Антивіковий ефект уролітину А на бичачі ооцити in vitro

Будь ласка зв'яжітьсяoscar.xiao@wecistanche.comдля отримання додаткової інформації

Анотація:Окислювальний стрес і мітохондріальна дисфункція були пов’язані з віковим зниженням якості ооцитів, і стратегії їх запобігання в даний час знаходяться під сумнівом. Уролітин А (UA) є природним метаболітом з проапоптозною та антиоксидантною дією, здатний запобігати накопиченню дисфункціональних мітохондрій у клітинах різного віку. UA ніколи не тестувався на овоцитах великої рогатої худоби. Нашою метою було вивчити вплив UA на потенціал розвитку кумулюсно-ооцитних комплексів (COC) і гранульозних клітин (GC) експресії важливих генів, пов’язаних з репродуктивною компетентністю. Прогресування ядерного дозрівання, мітохондріальний мембранний потенціал (МММ) і здатність до розвитку фізіологічно зрілих (22 год) і in vitro старих ооцитів (30 год IVM), отриманих від препубертатних і дорослих самок, з додаванням UA або без нього, були оцінені. Крім того, кількість мРНК кількох генів (NFE2L2, NQO1 і mt-DN5) і кількість копій ДНК mt-ND5 були кількісно визначені в культивованих GC від препубертатних і дорослих самок, доповнених UA чи ні. Наше дослідження підтвердило шкідливий вплив старіння ооцитів на прогресування ядерного дозрівання, MMP, компетентність у розвитку та рівні експресії генів. Покращене лікування UA під час дозрівання in vitro (стор<0.05) the="" maturation="" rate="" and="" subsequent="" developmental="" capacity="" of="" aged="" oocytes.="" a="" positive="" effect="">< 0.05)="" of="" ua="" on="" physiological="" maturation,="" mmp,="" and="" embryonic="" development="" was="" also="" identified.="" ua="" also="" interfered="" with="" the="" expression="" profile="" of="" nfe2l2="" and="" nqo1="" genes="" in="" gcs="" cultures.="" our="" findings="" demonstrate="" that="" ua="" supplementation="" is="" an="" effective="" way="" to="" prevent="" oocyte="" aging="" and="" improves="" the="" subsequent="" bovine="" embryonic="">

Натисніть тут, щоб дізнатися більше

Ключові слова:ооцит; старіння; уролітин А; допоміжні репродуктивні технології

1. Введення

Зниження жіночої репродуктивної здатності є однією з перших фізіологічних функцій, на яку негативно впливає старіння, і тому вважається новою проблемою охорони здоров’я в усьому світі [1,2]. На додаток до кількох патологічних проблем, пов’язане з віком зниження жіночої фертильності значною мірою пояснюється зниженням оваріального резерву ооцитів [1,3-5] у зв’язку із залежним від часу погіршенням їх якості [2]. Цей процес погіршення може відбуватися внаслідок контакту ооцитів зі старим мікрооточенням яєчників перед овуляцією. Крім того, жіноча статева клітина часто піддається постовуляторному старінню, коли процес запліднення не відбувається протягом найкращого оптимального періоду, і незапліднена яйцеклітина залишається в яйцеводі або in vitro до осіменіння протягом тривалого часу [6] Порушення Якість ооцитів є критичним фактором, пов’язаним із невдачею допоміжних репродуктивних технологій (ДРТ), оскільки їх якість є основним визначальним фактором потенціалу розвитку ембріона після запліднення [7,8]. Часто повідомлялося, що асинхронність овуляції та старі ооцити погіршують успішність програм штучного запліднення та виробництва ембріонів у кобил, великої рогатої худоби та овець, що призводить до значних економічних втрат [1,9,10]. Тому першорядне значення має вивчення механізмів, що лежать в основі старіння ооцитів, щоб розробити кращі терапевтичні підходи до збереження фертильності у кількох видів, включаючи людей, а також як інструмент для генетичного вдосконалення худоби.cistanche wirkungОсобливу увагу слід приділяти покращенню здатності до розвитку ооцитів великої рогатої худоби в препубертатному віці, які часто використовують для прискорення генетичного розвитку та скорочення інтервалів між поколіннями.

