Екстракт клітинних культур Oenothera Biennis, наділений дією проти старіння шкіри, покращує механічні властивості клітин

Будь ласка зв'яжітьсяoscar.xiao@wecistanche.comдля отримання додаткової інформації

Анотація:Старіння шкіри є дуже добре відомим процесом, який характеризується поступовим погіршенням механічних властивостей шкіри внаслідок зниження виробництва механізму позаклітинного матриксу та одночасної зміни процесу скорочення. Щоб уповільнити це прогресування, вкрай важливо індукувати експресію кількох білків, здатних сприяти утворенню еластичних волокон і відновленню тканин. Тут водний екстракт клітинної культури Oenothera bi-Ennis досліджували з хімічної точки зору, а потім його випробували in vitro, у клітинах та в експериментах ex vivo як допоміжний засіб для протидії старінню шкіри. показали, що екстракт Oenothera biennis здатний, збільшуючи експресію гена MYLK, сприяти скороченню колагену матриксу, полімеризації актину та виробленню основних білків ECM.

Ключові слова:метаболоміка; молекулярні мережі; гідрофільний екстракт культури клітин Oenothera biennis; скорочення матричного колагену; старіння шкіри

1. Введення

Старіння шкіри – це добре відомий процес, викликаний ендогенними та екзогенними факторами. Під час старіння всі фізіологічні функції шкіри невблаганно дегенерують, і це прогресуюче погіршення пошкоджує шкіру [1]. Дійсно, шкіра поступово втрачає свої механічні властивості як через зниження виробництва протеїнів позаклітинного матриксу, так і через одночасну зміну процесу скорочення [2]. Найважливішими компонентами позаклітинного матриксу дерми є такі білки, як колаген I і IIl, ламінін, періостин, тенасцин, еластин, фібронектин і протеоглікани, оскільки їх відносна кількість і стан згортання відіграють ключову роль у взаємодії між клітинами та матриця, що гарантує правильну текстуру дерми [3]. Наприклад, у позаклітинному просторі фібронектин відіграє ключову роль у складанні матриці, оскільки він утворює міст між рецепторами клітинної поверхні (наприклад, інтегринами) та колагеном, протеогліканами та іншими молекулами фокальної адгезії. Ламініни беруть участь у структурі позаклітинного матриксу та модулюють адгезію, диференціювання, міграцію, стабільність фенотипу та стійкість до апоптозу. Еластин також важливий для клітинної адгезії та клітинної міграції, і він має здатність брати участь у клітинній сигналізації. Фібриліни так само тісно взаємодіють з тропоеластином та інтегринами, і вони важливі для збирання еластинів у еластичні волокна. Фабула тісно пов'язана з базальними мембранами, еластичними волокнами та іншими компонентами позаклітинного матриксу, бере участь у формуванні еластичних волокон. Тенасцини — це поліморфні глікопротеїни позаклітинного матриксу (ECM), які опосередковують фіброзні процеси для ефективного відновлення тканин [4]. Крім того, процес скорочення шкіри також базується на дії фібробластів, найбільш поширених клітин у дермальному матриксі; створюють правильний натяг шкіри, сприяючи контактам між компонентами матриці, які, в свою чергу, відповідають за компактність, щільність і стійкість дерми. В основі організації клітинного цитоскелету лежить актин-міозиновий механізм, який визначає потенційні зміни їхньої форми та структури. Дійсно, зв’язування актину та міозину викликає більш компактну конформацію клітин, зближуючи волокна, гарантуючи розвиток здорової та компактної тканини та запобігаючи розпаду волокон, що призводить до появи зморшок. Однак здатність фібробластів скорочуватися та розтягуватися частково втрачається з роками, оскільки старі клітини більше не можуть діяти правильно та повністю. Завдяки меншій механічній силі фібробласти переходять до більш округлої та спотвореної морфології, ніж витягнутої [5]. Деякі дані свідчать про те, що під час старіння синтез білка під назвою MYLK (кіназа легкого ланцюга міозину) значно знижується. MYLK має кіназну активність, яка здійснюється шляхом фосфорилювання специфічного домену міозину, який називається регуляторним легким ланцюгом міозину, здатним індукувати зв’язування актину і, отже, сприяти скорочуванню клітин [6].біофлавоноїдиКоли була виявлена ​​низька активність цього білка, зумовлена, наприклад, меншою експресією білка, було виміряно відповідне зменшення скорочення матриксу колагену [7] та полімеризації актину [8]. Збірка цитоскелету актину пов’язана не лише з рухом клітини та здатністю до скорочення, але й із виробництвом матричного білка ECM через активацію рецептора TGF-II (TGFBRII)[9]. TGFBRII належить до TGF-рецепторного комплексу клітинної поверхні, який через активацію факторів транскрипції Smad регулює експресію багатьох генів, що кодують компоненти ECM, включаючи колаген, ламініни, фібронектин і протеоглікан [10]. Розбирання актинового цитоскелета знижує регуляцію рецептора TGF-Il. Це пригнічення, у свою чергу, зменшує виробництво колагену та інших білків ECM, що призводить до втрати дермальної маси та ламкості шкіри.

