збільшенням концентрації LACCE. Експресія MMP-2 у нормальних умовах без будь-якого UVB-опромінення була порівнянна з такою в 0,5% LACCE з UVB-опроміненням.

3.6. Клінічна оцінка LACCE щодо підтяжки обличчя та покращення періорбітальних зморшок, еластичності шкіри, щільності шкіри та товщини шкіри

Щоб перевірити ефект LACCE in vivo, ми провели клінічну оцінку LACCE, пов’язаного з підтяжкою обличчя та покращенням періорбітальних зморшок, еластичністю шкіри, щільністю шкіри та товщиною шкіри. Для цього 21 жінка-добровольець, які були поділені на 12 у віці 40 років і 9 у віці 50 років, брали участь у клінічній оцінці протягом чотирьох тижнів.

Cistanche може омолоджувати старіння

Спочатку ми перевірили ефект LACCEon на періорбітальні зморшки за допомогою системи високої роздільної здатності PRIMOS. Було проаналізовано два різні параметри шорсткості, середнє шорсткість (Ra) (Малюнок 4A) і середньоквадратичну шорсткість (Rq) (Малюнок 4B). Через чотири тижні після лікування LACCE і плацебо значення Ra і Rq знизилися в обох зразках.екстракт цистанки трубчастої,Однак швидкість зниження значень Ra і Rq була набагато вищою у зразку, обробленому LACCE, ніж у зразку, обробленому плацебо (таблиця 2). Наприклад, швидкість зниження для значення Ra становила 3,654 відсотка та 6,118 відсотка через два та чотири тижні відповідно зі статистичною значущістю (p<0.05). similarly,="" the="" decrease="" rate="" for="" the="" rq="" value="" was="" 3.583%and="" 6.189%="" at="" two="" and="" four="" weeks,="" respectively,="" with="" statistical="" significance=""><0.05). moreover,="" the="" ratio="" of="" volunteers="" who="" displayed="" a="" reduction="" in="" the="" roughness="" parameters="" for="" the="" lacce-treated="" sample="" was="" much="" higher="" than="" that="" for="" the="" placebo-treated="" sample.="" for="" example,="" at="" four="" weeks,="" the="" ratios="" of="" volunteers="" showing="" a="" decrease="" in="" ra="" and="" rq="" values="" were="" 90.476%="" in="" the="" lacce-treated="" sample="" and="" 57.142%="" in="" the="" placebo-treated="">

Рисунок 4. Клінічні випробування LACCE in vivo для підтяжки обличчя та зменшення періорбітальних зморшок, еластичності шкіри, щільності шкіри та товщини шкіри. Значення Ra (A) і Rq (B) були виміряні системою високої роздільної здатності PRIMOs у три різні моменти часу, щоб спостерігати ефект періорбітальних зморшок LACCE (1 відсоток). Значення загальної еластичності (R2)(C), чистої еластичності (R5)(D) і біологічної еластичності (R7)(E) були виміряні для спостереження еластичності шкіри за допомогою LACCE. Вимірювання щільності шкіри (F) і товщини шкіри (G). Вимірювання R у куточку рота (H). До/після: ймовірність p (повторні вимірювання ANOVA, значущі:*p<><><0.001).lacce lacebo="" b:="" probability="" p(repeated="" measures="" anova,="" significant∶="" 十="" p=""><>

Ми перевірили вплив LACCE на еластичність шкіри щік за допомогою Cutometer. Були виміряні три різні параметри: загальна еластичність (R2), чиста еластичність (R5) і біологічна еластичність (R2)(R7) (рис. 4C-E). Значення R2, ​​R5 і R7 для обох станів, які отримували LACCE і плацебо, зросли протягом чотирьох тижнів.Cistanche tubulosa відгуки,Наприклад, значення R2 для зразка, обробленого LACCE, збільшилося з 0.728 до 0.752, тоді як значення R2 для зразка, обробленого плацебо, збільшилося з 0.74{ {10}} до 0,752 (Малюнок 4C). Крім того, швидкість збільшення у зразку, обробленому LACCE, була набагато вищою, ніж у зразку, обробленому плацебо (Таблиця 3). Наприклад, рівень збільшення у зразку, який отримував LACCE, становив 3,296 (R2), 5,816 (R5) і 6,756 (R7), тоді як рівень збільшення у зразку, який отримував плацебо, становив 1,621 (R2), 2,895 (R5), і 3,378(R7) через чотири тижні. Однак не було різниці у співвідношенні добровольців, які показали збільшення еластичності шкіри між двома зразками.