Однією з основних причин порушення компетенції розвитку у старих ооцитів є підвищення окисного стресу, який індукує мітохондріальну дисфункцію, пошкодження ДНК і помилки формування веретена поділу, що впливає на якість ооцитів [1]. Добре встановлено, що підвищене виробництво вільних радикалів є причиною старіння клітин при кількох хронічних захворюваннях, а також у репродуктивній біології, що призводить до поганих результатів фертильності [12]. Мікрооточення яєчників, яке включає ооцити та гранульозні клітини (ГК), забезпечує антиоксидантний захисний механізм, здатний регулювати окисні умови та підтримувати баланс оксидант/антиоксидант [13]. Однак у процесі старіння ефективність антиоксидантного захисту для нейтралізації активних форм кисню (АФК) послаблюється, таким чином підвищуючи рівень окисного стресу. Фактор2, пов’язаний з ядерним фактором E2- (Nrf2 або NFE2L2), також відомий як Nrf2/Kelch-подібний ECH-асоційований білок 1 (Keap1), є домінантним каскадом відповідей, активованим окисним стресом[14]. Цей шлях є клітинним захисним механізмом, який клітини розробили, щоб справлятися зі згубним впливом окисного стресу. За нормальних умов Nrf2 негативно регулюється Keap1, утримується в цитоплазмі та підтримується на низькому рівні. Під впливом окислювачів Nrf2 відокремлюється від Keapl, що забезпечує його транслокацію в ядрі, де він зв’язується зі специфічними послідовностями ДНК. Ці послідовності, які називаються елементами антиоксидантної відповіді (ARE), призводять до транскрипційної активації цитопротекторних генів, таких як NAD(P)H:хіноноксидоредуктаза-1 (NQO1), гемоксигеназа-1 (HMOX1) , і каталітична субодиниця глутамат-цистеїнової лігази (GCLC) [15,16]. Попередні дослідження показали, що активація сигнального шляху Nrf2-Keapl зменшує пошкодження від окисного стресу шляхом підвищення рівня антиоксидантів у ГК людини та яєчниках миші [17,18]. Однак його роль у процесі старіння жіночих гамет залишається невловимою, хоча чітко встановлено, що мітохондрії є основним місцем виробництва АФК під час цього процесу [9,10].

Cistanche може омолоджувати старіння

Навпаки, мітохондрії беруть участь у кількох критичних клітинних функціях і є фундаментальними для задоволення попиту на виробництво енергії, необхідної під час дозрівання ооцитів і подальшого ембріонального розвитку [19]. Компетентна мітохондріальна активність була високоасоційована з вищим вмістом мітохондріальної ДНК (мт-ДНК) і генерацією АТФ [20], вищим потенціалом мітохондріальної мембрани [21] і підтримкою якості та кількості мітохондрій через мітофагію [22]. Крім того, було припущено, що мітохондріальна активність прямо корелює з життєздатністю ембріона та кращими результатами фертильності [23]. Все більше доказів підтверджує, що пов’язані з віком мітохондріальні зміни призводять до старіння яєчників і, як наслідок, зниження життєздатності ембріона та потенціалу імплантації. Ці зміни включають зменшення кількості копій мт-ДНК, зниження генерації АТФ [20], зміни в експресії мітохондріальних генів [24, пошкодження мт-ДНК [25] і зниження потенціалу мітохондріальної мембрани [26].

Терапевтичні підходи, націлені на мітохондрії, викликали величезний інтерес до кількох патологій, пов’язаних зі старінням, через їхній великий потенціал у посиленні функції мітохондрій [27]. У рамках цього було продемонстровано, що уролітин А (UA) — природний метаболіт, отриманий після вживання їжі, такої як гранати, з подальшим його перетворенням кишковою мікробіотою, запобігає накопиченню дисфункціональних мітохондрій з віком, індукуючи мітофагію, а також підтримуючи мітохондрії. біогенез і дихальна здатність [28,29]. UA був застосований як перспективний терапевтичний препарат для запобігання деяких видів раку, таких як колоректальний рак і рак простати [30,31]. Крім того, UA також має протизапальні [32], проти ожиріння [33], антиоксидантні [34] і антивікові властивості [35].біофлавоноїди цитрусовихНедавнє дослідження підкреслило вплив добавок UA на старіючі фібробласти шкіри людини на активацію шляху Nrf2-Keapl, посилюючи їх антиоксидантну здатність. Ця активація шляху Nrf2-Keapl ефективно пом’якшує рівень АФК шляхом посилення експресії генів ARE-відповіді Nrf2 (SOD, NQO1, GCLC і HMOX1), що вказує на багатообіцяючий ефект проти старіння [ 35].