Насправді багато косметичних інгредієнтів спрямовані на стимуляцію синтезу кількох ключових факторів, відповідальних за підтримку правильної компактності дермального матриксу та гарного скорочення шкіри. У цьому сценарії екстракти, отримані з виду Oenothera biennis (примула вечірня), що належить до родини Onagraceae, представляють широкий інтерес через вміст у них біологічно активних сполук, таких як жирні кислоти, феноли, тритерпени та флавоноїди, які вже були досліджені. апробовано при лікуванні різноманітних шкірних патологічних захворювань [11]. Повідомляється, що деякі з цих метаболітів, у свою чергу, пригнічують медіатори запалення, такі як інтерлейкін 1 (IL-1), інтерлейкін 6 (IL-6), цитокіни та фактор некрозу пухлини (TNF-)[12]. ]. Крім того, екстракти надземних частин Oenothera biennis захищали клітини HaCaT від H, O, індукованого пошкодження ДНК та загибелі клітин, блокуючи пошкодження клітин через окислювальний стрес за допомогою механізму, який включав елімінацію АФК і сигнальний шлях Nrf2/HO-1 [ 13]. Крім того, олія Oenothera biennis, яка багата ліпідами, була запропонована як хороший зволожувач для пацієнтів з екземою завдяки своїй здатності легко проникати в шкіру [14]. На жаль, екстракти культурних рослин, що застосовуються в косметиці, можуть мати деякі недоліки: по-перше, вони можуть бути забруднені токсичними або алергенними речовинами, такими як пестициди, добрива або забруднювачі; тоді рослини піддаються непередбачуваному стресу та сезонним умовам або коливанням доступності поживних речовин, що може спровокувати синтез неочікуваних метаболітів. Крім того, екстракти можуть містити патогенні мікроорганізми, які знижують якість кінцевої продукції. Усі ці недоліки, у свою чергу, зводяться до ризику наявності мінливого вмісту вторинних метаболітів і низької відтворюваності. Щоб подолати ці недоліки, використання культур рослинних клітин у косметиці стає все більш популярним і дуже цінується, оскільки воно усуває багато вищезгаданих недоліків [15].

Натисніть тут, щоб дізнатися більше

У цьому дослідженні гідрофільний екстракт клітинних культур Oenothera biennis (ObHEx) був повністю охарактеризований за допомогою передових підходів на основі мас-спектрометрії за допомогою біоінформатики та протестований у багатьох біохімічних і біологічних аналізах. Суміш містить біологічно активні сполуки, головним чином лігнани та тритерпени, такі як арджунолова та азіатська кислоти, які раніше асоціювали з виробництвом проколагену I у фібробластах людини [16,17]. Екстракт досліджували на його здатність збільшувати експресію MYLK, сприяти скороченню матриксу колагену, полімеризації актину та виробленню TGF-регульованих білків ECM, які сприяють скороченню дерми, таким чином уповільнюючи старіння шкіри.

2. Результати

2.1. Якісний та кількісний аналіз водорозчинного екстракту культури клітин Oenothera Biennis

Було виконано UPLC-MS/MS аналіз ObHEx і спектрометричні дані високої роздільної здатності були використані для хімічної характеристики за допомогою глобальної соціальної молекулярної мережі природних продуктів (GNPS), веб-системи мас-спектрометрії, яка допомагає ідентифікувати та анотувати натуральні продукти. (NPS)[18]. Він має на меті бути базою знань із відкритим доступом для громадських організацій і для обміну необробленими, обробленими або анотованими даними фрагментованої мас-спектрометрії (MS/MS). Зокрема, було виконано пошук у спектральній бібліотеці GNPS і роботу з молекулярної мережі на основі ознак (FBMN): перший аналіз дозволив нам ідентифікувати природні сполуки, порівнюючи їхні спектри MS/MS із спектрами структурно охарактеризованих метаболітів, другий – із груповими NPs всередині мережі, оскільки схожі шаблони фрагментації MS/MS були продемонстровані структурно подібними молекулами [19]. Як показано на малюнку 1 і в таблиці 1, багато NPS, безсумнівно, були ідентифіковані як такі, що належать до кількох класів вторинних метаболітів, головним чином лігнанів (сальвадор і ліріодендрон) і тритерпенів (муріатична кислота, аріунолова кислота, азіатська кислота та гедерагенін). Хімічні види, не визначені GNPS, були призначені відповідно до літератури.

Як приклад використання GNPS, мережа, отримана за допомогою аналізу FBMN, представлена ​​на рисунку 2а, показуючи, що ObHEx містить багато інших неохарактеризованих тритерпенів, пов’язаних із соляною кислотою (18, m/z 503,3389, RT 21,89 хв: ідентифікація соляної кислоти було підтверджено шляхом порівняння з його аналітичним стандартом). Наприклад, різні раніше неохарактеризовані види при m/z 701 і 665 були ідентифіковані як глікозильовані форми, пов’язані з соляною кислотою або її ізомерами, відповідно, гідратованими чи ні двома молекулами HO

Крім того, зареєстровані іони при m/z 729, 703, 699,687,685, 683, отримані відповідно в результаті глікозилювання плюс дві молекули H, O видів при m/z531, 505,501, 489,487 і 485: їх однозначної ідентифікації не було досягнуто, але всі вони вважаються тритерпенами, пов’язаними з соляною кислотою або її конгенерами, завдяки їхньому шляху фрагментації MSMS. Нещодавно багато тритерпенів з m/ 501 і 485 були виділені з іншого виду Oenothera, Oenothera Maritima, і їх структура має було з’ясовано на основі спектроскопічних даних, що добре корелює з нашими результатами [20].