Ми перевірили вплив LACCE на щільність шкіри та товщину шкіри за допомогою Dermascan-C. Обидва зразки продемонстрували збільшення щільності шкіри та товщини шкіри через чотири тижні після лікування (рис. 4F,G). Наприклад, щільність шкіри у зразку, обробленому LACCE, зросла з 26,708 до 28,168, тоді як у зразку, обробленому плацебо, зросла з 26,936 до 28,168 (Малюнок 4F). Швидкість збільшення щільності шкіри була набагато вищою у зразку LACCE (5,466 відсотка), ніж у зразку, який отримував плацебо (3,118 відсотка), через чотири тижні після лікування (таблиця 4). Знову ж таки, швидкість збільшення товщини шкіри була набагато вищою у зразку LACCE (10,192 відсотка), ніж у зразку, який отримував плацебо (4,829 відсотка), через чотири тижні після лікування. Цікаво, що багато добровольців показали значне збільшення щільності шкіри (90,476 відсотка) і товщини шкіри (100 відсотків) після чотирьох тижнів лікування LACCE.

Ми перевірили вплив LACCE на підтяжку обличчя в кутику рота за допомогою аналізу Муаре. Обидва зразки, які отримували LACCE і плацебо, показали зниження підтяжки обличчя (рис. 4H); однак швидкість зниження підтяжки обличчя була набагато вищою у зразку LACCE (2,541 відсотка), ніж у зразку плацебо (0.437 відсотка) через чотири тижні лікування. Співвідношення добровольців, у яких спостерігалося зниження підтяжки обличчя, було вищим у групі LACCE (85,714 відсотка), ніж у групі плацебо (57,142 відсотка).

3.7. Аналіз транскриптомів клітин HaCaT у відповідь на LACCE за допомогою RNA-Seq

Незважаючи на те, що екстракт LACCE продемонстрував кілька позитивних ефектів як косметичний засіб, варто звернути увагу на те, щоб вивчити зміни в транскриптомі людини у відповідь на LACCE. Для цього ми використовували 1-відсотковий екстракт LACCE замість нижчої концентрації, оскільки припускали, що можливий вплив низької концентрації LACCE на клітини кератиноцитів може бути незначним. Клітини HaCaT обробляли 1% LACCE (обробка), тоді як контрольні клітини HaCaT обробляли стерильною водою. Три біологічні репліки були застосовані для RNA-Seg. Кількість зчитувань послідовності коливалася від 32 776 672 до 42 640 000(Таблиця 5). Понад 90 відсотків зчитувань у всіх шести зразках були зіставлені на еталонних транскриптах людини, які містили 159 998 стенограм (Малюнок 5A). Для аналізу експресії генів ми розрахували кількість фрагментів на кілобазу транскрипту на мільйон значень (FPKM). Як показано на малюнку 5B, значення FPKM у трьох оброблених зразках були вищими, ніж у трьох контрольних зразках. Після видалення надлишкових транскриптів лише 11 290 транскриптів із 68 158 транскриптів були експресовані в клітинах кератиноцитів людини (таблиця S1).

Рисунок 5. Результати картографування, розподіл фрагментів на кілобазу транскрипту на мільйон значень (FPKM) і візуалізація диференціально експресованих генів. (A) Частина картованих (помаранчевий) і некартованих (сірий) зчитувань у еталонному транскриптомі людини. (B) Коробковий графік, що показує розподіл значень FPKM у кожній бібліотеці. (C) Графік вулкана, що відображає розподіл log1o(adj) і log2 (FC) для всіх експресованих генів. Pad і FC вказують на скориговані значення p і зміну складки відповідно. Десять ідентифікованих DEG позначені синіми (гени зі зниженою регуляцією, Down), червоними (гени з підвищеною регуляцією, Up) і сірими (гени з несуттєвою експресією, NS) крапками.

Незважаючи на те, що ми використовували вищу концентрацію LACCE (1 відсоток), яка була в 10 разів вищою, ніж звичайний LACCE (0,1 відсотка), який використовується для косметики, транскриптом клітин кератиноцитів людини суттєво не змінився у відповідь на лікування LACCE, як показано на графіку вулкана (таблиця S1 і малюнок 5C).cistanche ВеликобританіяБазуючись на скоригованому p-значенні менше ніж 0.001 і log2 (кратна зміна) більше 1, ми ідентифікували загалом 10 диференціально експресованих генів (DEG) на LACCE (Таблиця 6). З 10 градусів,

чотири гени зі зниженою регуляцією були генами, що кодують інгібітор зв’язування ДНК 3, домен 1 анкіринового повтору, Rho-пов’язаний домен BTB, що містить 3, і 18S рибосомний N5. Шість регульованих генів були генами, що кодують карбоангідразу 2, білок 3, що зв’язує інсуліноподібний фактор росту, кератин 15, білок 3, що взаємодіє з BCL2-, білок 1, що зв’язує фактор росту фібробластів, і transCript4, що індукує пошкодження ДНК.