Кілька досліджень було проведено з метою уповільнення старіння яєчників, а отже, покращення якості ооцитів і результатів фертильності. Через внесок окислювального стресу в процес старіння яєчників, а також у мітохондріальну дисфункцію, добавки антиоксидантів виявилися багатообіцяючим методом терапії [36,37]. Однак невідомо, чи може добавка уролитину А відновити пошкодження, які виникають під час старіння яєчників, сприяючи запобіганню проблемам безпліддя. Таким чином, метою цього дослідження було: (1) продемонструвати, що старіння може змінити потенціал розвитку кумулятивно-ооцитних комплексів (COC) і експресію GC важливих генів, залучених до сигнального шляху Nrf2; (2) визначити, чи UA може врятувати жіноча фертильність, що демонструє антивіковий ефект у старих КОК та ГК; і (3) оцінити вплив UA на рівень експресії генів, залучених у сигнальний шлях Nrf2, а також на якість ооцитів.

2. Матеріали та методи

2.1. Експериментальний дизайн

Це дослідження було схвалено Комітетом з догляду за тваринами Національного ветеринарного управління (N ступінь 08965DGAV) відповідно до вказівок Європейського Союзу (№.86/609/EEC). Щоб дослідити вплив старіння на зміну якості ооцитів і потенційний ефект антистаріння UA, модель з використанням КОК, зібраних у препубертатних і дорослих корів, які піддалися старінню in Vitro (30 годин дозрівання) або фізіологічному дозріванню (22). h) були застосовані процеси.

2.1.1. Попередній аналіз—доза-відповідь дослідження

Попередній аналіз для визначення концентрації UA, який слід використовувати під час процесу дозрівання КОК великої рогатої худоби, проводився на основі дослідження залежності доза-відповідь протягом чотирьох сеансів. Оскільки UA ніколи не тестувався на ооцитах великої рогатої худоби, попередні дози, успішно застосовані для профілактики та пом’якшення деяких видів раку, а також для демонстрації ефекту UA проти старіння в різних клітинних лініях, використовувалися [28,39]. КОК, отримані від препубертатних і зрілих дорослих корів (n=978), були відібрані, а потім випадковим чином розділені на п’ять груп для тестування різних доз UA: контроль, 1, 10, 25 і 50 мкМ під час фізіологічного дозрівання in vitro. Після періоду дозрівання деякі ооцити (n=154) фарбували для визначення хромосомної конфігурації та стадій дозрівання. Залишок дозрілих ооцитів піддавали in vitro осімененню замороженою/розмороженою спермою. Передбачувані зиготи культивували, і швидкість розщеплення та бластоцисти визначали на 2-й і 7-й день культивування відповідно. Виходячи з отриманих результатів, а саме відсутності шкідливого впливу та сприяння дозріванню та розвитку бластоцисти, була обрана концентрація 1 мкМ УК.

2.1.2.Дослід1

У цьому експерименті, проведеному у шість сеансів, обидва КОК з препубертатного періоду (середній вік=9 місяців, n=660) і дорослих (середній вік =39 місяців, n=674) корів були зібрані для оцінки якості ооцитів і потенціалу розвитку старих і фізіологічно дозрілих ооцитів, а також ефект UA для збереження жіночої фертильності. КОК були випадковим чином розділені на 8 груп: (1) контрольна препубертатна група, КОК від препубертатних телят, дозрілих протягом 22 годин (n=148); (2) UA препубертатна група, КОК від препубертатних телят, дозрілих у середовищі з додаванням 1 мкМ UA протягом 22 годин (n=155); (3) контроль у віці 30 годин препубертатної групи, КОК від препубертатних телят віком до 30 годин in oitro дозрівання (n =149); (4) UA віком 30 годин препубертатна група, КОК від телят у препубертатному віці, які витримували in vitro протягом 30 годин у середовищі дозрівання з додаванням 1 мкМ UA(n=144); (5) контрольна група дорослих, КОК від дорослих корів, які дозрівали протягом 22 годин (n=155 );(6) UA доросла група, COC від дорослих корів, дозрілих у середовищі з додаванням 1 мкМ UA протягом 22 годин (n=129); (7) контрольна група дорослих у віці 30 годин, COC від дорослих корів віком до 30 год дозрівання in oitro (n=148); та (8) UA віком 30 годин, група дорослих, COC від дорослих корів, які витримувалися in oitro протягом 30 годин у середовищі дозрівання з додаванням 1 мкМ UA(n=138).переваги циноморіяПісля відповідних періодів дозрівання in vitro ооцити осіменювали розмороженою спермою бика. Згодом оцінювали ембріональний розвиток, оцінюючи як швидкість розщеплених і вироблених ембріонів, так і їх якість.