Cistanche може омолоджувати старіння

Аналіз FBMN також надав інформацію про метаболіти при m/z 617,3862 (іони MS2 при m/z 453, 145 і 119), присутні в молекулярних мережах, показаних на малюнку 2b, і про які не повідомлялося в літературі для видів Oenothera. Це значення m/z і його фрагментація збігаються з 2-OEp-кумароїловою апостоловою кислотою або її ізомерами, що підтверджує принаймні присутність тритерпенового кумароїлового, а також кофеоїлового ефірів в екстракті. Дійсно, MS-спектри видів при m/z 649 (RT 25,72 і 27,19) показали присутність іонів при m/z 179, 161 і 135 через розщеплення фрагмента кавової кислоти, тоді як спектри MS2 інших видів 2b при m/z 633 (RT 26,88, 27,20, 28,12 і 28,43), 649 (RT 24,18, 24,65, 24,83) і 661 (RT 30,28) показали іони при m/z 145 і 119, які були характерними для кумароїльного фрагмента.

After, the content of some identified lignans and triterpenes was determined. Ouantifi-cation methods were validated as reported in Table2. All calibration curves showed good linearity (R>0.9911) у межах перевірених діапазонів. Крім того, межа виявлення (LOD) і межа кількісного визначення (LOO) свідчать про те, що використані методи відрізняються високою чутливістю. Отримані результати кількісного аналізу (табл. 3) показали, що ліріодендрон і хедерагенін були основними представленими лігнаном і тритерпеном відповідно.

2.3. Аналіз експресії гена MYLK у HDF

Активність ObHEx перевіряли в HDF на експресії гена MYLK, який кодує кіназу, відповідальну за фосфорилювання легкого ланцюга міозину (рис. 3а). Результати показали, що обробка екстрактом в обох концентраціях збільшила експресію гена MYLK приблизно на 50 відсотків, подібно до позитивного контролю TGF-.

2.4. Аналіз скорочувальної здатності колагенової матриці

Для оцінки активності ObHEx на скорочувальну здатність колагенових волокон ми використовували HDF, диспергований у колагенових гелевих дисках [21]. Як показано на малюнку 3b, екстракт у меншій концентрації викликав значне збільшення скорочення колагенового диска, що свідчить про потенційний вплив на міцність колагену. Лікування ML7(1-(5-йодонафталін-1-сульфоніл)-1H-гексагідро-1,4-діазепін), інгібітором MYLK, скасував це збільшення, вказуючи на те, що і екстракт, і TGF- діють через MYLK на скорочення колагенового диска.

2.5. Вимірювання рівня полімеризації актину

Здатність ObHEx стимулювати полімеризацію актину досліджували шляхом вимірювання рівня полімеризованого актину в клітинах, оброблених екстрактом і позитивним контролем TGF- окремо та в присутності ML7. Як показано на малюнку 3c, обробка обома концентраціями екстрактів призвела до збільшення кількості полімерного актину приблизно на 50 відсотків порівняно з 33 відсотками TGF-.купити цистанчеЗнову ж таки, попередня інкубація з ML7com-повністю скасувала цей ефект, що свідчить про участь MYLK у полімеризації актинових ниток.

2.6. Аналіз шляху TGF RII/SMAD у HDF

Щоб перевірити, чи було збільшення полімеризації актину та скорочення колагену клітин, оброблених ObHEx, також пов’язане з активацією шляху передачі сигналу, опосередкованого TGF RII, ми спочатку спостерігали експресію гена TGF RII, а потім трансфікували HDF за допомогою SMAD{{ 0}}репортерну плазміду люциферази та оцінювали підвищення активності люциферази у відповідь на лікування ObHEx. Результати, наведені на малюнку 3d,e, показали, що лікування ObHEx у 0.002 відсотка та 0,006 відсотка збільшило експресію TGF RII у спосіб, подібний до TGF-, який використовувався як позитивний контроль, і, паралельно, активність люциферази, пов'язана з SMAD, зросла на 80 і 40 відсотків відповідно. Значне зниження сигналу було отримано, коли клітини обробляли ML7, показуючи також, що ця активність була пов’язана з MYLK.

2.7. Аналіз про-колагену I, тропоеластину та періостину

Як наслідок активації сигнальної трансдукції TGF RII, ми проаналізували синтез основних протеїнів позаклітинного матриксу, таких як проколаген типу I, тропоеластин і періостин, у HDF, обробленому ObHEx на рівні 0,002 відсотка. Як показано на малюнку 3f, ObHEx збільшив виробництво зазначених білків приблизно на 98 відсотків, 75 відсотків і 51 відсоток відповідно, подібно до позитивного контролю TGF-. Вимірювання проводили методом ELISA з використанням специфічних антитіл проти проколагену I, тропоеластину та періостину.

2.8. Аналіз MYLK, фосфо-міозину, колагену I та тропоеластину на експлантатах шкіри Ex-Vivo

Як показано на рисунку 4a-c, ObHEx викликав значне збільшення виробництва MYLK і фосфорильованого міозину в експлантатах шкіри людини.