3.8. Функціональні ролі регульованих генів у відповідь на LACCE

Вплив LACCE на транскриптом кератиноцитів був м’якшим, ніж інші методи лікування стресу. Щоб отримати функціональний огляд генів з підвищеною та зниженою регуляцією, ми провели аналіз збагачення GO. Однак ми не отримали значущих результатів для збагачених термінів GO через невелику кількість диференціально експресованих генів. Таким чином, ми збільшили кількість диференціально експресованих генів, застосувавши скориговане значення p менше 0.05 і log2 (кратна зміна) більше 0,5. У результаті ми ідентифікували 22 гени з підвищеною регуляцією та 13 генів із зниженою регуляцією (таблиця S1). Аналіз збагачення GO виявив 36 збагачених термінів GO, які складаються з 21 терміну GO (біологічний процес), двох термінів GO (молекулярна функція) і 13 термінів GO (клітинний компонент) у генах з підвищеною регуляцією (таблиця S2). Навпаки, лише 12 збагачених термінів GO для біологічного процесу були ідентифіковані в 13 генах зі зниженою регуляцією (Таблиця S2).

Згідно з біологічним процесом, гени, задіяні в кератинізації, зроговілості, запрограмованій смерті клітин, організації клітинних з’єднань, позитивній регуляції процесу розвитку та встановленні шкірного бар’єру, були сильно активовані (рис. 6A).cistanche wirkungЩо стосується молекулярної функції, структурна складова цитоскелету та активність структурної молекули були високо виражені (таблиця S2). У випадку клітинного компонента гени проміжної нитки, позаклітинної екзосоми та кератинової нитки були високо експресовані (Рис. 6B). З 12 термінів GO для 13 генів зі зниженою регуляцією, гени, пов’язані з відповіддю на іони цинку, регуляцією окостеніння та негативною регуляцією біологічного процесу, часто були зниженими.

Малюнок 6. Ієрархічна структура ідентифікованих збагачених термінів GO для генів людини з підвищеною регуляцією у відповідь на LACCE. Спрямовані ациклічні графи (DAG) візуалізують ієрархічну структуру ідентифікованих збагачених термінів GO для генів з підвищеною регуляцією після обробки LACCE відповідно до біологічного процесу (A) і клітинного компонента (B). Кожен термін GO позначається різним кольором рамки на основі p-значення. Детальну інформацію про визначені терміни GO можна знайти в таблиці S2.

4. Обговорення

Косметика класично визначається як будь-який готовий продукт, який можна нанести на тіло людини, включаючи обличчя, шкіру, волосся, рот і очі, щоб змінити або зміцнити зовнішній вигляд людського тіла [21]. Крім того, косметика використовується для очищення, надання аромату та захисту. Більшість косметичних засобів складається з хімічних сполук, які можуть бути отримані з природних джерел або синтетики [22].

У цьому дослідженні ми досліджували можливі ефекти LACCE як природної сполуки для косметики за допомогою різноманітних аналізів in vitro та in vivo. Кілька результатів аналізів in vitro показали сильну антиоксидантну активність LACCE у відповідь на лікування УФВ. Цікаво, що дія антиоксиданту LACCE корелювала з концентрацією LACCE. Антиоксидантна активність LACCE (1 відсоток) була порівнянна з активністю NAC або набагато вища, ніж вітамін C. LACCE містить більшу кількість хлорогенової кислоти, 3,5-дикафеоїлхінової кислоти, леонтоподової кислоти B і леонтоподової кислоти A, ніж нормальної калюсної культури едельвейсу, як показано в попередньому дослідженні [4]. Зокрема, попереднє дослідження, що ідентифікувало дві леонтоподові кислоти з едельвейсу, продемонструвало функціональну роль LACCE як антиоксидантного агента [23].

Експресія двох запальних генів була пригнічена лікуванням LACCE, що свідчить про можливу роль LACCE у протизапальній активності, як було показано раніше [7, 24]. Цікаво, що не було істотної різниці в протизапальному ефекті між різними концентраціями LACCE, що вказує на те, що 1 відсоток LACCE може бути достатнім для застосування в якості протизапального засобу в косметиці. На відміну від цього, експресії AQP3 і MMP2, необхідні для зволоження і зморшок, відповідно, різко змінилися після обробки різними концентраціями LACCE.