Крім того, у цьому експерименті КОК з кожної групи було отримано для оцінки їхньої стадії дозрівання ядра (контрольна препубертатна група, n=7; UA препубертатна група, n =7; контрольна група у віці 30 годин препубертатного періоду, n{ {3}}; UA віком 30 годин препубертатної групи, n=6; контрольна група дорослих,n=16;UA група дорослих,n=21;контрольна група віком 30 годин дорослих, n{ {9}}; UA віком 30 годин доросла група, n=18). Також оцінювали мітохондріальний мембранний потенціал (МП) КОК (контрольна препубертатна група, n=10; UA препубертатна група, n{ {13}};контрольна група у віці 30 годин препубертатного періоду,n=9;UA віком 30 годин препубертатного періоду,n=9;контрольна група дорослих, n=15;UA група дорослих, n{ {19}}; контрольна група у віці 30 годин, n=10; UA у віці 30 годин, група дорослих, n=14).

2.1.3.Дослід2

Оскільки GC відіграють важливу роль у зростанні фолікулів і розвитку ооцитів, другий експеримент було проведено протягом п’яти сеансів для подальшого вивчення впливу віку та UA на експресію NFE2L2, NQO1 і mt-ND5. Також було оцінено кількість копій гена mt-ND5. ГК були отримані після центрифугування фолікулярної рідини, аспірованої з яєчників препубертатних (середній вік=10 місяців) і дорослих корів (середній вік =62 місяців). Ці клітини культивували в таких умовах: (1) препубертатний контроль, культура ГК препубертатних телят; (2) препубертатний UA, культура GC препубертатних телят з додаванням 1 мкМ UA; (3) дорослий контроль, культура GC дорослих корів; і (4) дорослий UA, культура GC дорослих корів з додаванням 1 мкМ UA. Після злиття GC на 5-й день культивування їх швидко заморожували в рідкому азоті, а потім екстрагували ДНК і РНК, що дозволило подальшу кількісну оцінку транскриптів мРНК NFE2L2, NQO1 і mt-ND5, а також кількість копій mt-ND5.

2.2. Збір ооцитів і дозрівання in vitro

Яєчники дорослих і препубертатних корів (попередній аналіз, n {{0}} і експ. 1, n=1334) були зібрані на місцевій бійні та зберігалися при 35-37 градусі в фосфатно-сольовий буфер (PBS), доповнений 0.15 відсотками бичачого сироваткового альбуміну (w/v, BSA), доповненим 0,05 мг мл-л канаміцину. У лабораторії фолікули яєчників діаметром 2-8 мм були аспіровані голкою 19-калібру. Тільки COC з принаймні трьома шарами компактних кумулюсних клітин і гомогенною ооплазмою промивали та відбирали для дозрівання відповідно до плану експерименту.пустельний гіацинтДозрівання відбувалося в інкубаторі при 38,8 градусах, 5% CO2 у зволоженому повітрі протягом 22 або 30 годин у середовищі для дозрівання, що складалося з середовища тканинної культури 199 (TCM) з 10% фетальної бичачої сироватки, 0,2 мМ натрію пірувату, 10 нг мл-л епідермального фактора росту та 10 мкл мл-л гентаміцину【40】.