Індукцію колагену I та тропоеластину також аналізували в шкірних експлантатах, попередньо оброблених ObHEx, а потім оброблених гідрокортизоном протягом 8 днів для імітації хронологічного старіння [22]. Лікування гідрокортизоном зменшило кількість колагену I та тропоеластину більш ніж на 100 відсотків, а присутність 0,002 відсотка ObHEx відновила кількість тропоеластину майже на 91 відсоток і колагену на 120 відсотків порівняно з аскорбат використовувався як позитивний контроль (рис. 4d-f). Це свідчить про потенційну дію ObHEx проти старіння, особливо ефективну для підвищення пружності шкіри шляхом дії на компоненти дермальної матриці.

2.9. Атомно-силова мікроскопія (АСМ) у шкірних експлантатах

Щоб зібрати більше інформації про біомеханічні властивості шкіри, які сприяють обробці ObHEx, ми оцінили еластичність, внутрішню механічну властивість зразків шкіри з точки зору їх модулів Юнга [23]. Як описано в Розділі 4, для розрахунку модуля пружності як на оброблених, так і на необроблених зразках шкіри ми зібрали криві сили за допомогою атомно-силового мікроскопа (АСМ) і підігнали їх за допомогою моделі Герца [24,25]. Як показано на малюнку 5, обробка зразків шкіри екстрактом мала нижчі значення модуля Юнга порівняно з необробленими зразками, що свідчить про покращення еластичних властивостей шкіри. Зокрема, необроблені зразки шкіри показали середнє значення модуля Юнга 0.37±0.15 ГПа, тоді як зразки шкіри, оброблені ObHEx, показали нижче середнє значення 0.{{11 }}7±0,02 GPA. Значення модуля Юнга зразків шкіри відповідали літературним [26-28].

3. Обговорення

Культури рослинних клітин є найбільш перспективним підходом для стійкого виробництва вторинних метаболітів рослин, що представляють комерційний інтерес, пропонуючи постійне постачання матеріалу за допомогою великомасштабного культивування та становлячи стійку та екологічно чисту систему [29,30]. Екстракти з рослинних клітинних культур знайшли багатообіцяюче застосування в секторах охорони здоров’я та косметики, оскільки вони мають певні переваги; (i) вони містять метаболіти, біосинтезовані в лабораторних умовах з контрольованим ростом; (i) вони походять із стандартизованих процесів виробництва, що гарантує однакові якісні та кількісні характеристики отриманих видів; (ii) екстракти не містять забруднювачів, таких як мікроорганізми, гербіциди, пестициди та фунгіциди; (iv) вони не залежать від географічних чи екологічних коливань, і види рослин можна зберегти для майбутнього поколінь. У цьому конкурсі водний екстракт клітинної культури Oenothera biennis (ObHEx) розглядався як багатообіцяюче джерело біологічно активних молекул, які мають дію проти старіння шкіри. Дійсно, ObHEx було досліджено за допомогою аналізу UPLC-MSMS з високою роздільною здатністю в поєднанні з підходами біоінформатики для досягнення широкої структурної характеристики. Характеристика сполук була реалізована головним чином за допомогою GNPS для прискорення процесу ідентифікації, порівняння спектрів MS/MS зі структурно охарактеризованими метаболітами та, крім того, виявлення нових неочікуваних видів, групування подібних NP у мережі. Крім того, час утримування, точні вимірювання маси та аналізи MS2 також порівнювалися з даними стандартів, і всі дані були зіставлені з літературою. Виявлено біоактивні лігнани та тритерпени, такі як сальвадор, ліріодендрон, мі-антемова кислота, арджунолова кислота, азіатська кислота та хедерагенін. Ліріодендрон [31] і соляна кислота [32] продемонстрували сильну антиоксидантну активність, тоді як хедерагенін продемонстрував властивості проти старіння шкіри завдяки зниженню клітинного окислення та активації функції протеасом [33]. Однак арджунолова та азіатська кислоти вважалися головними відповідальними за деякі з наступних перевірених активностей, оскільки вони стимулюють синтез колагену I. Дійсно, було продемонстровано, що ObHEx покращує біомеханічні властивості шкіри, які здебільшого залежать від відносної кількості різних компонентів ECM і від того, як фібробласти здатні скорочуватися та забезпечувати правильний натяг шкірних волокон.цистанчНасправді ObHEx сприяє скороченню колагенової матриці та полімеризації актину шляхом збільшення експресії гена MYLK, посилюючи силу скорочення дермальних фібробластів. Збірка актинового цитоскелету посилює регуляцію рецептора TGF-типу II і, відповідно до стимуляції передачі сигналів TGF-/Smad, підвищує рівні білків ECM, регульованих TGF. Дійсно, ObHEx індукує виробництво колагену I типу, періостину та тропоеластину. Таким чином, усі ці властивості роблять його хорошим перспективним інгредієнтом для використання в косметичних рецептах для боротьби з пов’язаною з віком втратою пружності та еластичності шкіри. Це припущення було підтверджено результатами, отриманими під час аналізу AFM, який показав, що обробка зрізів шкіри ObHEx призвела до покращення механічних властивостей шкіри, виявленого як зменшення модуля Юнга, що вказує на значне зменшення жорсткості та жорсткості шкіри.