Клінічний тест є найважливішим кроком для використання рослинного екстракту як косметичного джерела. У цьому дослідженні ми досліджували ефекти LACCE in vivo за участю 21 добровольця. Застосування LACCE на обличчі та тканинах шкіри показало значне збільшення чотирьох різних факторів (покращення періорбітальних зморшок, еластичності шкіри, щільності шкіри та товщини шкіри) порівняно з плацебо. Зокрема, постійне використання LACCE значно покращило стан обличчя та шкіри. Хоча екстракти едельвейсу відомі як джерело для косметики, це перший звіт, який демонструє успішне застосування LACCE як косметичного матеріалу.

Для оцінки рослинних екстрактів як косметичного або лікарського джерела in vitro дослідження експресії маркерних генів є популярним експериментальним підходом. Однак застосування лише вибраних генів для аналізу експресії генів має кілька обмежень. Недавній швидкий розвиток секвенування наступного покоління полегшує аналіз експресії генів у всьому геному. У цьому дослідженні ми використовували RNA-Seq для вивчення транскриптомних змін у клітинах кератиноцитів людини у відповідь на LACCE. Наші результати показали, що принаймні 16,56 відсотка генів людини експресуються в клітинах кератиноцитів, що вказує на тканинно-специфічну експресію генів людини. LACCE індукував експресію численних генів; однак глобальна зміна людського транскриптому за допомогою LACCE була помірною порівняно з іншими стресовими умовами. Цей результат гарантує безпеку LACCE для застосування в тканинах людини.

Аналіз збагачення показав, що регульовані гени, що кодують кератин 5 (KRT5), KRT19, KRT6A, KRT15, ​​KRT14, KRT17 і з’єднувальний плакоглобін (JUP), брали участь у кератинізації та зроговінні. Кератиноцити епідермісу відіграють важливу роль як бар’єр проти різноманітних факторів зовнішнього середовища [25]. Зокрема, кінцеві диференційовані епідермальні клітини розвиваються в мертві кератиноцити шляхом запрограмованої клітинної смерті, яка називається зроговінням, утворюючи міцний епідермальний бар’єр [26]. Після смерті клітин ороговілий шар шкіри надає багато переваг обличчю та тканинам, включаючи підвищення еластичності, стабільності, зволоження та механічної стійкості [25]. З ідентифікованих генів KRT ген, що кодує Keratin15 (KRT15), член сімейства генів кератину, відомий як маркер стовбурових клітин волосяного фолікула, який сильно експресується в тканинах шкіри [27,28]. Нещодавнє дослідження показало, що KRT15 функціонує в епітеліальній регенерації проти радіації та загоєнні ран [29,30].

На додаток до кількох генів, що кодують білки KRT, гени, що кодують DDIT4, BNIP3 та IGFBP3, функціонують у програмованій смерті клітини. Наприклад, транскрипт4 (DDIT4), індукований пошкодженням ДНК, сильно експресується різними стресами та інгібує мішень у ссавців шляху комплексу рапаміцину 1 (mTORC1), пов’язаного з лікуванням раку [31]. Попередні дослідження ідентифікували ген DDIT4, який був високо експресований дексаметазоном, який є хіміотерапевтичним засобом, що індукує аутофагію в лімфоцитах, що свідчить про його можливу роль у регуляції клітинного росту, проліферації та виживання [32,33]. LACCE продемонстрував подібну дію дексаметазону як протизапальний засіб. Bcl-2/аденовірус E1B 19-kDa-взаємодіючий білок (BNIP3) є членом сімейства проапоптозних білків, що регулюють клітинну проліферацію[34] . Крім того, BNIP3 бере участь у захисті кератиноцитів від апоптозу, спричиненого UVB, шляхом посилення експресії його генів [35]. Кілька досліджень показали, що експресія білка 3, що зв’язує інсуліноподібний фактор росту (IGFBP-3), пов’язана зі старінням клітин [36,37]. Додавання IGFBP-3 індукує або пригнічує апоптоз залежно від типу клітин [37]. Наприклад, IGFBP-3 посилено регулювався в імморталізованих вірусом папіломи людини клітинах шийки матки, що призвело до посилення IGF-1-індукованого мітогенезу [37]. Нещодавнє дослідження показало зниження регуляції IGFBP-3 у старіючих і H, O2-індукованих старих клітинах порівняно з молодими клітинами, що свідчить про його можливу роль як маркера старіння [36].