2.3. Збір і культура клітин Granulosa

Клітини гранульози були отримані з виділеної фолікулярної рідини після центрифугування протягом 10 хв при 200xg[41]. Осад суспендували в 1 мл культурального середовища (TCM199 плюс 10 відсотків сироватки) для повторного центрифугування протягом 5 хвилин. Новий осад ресуспендували в 1 мл культурального середовища або з додаванням 1 мкМ UA, або не відповідно до плану експерименту, і гомогенізували за допомогою шприца, приєднаного до голки 19G, принаймні 30 разів для відокремлення клітин. Після оцінки життєздатності GC (барвник трипановий синій, 0,4% мас./об.) клітини висівали в концентрації 2 × 105 життєздатних клітин мл-1 і культивували протягом п’яти днів при 38,8°, 5% CO2 у зволоженій камері. атмосфери до злиття. Кожні 48 годин культуральне середовище вивантажували та оновлювали новим. Для екстракції ДНК і РНК GC збирали і промивали центрифугуванням при 200xg протягом 10 хв. Осад клітин ресуспендували в 1 мл PBS, негайно заморожували в рідкому азоті та зберігали при -80 градусах.

2.4. Дозрівання ядра ооцита

Стадії дозрівання ядер оцінювали після 22-годинного або 30-годинного періоду дозрівання in vitro.Метод екстракції флавоноїдів pdfОголені ооцити фіксували в розчині оцтової кислоти/етанолу (1:3, об’єм/об’єм) і витримували при 4 градусах протягом 48 годин. Потім ооцити фарбували 1% ацетолакмоїдним розчином, встановлювали в камеру Нойбауера і спостерігали під фазово-контрастним мікроскопом (Olympus BX41). Ооцити класифікували наступним чином: зародковий пухирець (GV), конденсаційні хромосоми I (CCI), конденсуючі хромосоми II (CCII), діакінез, анафаза-I/телофаза-I (AI/TI) і MII (метафаза-II) . Враховувалися лише ооцити з видимим забарвленням хроматину [42].

2.5. Оцінка потенціалу мітохондріальної мембрани

Для вимірювання мітохондріального мембранного потенціалу (МП), індикатора мітохондріальної активності, мітохондрії фарбували 5, 6, 6'-тетрахлор-1, 1', 3, 3'тетраетилбензімідазолкарбоціанін йодидом (JC-1 , Invitrogen, Waltham, MA, США). Оголені ооцити інкубували з 5 мкг мл-л JC-1 [37] у середовищі для дозрівання протягом 30 хвилин при 38,8° і 5% CO2 у зволоженому повітрі в темряві. Ооцити двічі промивали PBS і негайно переносили на попередньо нагріте предметне скло та спостерігали під флуоресцентним мікроскопом (Olympus BX51) з використанням блакитного флуоресцентного фільтра (BP 470-490 object UPlanFI 20×/0,50). Потенціал мітохондріальної мембрани потім розраховували як співвідношення виміряної червоної/зеленої флуоресценції за допомогою програмного забезпечення Image] (Національний інститут здоров’я, Бетесда, штат Меріленд, США). 2.6. Запліднення in vitro та культура ембріонів

Запліднення in vitro проводили із застосуванням замороженої та розмороженої сперми голштино-фризького бика, попередньо підданої капацитації за методом градієнта Перколла (45 і 90), у концентрації сперматозоїдів 2 x 10 мл-4. КОК і сперматозоїди спільно інкубували протягом 20 годин при 38,8 градусах і 5% CO2 у зволоженому повітрі. Потім імовірні зиготи переносили в краплі синтетичної рідини яйцепроводу (SOF), доповненої амінокислотами BME і MEM, глутаміном, глутатіоном і BSA [40]. Після 48 годин осіменіння швидкість розщеплення (кількість розщеплених ембріонів на загальну кількість запліднених ооцитів) була визначена, і розщеплені ембріони зберігалися в SOF з додаванням BSA та 10 відсотків фетальної бичачої сироватки (FBS). Ембріони культивували протягом 12 днів [41, 43], щоб оцінити швидкість розвитку бластоцисти (у дні 7, 9 і 12; ембріони D7 на розщеплені ембріони) і швидкість виведення ембріонів (вилупилися ембріони на ембріони D7) і їх якість [43]. Ембріони 7-го дня були класифіковані як 1 клас (хороша якість), 2 (достатня якість) і 3 клас (погана якість)[4].