4. Матеріали та методи

4.1. Культури тканин рослин і приготування екстракту

Рослини Oenothera biennis були надані компанією GEEL Floricultura ss і були італійського походження (уникаючи застосування Нагойського протоколу). Клітинні культури були отримані з листя рослин Oenothera biennis шляхом індукції проліферації меристематичних клітин на твердих агарових чашках до отримання калюсів. Клітини переносили в рідке середовище для росту (Gamborg B5, додане 24 дихлорфеноксіоцтової кислоти (1 мг/л), аденіну (1 мг/л) і кінетину (0.01 мг/л)). , клітини вирощували як суспензійні культури при орбітальному струшуванні. Після отримання культур приблизно 150 г/л клітини збирали та лізували у фосфатному буфері (PBS) при рН 7,4 для отримання водорозчинного екстракту, який ліофілізували. Порошок розчиняли у воді або середовищі клітинної культури у відповідних концентраціях для тестування.

4.2. Аналіз UPLC-MSMS для хімічної характеристики

ObHEx(5{{10}} мг/мл) готували та піддавали двофазовій екстракції бутанол/вода. Фракцію бутанолу сушили та розчиняли в метанолі (10мг/мл) перед аналізом UPLC-MS/MS. Це було проведено на класичному мас-спектрометрі Q-Exactive від Thermo-Scientific (Waltham, MA, США), обладнаному системою Thermo ScientificTM UltiMateTM 3000 UPLC. Усі хроматографічні цикли проводили з використанням колонки Phenomenex Luna③C18 100 A （150 × 2,0 мм, розмір частинок 3 мкм） при 40 °C і швидкості потоку 0,200 мл/хв. Об'єм ін'єкції становив 5 мкл. Рухома фаза складалася з A (вода від ROMIL Ltd, Convent Drive, Waterbeach, Cambridge, UK з 0,1 відсотка оцтової кислоти) і B (100 відсотків ацетонітрилу від ROMIL Ltd, Convent Drive, Waterbeach, Cambridge, UK) з використанням градієнтного елюювання. від 5 відсотків B за 0-5 хв, 5-14 відсотків B за 5-8 хв, 14-32 відсотків B за 8-11 хв, 32-95 відсотків Bat {{ 26}}хв,95-98 відсоток бат32-33 хв, 98 відсотків B при 33-38хв,98-5 відсоток бат38-39 хв і 5 відсотків B при { {34}} хв. Усі аналізи MS та MSMS проводили в негативному режимі ESI зі швидкістю потоку оболонкового газу 30 (довільні одиниці), швидкістю потоку допоміжного газу 5 (довільні одиниці), напругою розпилення 3,2 кВ, температурою капіляра та температура допоміжного газового нагрівача становить 300 градусів. Дані були отримані в режимі Full MS/dd-MS2 (Top5). Повні параметри MS були: роздільна здатність 70 000, цільове значення AGC 1 × 106, максимальний IT 200 мс і діапазон від 100 до 800 м/з. Налаштування dd-MS2 були: роздільна здатність 17 500, цільове значення AGC 2 × 105, максимум IT 65 мс, вікно ізоляції 1,5 m/z і NCE 35.

отримані були перевірені вручну. Дані mzXML були оброблені за допомогою Mzmine 2.53 перед завданням Feature-Based Molecular Networking (FBMN) на GNPS. Етап виявлення маси виконували за допомогою детектора маси центроїда, підтримуючи рівень шуму на рівні 5 × 1{{10}}3. Побудова хроматограми автоматизованого конвеєра аналізу даних (ADAP) була реалізована з такими налаштуваннями: мінімальний розмір групи в кількості 5 сканувань, поріг інтенсивності групи 5 × 1{{20}}³, мінімальна найвища інтенсивність 5× 10 плюс допуск до m/z 0.01 m/z або 10 ppm. Деконволюція хроматограми була досягнута за допомогою Wavelets (ADAP) як алгоритму, порогове значення S/N 3, мінімальна висота ознаки 1 × 105, порогове значення коефіцієнта/площі 5, діапазон тривалості піку 0.{{ 18}}.00 хв, а діапазон вейвлетів RT 0.00-0.05. Хроматограми були деізотоповані з використанням групового алгоритму ізотопних піків з допуском m/z 0,001 m/z або 5,0 ppm і допуском RT 0,10 хв. Роботу FBMN було виконано з використанням допуску маси вихідної речовини 0,02 Да та допуску іонів фрагмента MS4 0,02 Да. Краї були відфільтровані, щоб мати порогове значення 0,7 і мінімум 2 відповідні піки. Крім того, максимальна кількість сусідніх вузлів для кожного вузла була встановлена ​​рівною 10.

