Стратегія виявлення вроджених патогенів, що включає убіквітування поверхневих білків бактерій. Частина 2

ДИСКУСІЯ

Метазоани використовують убіквітування як універсальний механізм для підтримки цитозольного гомеостазу, запобігаючи накопиченню пошкоджених білків/органел і захищаючись від вторгнення патогенів (40, 41). Враховуючи різноманітність патогенів і різноманітні набори пошкоджених білків, які зустрічаються, ідентифікація загальних мотивів для розпізнавання субстрату та подальшого повсюдного поширення є розумною стратегією для оптимізації ресурсів. Білки в еукаріотичних клітинах, які призначені для протеолізу, зазвичай ідентифікуються тристороннім мотивом дегрону (24).

Імунітет — це здатність організму боротися з хворобами, включаючи реакцію на бактерії, віруси та інші шкідливі речовини. Якщо імунна система організму ослаблена, вона не зможе впоратися з навалою хвороби. Дослідження показали, що неправильне харчування впливає на роботу імунної системи, роблячи організм більш сприйнятливим до інфекцій і хвороб. Білок є одним з важливих речовин для підтримки імунітету.

Білки складаються з амінокислот, деякі з яких називаються незамінними амінокислотами, оскільки вони повинні надходити з їжею і не можуть бути синтезовані організмом. Ці незамінні амінокислоти включають триптофан, лейцин, фенілаланін, лізин, ізолейцин, метіонін, валін і гістидин. Якщо організм не отримує достатньо незамінних амінокислот, це може призвести до порушення білкового обміну, що може вплинути на функцію імунної системи.

Крім того, споживання високоякісного білка допомагає підтримувати нормальну імунну систему та функції організму. Коли організму не вистачає білка, це може призвести до порушення імунної системи, і організм стає більш сприйнятливим до хвороб. Якщо в організмі людини тривалий час не вистачає білка, це може призвести до тривалого пошкодження імунної системи, що робить людей сприйнятливими до різних захворювань.

Тому збалансоване харчування та правильні фізичні вправи є ключем до підтримки споживання білка. Люди можуть задовольнити потреби свого організму в білках, споживаючи більше продуктів, багатих білками, таких як м’ясо, птиця, риба, боби, яйця, молочні продукти, зернові, горіхи та насіння. Крім того, помірні фізичні вправи також можуть збільшити потребу організму в білку та ефективність засвоєння. Збалансоване та різноманітне харчування та здоровий спосіб життя є запорукою підтримки імунітету, збереження організму здоровим та стабільним, а також опору вторгненню хвороб. З цієї точки зору нам необхідно підвищувати свій імунітет. Цистанхе може значно підвищити імунітет, оскільки полісахариди в м’ясі можуть регулювати імунну відповідь імунної системи людини, покращувати здатність імунних клітин до стресу та підвищувати імунітет імунних клітин. Бактерицидний ефект.

Натисніть добавку Cistanche deserticola

Це спонукало нас дослідити, чи можна знайти подібні мотиви на поверхнях патогенів, де вони можуть функціонувати як проксі для розпізнавання субстрату. Тут ми демонструємо, що убіквітин-лігази господаря використовують подібні молекулярні сигнатури для визначення філогенетично відмінних патогенів. Розпізнавання патогенів за допомогою загальних молекулярних шаблонів/мотивів (PAMP) є добре охарактеризованою особливістю вродженого імунітету (42). Наші результати свідчать про те, що дегроноподібні послідовності в поверхневих білках бактерій діють еквівалентно PAMP, щоб забезпечити внутрішньоклітинний нагляд за патогенами. Цей операнд модусу може бути додатково використаний хазяїном для презентації мікробних білкових антигенів на основному комплексі гістосумісності I, щоб індукувати сильну відповідь CD8, спрямовану проти внутрішньоклітинних патогенів.

Потенційна важливість опосередкованого убіквітином виявлення патогенів для захисту хазяїна додатково підкреслюється значним залишковим убіквітуванням, виявленим у мутантних SPN, у яких відсутні як BgaA, так і PspA. Це вказує на те, що існують інші, неідентифіковані субстрати механізму убіквітину, внаслідок чого надлишковість забезпечує надійне перехоплення патогенів. Примітно, що деякі безпосередні запитання щодо мотиву дегрону та його важливості для бактерій (окрім того, що вони є впізнаваною одиницею) дають цікавий еволюційний кут.

Мотив дегрону неможливий in vivo, і якщо що-небудь, мутація або видалення мотиву покращує внутрішньоклітинну стійкість, що призводить до підвищення вірулентності. Це підтверджується нашими результатами, що мутація в мотиві дегрону може бути використана патогенами, щоб уникнути опосередкованого убіквітином розпізнавання, як це видно для SPN серотипу 19F. Проте збережена природа мотиву дегрону в BgaA в більшості серотипів SPN може свідчити про контрстратегію, прийняту бактеріями, щоб бути менш летальною для господаря.