2.7. Екстракція та кількісне визначення ДНК та РНК

Загальну ДНК і РНК виділяли з ГХ за допомогою High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Basel, Switzerland) і PureLinkTM RNA Mini Kit (InvitrogenTM, Waltham, MA, USA), відповідно, відповідно до інструкцій виробника. Ці протоколи включали використання спінових колонок, які використовуються для виділення високоякісної сумарної ДНК і РНК, а також ДНКази як лікування для видалення геномної ДНК з РНК [40]. Після екстракції зразки зберігалися при -80 градусах. Концентрацію та якість ДНК і РНК визначали за допомогою спектрофотометра NanoDropTM One/OneC (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, USA).

2.7.1. Комплементарний синтез ДНК

Синтез комплементарної ДНК (кДНК) із ізолятів РНК проводили за допомогою набору Xpert cDNA Synthesis Mastermix (GRiSP, Порту, Португалія, згідно з інструкціями виробника. РНК зворотно транскрибували з використанням 500 нг екстрагованої РНК з кожного зразка для здійснення синтезу кДНК, який проводився за допомогою термоциклера (T100 Thermal Cycler, Bio-Rad, Hercules, CA, США). Отримані кДНК зберігалися при -20° до використання для подальших аналізів. 2.7.2. Дизайн праймера

Для цього дослідження праймери для цільового (NFE2L2 і NQO1) та ендогенного контрольного гена (6-актину) були розроблені за допомогою програмного забезпечення Primer-BLAST Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI) (http://www .ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/, доступ 6 березня 2020 р.). Послідовності праймерів для референтних генів і цільових генів зображені в таблиці 1. Крім того, у цій роботі використовувався ген mt-ND5, а подробиці про праймери mt-ND5 були отримані з попереднього дослідження [45].

2.7.3. Кількісна полімеразна ланцюгова реакція зворотної транскрипції

Аналіз ПЛР у режимі реального часу проводили за допомогою Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X з ROX у термоциклері QuantStudio 3 (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, USA), використовуючи кДНК у концентрації 25 нг мкл-л. Оцінку кількості копій мітохондріальної ДНК (мт-ДНК) гена ND5 проводили методом КПЦР через попередньо виділену ДНК, використовуючи те саме обладнання, що й для кількісного визначення генів. Була проведена кожна оптимізована реакція, яка складалася з Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X з ROX, праймера (прямого та зворотного) кожного цільового гена, зразка (кДНК/ДНК) і води, вільної від РНКази, загальним об’ємом 10 мкл. Зразки аналізували в двох примірниках, а реакції, що містили воду замість матриці, включали як негативний контроль. Зразки піддавали протоколу ампліфікації, який складався з початкового циклу при 95 градусах протягом 2 хвилин фази денатурації, після чого слідували 40 циклів денатурації при 95 градусах протягом 55 секунд, 40 циклів відпалу протягом 30 секунд при 60 градусах (залежно від температури плавлення послідовності праймерів), і фаза розширення при 72 градусах протягом 30 с і, нарешті, остаточний період розширення при 72 градусах протягом 10 хвилин.

Для кількісного визначення експресії генів використовували метод відносної кількісної оцінки. Цей метод відносної кількісної оцінки експресії генів проводили з рівнями експресії досліджуваних генів-мішеней, які нормалізували за допомогою генів домашнього господарства, порівняльним методом КТ. Оскільки ампліфікацію за допомогою RT-qPCR проводили у двох примірниках, визначали середні значення CT для кожного гена та розраховували рівні експресії за такою формулою:

де △Ct=цільовий ген Ct - ендогенний контрольний ген Ct.

Для кількісного визначення кількості копій мт-ДНК використовували відносну кількісну оцінку, нормовану відносно методу одиниці маси. Цей метод був проведений із значеннями CT GC, оброблених UA (названими як тест), які були нормалізовані за допомогою контрольних зразків (наразі позначених як калібратори). Коли кількість копій mt-ND5 оцінювали за допомогою КПЦР і проводили в дублікаті, середні значення КТ для зразків тестів і калібраторів визначали, а співвідношення розраховували за такою формулою:

де △Ct=Ct калібратор-Ct тест, а E – ефективність.

Ця стаття взята з Animals 2021, 11, 2048. https://doi.org/10.3390/ani11072048 https://www.mdpi.com/journal/animals