4.4. Кількісний аналіз лігнанів і тритерпенів

Для кількісного аналізу лігнанів використовували ті самі умови UPLC, що були зазначені для якісного аналізу, тоді як для аналізу тритерпенів вони були оптимізовані для розділення двох пар ізомерів, арджунолової та азіатської кислот. Аналіз проводили на класичному мас-спектрометрі Q-Exactive, як описано раніше. Розділення проводили за допомогою Phenomenex Kinetex⑧EVO C18 300 A（150×2,1 мм, розмір частинок 5 мкм）. Рухома фаза складалася з A (5 мМ водного розчину ацетату амонію, рН 9.00, відкоригованого гідроксидом амонію) і B(100 відсотків ацетонітрилу) з використанням градієнтного елюювання 17-28 відсоток B о 0-18 хв, 28-65 відсоток B о 18-22 хв, 65-75 відсоток B о 22-26хв, 75-95 відсоток о {{17 }}, 5 хв, 95 відсотків на 26,5-30 хв, 95-17 відсотків на 30-30,1 хв, 17 відсотків на 30,1-42 хв. Швидкість потоку становила 0,450 мл/хв, а об’єм ін’єкції становив 5 мкл. Як для лігнанів, так і для тритерпенів дані були отримані в режимі Full MS-SIM і PRM. Повні параметри MS-SIM були такими: роздільна здатність 70.000, цільове значення AGC 3×106, максимальна IT 200 мс і діапазон від 200 до 800 m/z для лігнанів і від 400 до 850 m/z для тритерпенів. Параметри PRM були: роздільна здатність 70.000, цільове значення AGC 2×10 градусів, максимальний IT 100 мс, вікно ізоляції 1,0 m/z і NCE 35 у випадку лігнанів і 50 у цьому тритерпенів.cistanche АвстраліяМи придбали Salvador (#{{0}}XS172930) у Biosynth Carbosynth (Staad, St. Gallen, Швейцарія), ліріодендрон (#SMB00181) та арджунолову кислоту (#SMB00119) у Sigma -Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі, США), азіатська кислота (#0027) від Extrasynthese (Genay, Lyon, Франція) і гедерагенін (#89706) від PhytoLab GmbH & Co.KG (Vestenbergsgreuth, Bayern-Mittelfranken, Німеччина). Міріантова кислота була подарунком від професора Марії Валерії Д'Аурії з Неаполітанського університету. Калібрувальні криві були отримані шляхом введення стандартних розчинів у діапазоні концентрацій 0.25-25 мкМ для лігнанів і 0.1-25 мкМ для тритерпенів. І чистий сальвадор, і ліріодендрон показали два піки LC-MSMS, ймовірно, через хімічну рівновагу, встановлену в розчині. Межа виявлення (LOD) і межа кількісного визначення (LOO) для стандартів були визначені на основі відношення сигнал/шум (S/N).

4.5. Культури клітин шкіри та експланти

Дермальні фібробласти людини (HDF) зберігали в модифікованому середовищі Ігла Дульбекко (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), доповненому 10 відсотками фетальної бичачої сироватки (FBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). ) у 95 відсотках повітря, 5 відсотках CO та зволоженій атмосфері при 37 градусах. Шкірні експланти, отримані зі шкіри здорових жінок-донорів (віком 44-47) у хірургічному центрі Villa Cinzia (Неаполь, Італія), культивували в 24-трансвеллових планшетах у DMEM/FBS плюс антибіотики на повітрі. рідинні умови при 37 градусах у зволоженому повітрі 5% CO2. Усі донори дали свою письмову інформовану згоду на використання тканин шкіри відповідно до Гельсінської декларації.

4.6. Тест на цитотоксичність

Тести на цитотоксичність базувалися на використанні сполуки МТТ [{{0}}(45-диметилтіазоліл)-2,5-дифенілтетразолій-бромід][34]. Клітини вирощували в 96-лункових планшетах у культуральному середовищі DMEM (модифіковане середовище Ігла Дульбекко), доданому 10% фетальної бичачої сироватки, протягом приблизно 8 годин. Після обробки ObHEx від 0.05% до 0,0004% (500 мкг/мл і 4 мкг/мл) протягом 48 годин клітини промивали PBS та інкубували з 100 мкл/лунку «реакційний буфер», що містить ∶ 10 мМ Hepes, 1,3 мМ CaCl2, 1 мМ MgSO, 5 мМ глюкози та 0,5 мг/мл колориметричного субстрату MTT у буфері PBS при рН 7,4. Після 3 годин інкубації при 37°C у 5% CO до кожної лунки додавали 100 мкл солюбілізуючих розчинів, що містять 10% Triton-X100, 0,1 N HCl в абсолютному ізопропанолі. Після 16 годин інкубації колориметричну реакцію вимірювали при 595 нм за допомогою пристрою для зчитування планшетів Victor3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