Це може надати патогену можливість розширити свої ареали існування. Водночас убіквітування бактеріальної поверхні або секретованих білків у мотиві дегрону може функціонально модулювати їх, щоб пом’якшити або змінити реакцію хазяїна для кінцевої користі (43). Таким чином, наявність або відсутність еукаріотичних функціональних доменів або мотивів (таких як дегрони) може залежати від патогенної ніші та адаптуватися для уникнення або модулювання імунних відповідей господаря.

Подібний механізм сприйняття патогенів, що включає білки, що зв’язують гуанілат, також бере участь у кліренсі бактерій; однак, на відміну від убіквітування, їх роль, як повідомляється, обмежена грамнегативними патогенами (44–47). Убіквітування спрямоване на патоген незалежно від походження за Грамом, наприклад, було задокументовано, що RNF213 спрямований на Listeria spp. незалежно від відсутності ЛПС (48). Таким чином, ми не виключаємо можливості його антимікробної дії проти SPN.

Патогенна поверхня може бути убіквітована кількома типами ланцюгів за допомогою різних лігаз E3 із взаємодією між ланцюгами (41). Зокрема, у випадку Mtb, було доведено, що Smurf1 і Parkin утворюють типи ланцюгів K48 і K63, які функціонують синергічно для розкладання патогена (12). Розуміння механістичної ролі убіквітування K48 і лігаз E3, залучених під час сценаріїв інфікування, все ще недостатньо вивчено. У випадку STm було показано, що одна лігаза E3 ARIH1 націлена на цитозольний STm з ланцюгами убіквітину K48, що призводить до їх елімінації із системи (15). Згідно з нашими та іншими висновками, патогени, мічені K48-Ub, врешті-решт розкладаються, будучи пов’язаними з протеасомним механізмом.

Однак це дослідження показує K48-Ub декорування специфічних бактеріальних поверхневих білків. Відомо, що деякі патогени активно модифікують свої поверхневі білки, захищаючи їх від убіквітинування та подальшого знищення, таким чином підкреслюючи важливість поверхневої локалізації убіквітинового субстрату (10). Крім того, численні облігатні внутрішньоклітинні патогени розробили стратегії де-убіквітінації або розміщення регуляторних компонентів, щоб уникнути опосередкованого убіквітином очищення (5). Разом ці результати підкреслюють важливість тривожного збудження, опосередкованого убіквітином, як основного внутрішньоклітинного механізму сприйняття патогенів, який є центральним для захисту господаря.

Наше дослідження також продемонструвало центральну роль лігази SCF E3, особливо з FBXW7, у бактеріальному убіквітуванні, що посилює деградацію патогенів. Гетерозиготні мутації у FBXW7, зокрема варіант R505C (критичний залишок у кишені розпізнавання субстрату), викликають множинні карциноми та лімфолейкоз у людей (49, 50). Недавнє когортне дослідження показало, що майже 43 відсотки пацієнтів з хронічним лімфолейкозом (ХЛЛ) піддаються бактеріальній пневмонії та сепсису, а потім грибкові інфекції (51).

Це підтверджує наше спостереження про скасовану здатність клітин-господарів, що несуть мутацію FBXW7, відчувати та знищувати патогени. Отже, наші висновки дають несподіване молекулярне пояснення підвищеного ризику інфекцій у пацієнтів із ХЛЛ. Зв'язок між генетичним поліморфізмом генів E3-лігаз і сприйнятливістю до бактеріальних інфекцій також підтверджується пацієнтами з хворобою Паркінсона, які вразливі до черевного тифу або прокази (14), що свідчить про значний внесок E3-лігаз в імунітет господаря проти бактеріальних інфекцій і підтримку. клітинного стаціонарного стану.

На завершення ми розшифрували універсальну мову сприйняття патогенів, що живуть у цитозолі, яку господар може ефективно застосовувати для розпізнавання мікроорганізмів для подальшого усунення. У сукупності ці відкриття проливають світло на розуміння рудиментарних клітинних імунних процесів, які можна використовувати для посилення антибактеріального імунітету.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Культура клітин

Обидві лінії клітин альвеолярної карциноми легенів людини (пневмоцити типу II) A549 [Американська колекція типових культур (ATCC) №. CCL185)] та лінію клітин аденокарциноми шийки матки HeLa (ATCC № CRM-CCL-2) культивували в середовищі Ігла, модифікованому Дульбекко (DMEM; HiMedia), доповненому 10-відсотковою фетальною бичачою сироваткою (Gibco) при 37 градусах і 5 відсоток CO2.