BNIP3, IGFBP3, стратифін (SFN), CA2, FGFBP1, KRT17 і JUP беруть участь у позитивній регуляції процесу розвитку. З них карбоангідрази є всюдисущими ферментами, присутніми в прокаріотах і еукаріотах, включаючи тварин і рослини [38]. У людей карбоангідраза каталізує утворення вугільної кислоти з води та вуглекислого газу (CO,), які необхідні для фізіології мозку, нирок і кісток [39]. Попереднє дослідження показало, що CA4 і CA9 були активовані у миші під час гіпоксичного періоду рани за допомогою RNA-Seq [40]. Крім того, додавання рекомбінантного ферменту СА9 сприяло реепітелізації ран [40]. Крім того, дослідження протеомів також виявило участь білка CA2 у старінні та нейродегенерації у миші [41]. Тут ми продемонстрували, що LACCE сприяє регенерації клітин кератиноцитів людини шляхом посилення експресії CA2. Білок 1, що зв’язує фактор росту фібробластів (FGFBP1), є позаклітинним секретованим шапероном, який зв’язується з FGF і модулює сигналізацію FGF J42]. Кілька досліджень показали, що FGFBP1 сильно експресується під час ангіогенезу та відіграє важливу роль у канцерогенезі шкіри, запаленні та загоєнні ран [42-44]. Крім того, клітинна локалізація регульованих генів у везикулі, позаклітинній екзосомі, проміжній нитці та кератиновій нитці свідчить про те, що ці білки є основним компонентом цитоскелета.

У генах зі зниженою регуляцією більшість генів, як відомо, індукуються різними стресами. Наприклад, два гени, що кодують металотіонеїн 2a (MT2A) і металотіонеїн le (MT1E), індукуються в умовах металевого стресу, включаючи іони цинку, іони міді та іони кадмію, і окисного стресу, такого як UVB [45,46]. Крім того, інгібітор ДНК-зв'язування 3 (ID3), член білків спіраль-петля-спіраль, є негайно-раннім геном у відповідь на мітогенні сигнали та окислювальний стрес [47]. Домен анкіринового повтору 1 (ANKRD1), також відомий як серцевий анкіриновий повторний білок (CARP), є транскрипційним кофактором, який посилено регулюється під час загоєння ран і індукує ангіогенез [48]. І ID3, і ANKRD1 беруть участь у негативній регуляції біологічного процесу. ID3 діє як регулятор транскрипції, пригнічуючи диференціювання стовбурових клітин і сприяючи прогресуванню клітинного циклу [47]. Крім того, нещодавнє дослідження показало, що втрата функції ANKRD1 у мишей призвела до сповільненого загоєння ран, що свідчить про його роль у пораненні та пошкодженні тканин [49]. ]. Крім того, Rho-пов’язаний домен BTB, що містить 3 (RHOBTB3), функціонує для сприяння протеасомній деградації факторів, індукованих гіпоксією (HIF), які є основними регуляторами адаптивних реакцій на низький рівень кисню [50]. Крім того, індукований інтерфероном трансмембранний білок 1 (IFITM1) пригнічує проникнення багатьох вірусів у клітину-хазяїна [51]. Подібним чином ген, що кодує інтерферон-альфа-індукований білок 6 (IFI6), індукується інтерфероном і регулює апоптоз і противірусний вроджений імунітет [52,53]. Понижувальна регуляція генів, що реагують на стрес, під час лікування LACCE свідчить про те, що LACCE не викликає стресу в клітинах кератиноцитів людини.

5. Висновки

Тут ми оцінили LACCE як натуральний косметичний матеріал за допомогою кількох аналізів in vitro та in vivo, що свідчить про його потужний вплив на покращення стану обличчя та шкіри. Зокрема, аналіз транскриптомів на основі RNA-Seg виявив молекулярний механізм у клітинах кератиноцитів людини у відповідь на LACCE. LACCE підвищив регуляцію гена, який бере участь у кератинізації та зроговінні, забезпечуючи шкірний бар’єр, якому сприяють гени, необхідні для запрограмованої смерті клітин. Багато позитивних регуляторів процесу розвитку регулювалися вгору, тоді як різноманітні гени, індуковані стресом, регулювалися внаслідок лікування LACCE. У сукупності наше дослідження показало, що LACCE є засобом для омолоджуючої косметики або космецевтики.

Ця стаття взята з Genes 2020, 11, 230; doi:10.3390/genes11020230 www.mdpi.com/journal/genes