4.7. Аналіз експресії генів MYLK і TGF6RII в HDF

На лунку 1×10 ступінь HDF вирощували в 6-лункових планшетах у DMEM при 2 відсотках FBS, через 24 години FBS додатково розбавляли до 0.5 відсотків, і клітини обробляли 0.002% і 0,006% концентраціями ObHEx і TGF- 2.5нг/мл з подальшою інкубацією протягом 2 годин для MYLK і 48 для TGFRII. Для екстракції РНК використовувався набір «GenEluteM Total RNA Purification», придбаний компанією Merck (Дармштадт, Німеччина). Після вказаних обробок клітини промивали PBS, збирали в буфер для лізису та піддавали процедурі екстракції, як повідомлялося. Зразки обробляли ДНКазою I (Ambion, Остін, штат Техас, США) при 37 градусах протягом 30 хвилин для видалення забруднення геномної ДНК. З кожного зразка 2 мкл завантажували на 1-відсотковий агарозний гель у присутності денатуруючого завантажувального барвника з метою квантування кількості РНК щодо специфічного маркера для РНК (ThermoScientific, Waltham, MA, USA). GeneTools (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) використовували як програмне забезпечення для квантування. Далі 300 нг загальної РНК було ретро-транскрибовано за допомогою ферменту зворотної транскриптази (ThermoScientific, Waltham, MA, USA). Напівкількісну RT-PCR проводили з використанням як внутрішніх стандартів пари універсальних праймерів 18S праймер/конкурент (Ambion, Austin, TX, USA). Продукти ПЛР розділяли на 1,5% агарозному гелі, переглядали за допомогою інструменту Reliance (PerkinElmer, Waltham, MA, США) і аналізували денситометрією за допомогою програмного забезпечення Genetools. Послідовності праймерів, використаних для ампліфікації, були такими: MYLK FW: ATCAAACTGTCAAGTTCAG, MYLK Rv: AGGCACTGCGTGCAGTCCA, TGFBR2 FW: GTCACTGACAACAACGGT, TGFBR2 RV: ATGTCAGAGCGGTCATCT.

4.8. Аналіз скорочувальної здатності колагенової матриці

Щодо клітин HDF, 20× 10 ступінь ресуспендували в середовищі росту 5x DMEM (Gibco, Waltham, MA, USA) у 24-лунковому планшеті та 2 мг/ У кожну лунку додавали мл розчину колагену з бичачої шкіри (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). рН розчину доводили до 7,2. Планшет інкубували при 37°C протягом 45 хвилин, щоб забезпечити затвердіння колагенового гелю. DMEM, доповнений 10 відсотками FBS та/або ML7 25 мкМ, як інгібітор білка MYLK, був доданий пізніше. Через 16 годин ML7 очищали і додавали ObHExat у концентрації 0,002 відсотка в DMEM з 2 відсотками FBS. TGF- 2.5 нг/мл використовували як позитивний контроль. Утворений колагеновий диск негайно відокремлювали від лунки за допомогою стерильного мікрошпателя, щоб сприяти його скороченню. Площі диска кожної обробки вимірювали через 0 і 5 годин і аналізували за допомогою програмного забезпечення Image.

4.9. Аналіз ступеня полімеризації актину

Далі 1,5×10 ступінь HDF-клітин на лунку вирощували в 24-лунковому планшеті, а наступного дня в середовище додавали 2% FBS і цитохалазин B, який є інгібітором актину полімеризація, при 2 мкМ протягом 3{{1{{20}}}} хв. Через 30 хвилин до клітин додали ObHEx (0,002 відсотка та 0,006 відсотка) разом із TGF- 2.5 нг/мл, використаним як позитивний контроль, і ML7 25мкМ, як негативний контроль MYLKenzyme. Після 30 хвилин обробки клітини фіксували 4% параформальдегідом (PFA) у фосфатному буфері протягом 30 хвилин на льоду. Клітини промивали PBS і пермеабілізували розчином фосфатного буфера і Triton-X100 при 0,2% протягом 30 хв. Згодом клітини інкубували з розчином 0, 4 мкМ фалоїдину, кон’югованого з родаміном (Santa-Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) протягом 1 години в темряві.переваги cistancheУ час 0 і через 18 годин флуоресценцію вимірювали при 540/570 нм за допомогою пристрою для зчитування планшетів Victor3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). 4.10. Аналіз шляху SMAD2

Клітини HDF висівали з щільністю 3 × 103 у 96-лункові планшети та через 16 год трансфікували реагентом для трансфекції ДНК X-tremeGeneTM HP (Roche Diagnostics, Базель, Швейцарія) репортерним вектором Smad2 згідно з інструкціями виробника. Через 24 години клітини обробляли ObHEx або TGF- 2.5 нг/мл, окремо або в комбінації з ML7 25 мкМ протягом 24 годин. Наприкінці інкубації клітини промивали PBS і визначали активність люциферази за допомогою системи аналізу люциферази SteadyGlo (Promega Corporation, Медісон, штат Вісконсин, США) у Multiwell Plate Reader Victor Nivo (PerkinElmer, Waltham, MA). , США).

4.11. Аналіз синтезу проколагену I, тропоеластину та періостину

На лунку 8 × 103 HDF вирощували в 96-лункових планшетах і обробляли 0.002% ObHEx або TGF 2,5 нг/мл. Через 24 години клітини обробляли для ELISA з використанням моноклональних первинних антитіл проти проколагену типу I (sc-166572, Santa-Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), з подальшою інкубацією з вторинним антимишачим антитілом, міченим з пероксидазою (170-6516, Biorad, Hercules, CA, США). Супернатанти клітин наносили на інший планшет для виявлення тропоеластину та періостину з використанням кролячого антитіла проти тропоеластину (ab21600, Abcam, Cambridge, U або мишачого антитіла проти періостину (sc-398631, Santa-Cruz Biotechnology). , Даллас, Техас, США), з подальшою інкубацією з вторинним антитілом проти кролика, міченим пероксидазою (170-6515, Biorad, Hercules, CA, США). Колориметричну реакцію розвивали шляхом додавання 100 мкл водного розчину OPD (O-фенілендіамін), 0,35 мг/мл у 50 мМ цитратному буфері та 0,012 відсотка перекису водню (H2O2). Через 30 хвилин абсорбцію виміряли при 490 нм за допомогою багаторазового зчитувача Victor Nivo (PerkinElmer, Waltham, MA, США).

4.12. Тести Ex Vivo

Імуногістофлуоресценцію (IHF) MYLK і фосфорильованого міозину оцінювали в шкірних експлантатах {{0}}-річних донорів. Людські шкірні експланти вирізали за допомогою пункційних біопсійних кюреток діаметром 8 мм і культивували в 24-планшетах з лунками в DMEM з 10 відсотками FBS і антибіотиками. Отримані пуансони обробляли 0.002 відсотками та 0,006 відсотками ObHEx протягом 24 годин. Їх інкубували в 15% сахарозі, потім у 30% сахарозі і, нарешті, заморожували. Далі були отримані зрізи 10 мкм за допомогою кріостата CM1520 (Leica Microsystems, Wetzlar, Німеччина). Предметні скла з кріозрізами гідратували протягом 30 хвилин у PBS і поміщали в «блокуючий» розчин (6% BSA, 5% сироватки, 20 мМ MgCl, 0,2% Tween) на 1 годину. Кріозрізи інкубували з первинним кролячим антитілом проти MYLK (1:100, GeneTex, Ірвайн, Каліфорнія, США) та первинним антитілом проти фосфоміозину (1:100, LifeTechnologies, Карлсбад, Каліфорнія, США) протягом 16 годин при 4 ступінь. Предметні скла промивали PBS протягом 30 хвилин, а потім інкубували з вторинним антикролячим антитілом Alexa-Fluor 546 (1:1000; A11035 ThermoFisher, Waltham, MA, USA) протягом 1 години. Ядра фарбували DAPI(4',6-5 діамідіно-2-феніліндолом) 1 мкг/мл у PBS протягом 10 хв. Зображення були отримані за допомогою флуоресцентного мікроскопа та проаналізовані за допомогою програмного забезпечення ImageJ. Для ІГФ тропоеластину та колагену I використовували експланти шкіри 36--річних донорів. Біопсії шкіри отримували, як описано вище, і попередньо обробляли 0,002% і 0,006% ObHEx протягом 24 годин. У присутності ObHEx додавали стрес із гідрокортизоном у дозі 10 мкг/мл протягом 8 днів. Після цього біопсії заморожували, як описано вище, а зрізи інкубували з первинним антитілом до кролячого тропоеластину (1:1000 ab21600, Abcam, Кембридж, Великобританія) та анти-колагену I (1:100 C2456 Merck, Дармштадт, Німеччина) для 16:00 при 4 градусах. Слайди аналізували, як описано вище, а зображення отримували та аналізували за допомогою програмного забезпечення ImageJ.

4.13. Атомно-силова мікроскопія (АСМ) у шкірних експлантатах

Еластичність зразків шкіри, не оброблених і оброблених ObHEx, оцінювали за допомогою методу в нанометричному масштабі на основі атомно-силової мікроскопії (АСМ), розробленого не тільки для біологічних зразків, але й для неорганічних. Ці підходи базуються на припущеннях моделей Герца та розглядають зразок і кантилевер як дві пружини в серії в умовах експерименту AFM. Коротко, шкіра екс-рослини, оброблена 0.006% ObHEx, і необроблені зразки шкіри були нарізані кріостатом на шматочки товщиною 10 мкм. Зразки зберігали при 12 градусах, потім промивали PBS і досліджували при фіксованій температурі та відносній вологості 22 градуси та 55 відсотків відповідно. Кожен зразок досліджувався за допомогою NanoScope IIA AFM в одиночному режимі силової спектроскопії з використанням пірамідального наконечника (RESP-20) із постійною пружиною 0,9 Н/м. Щоб обчислити модуль Юнга, було отримано десять кривих сили в десяти різних точках поверхні одного зразка. Кожна крива сили є кривою відхилення (вольт) від переміщення (нм) і може бути перетворена в криву сили (Н) від відриву (нм). Насправді кожна крива Force повідомляє про криві завантаження та розвантаження. Вони представляють тенденцію кінчика щодо зразка: коли кінчик знаходиться далеко від зразка, коли вони стикаються, і кінчик починає відхилятися, і коли він знову віддаляється. Лише перша частина цих кривих може бути досліджена. Кожна з цих частин кривої була підібрана за допомогою стандартної моделі Герца, зокрема, типового рівняння Герце для вершини піраміди, щоб отримати модуль пружності, відомий як модуль Юнга в ГПа.

4.14. Статистичний аналіз

Усі наведені значення були середніми з трьох незалежних експериментів, кожен з яких проводився в трьох повторах. Зірочки вказують на статистичну значущість, розраховану відповідно до t-критерію: *означає значення менше або дорівнює 0.05;** значення p менше або дорівнює 0. 01;***p значення Менше або дорівнює 0,001.

Ця стаття взята з Metabolites 2021, 11, 527. https://doi.org/10.3390/metabo11080527 https://www.mdpi.com/journal/metabolites