Штами бактерій та умови зростання

SPN (R6, серотип 2, подарунок від Тіма Дж. Мітчелла, Університет Бірмінгема, Сполучене Королівство) вирощували в бульйоні Тодда-Хьюітта з додаванням 1,5-відсоткового дріжджового екстракту при 37 градусах у 5-відсотковому CO2. За потреби для вирощування культур SPN використовували такі антибіотики: канаміцин (200 мкг/мл), спектиноміцин (100 мкг/мл) і хлорамфенікол (4,5 мкг/мл). Дев'ятсот мікролітрів 0,4 OD600 (оптична густина при 600 нм) вирощеної культури SPN змішували з 600 мкл 80-відсоткового стерильного гліцерину (32-відсоткова кінцева концентрація гліцерину) і зберігали в морозильній камері при температурі -80 градусів. Ці запаси гліцерину використовували як початковий інокулят для всіх експериментів.

Культури Escherichia coli DH5 та STm (ATCC 14028) вирощували в бульйоні Лурії-Бертані (LB) при 37 градусах в умовах струшування (200 об/хв), і за необхідності використовували наступні антибіотики: канаміцин (50 мкг/мл), спектиноміцин (100 мкг/мл), хлорамфенікол (20 мкг/мл) та ампіцилін (100 мкг/мл). Для всіх аналізів на інфекцію бактерії вирощували до OD600 ~0,4 з подальшим ресуспендуванням у фосфатно-сольовому буфері (PBS) до подібної щільності перед зараженням клітин господаря.

Скринінг передбачуваних цільових білків убіквітину

Усі поверхневі білки, присутні в протеомі STm і SPN, були вперше ідентифіковані з опублікованої літератури. Повні білкові послідовності поверхневих білків були отримані з UniProt, які потім використовувалися для ідентифікації присутності мотивів дегрону. Набір із 29 передбачуваних мотивів дегрону було підібрано з опублікованої літератури (24, 52, 53) та бази даних Eukaryotic Linear Motif. Модуль регулярних виразів Python використовувався для визначення розташування всіх таких підібраних мотивів у послідовностях поверхневих білків. Далі проводився лінійний пошук, щоб ідентифікувати присутність залишку лізину поблизу (від 8 до 14 амінокислотних залишків) до кожного ідентифікованого мотиву дегрону. Вважається, що цей залишок лізину діє як місце приєднання для фрагмента убіквітину. Нарешті, білкові послідовності короткого списку були подані в IUPred (54), інструмент прогнозування структури білка, щоб визначити наявність невпорядкованої області між мотивом дегрону та проксимальним лізином. Отримані білки (BgaA і PspA для SPN і RlpA для STm) були відібрані для оцінки як мішеней убіквітування та розшифровки їхньої ролі в очищенні патогенів.

Побудова штаму бактерій

Алельний обмін шляхом гомологічної рекомбінації проводили з використанням фланкуючих ділянок гена, що несуть вставлену антибіотичну касету для генерації мутантних штамів як у SPN, так і в STm (таблиця S2).

Для SPN, 500-bp вище та нижче за течією області bgaA, pspA та його генів було ампліфіковано з геному за допомогою відповідних праймерів (таблиця S3) та зібрано у вектор pBKS. Після клонування цих фрагментів у цю конструкцію вставили касету стійкості до антибіотиків (спектиноміцин для bag, а також pspA та хлорамфенікол для hysA). Потім лінеаризовані рекомбінантні плазміди трансформували в WT SPN за допомогою пептиду 1, що стимулює компетентність (GenPro Biotech), рекомбінанти відбирали за допомогою відповідних антибіотиків, а заміну гена підтверджували полімеразною ланцюговою реакцією (ПЛР) і секвенуванням відповідних генних локусів. Для STm метод λ-червоної рекомбінази використовувався для генерації мутантів з делецією гена (55).

Коротко кажучи, послідовності, гомологічні кінцям гена rope, були додані в послідовності праймерів, які використовуються для ампліфікації касети стійкості до канаміцину. Потім касету електропорували в штам WT STm, і нокаути, створені гомологічною рекомбінацією, відбирали на основі стійкості до канаміцину. Делецію гена було підтверджено за допомогою ПЛР та секвенування локусу гена. Повнорозмірний pspA, hysA та усічений bgaA-T (від 1 до 3168 bp) клонували під промотор P23 у човниковому векторі pIB166 (56) і використовували для комплементації.

These recombinant plasmids were also used for site-directed mutagenesis to generate different variants of bgaA-T (bgaA-TK96R, bgaA-TK97R, bgaA-TK96R, K97R, and bgaATΔDegron), pspA (pspAK314R, pspAK315R, pspAK314R, K315R, and pspAΔDegron ), і його (hysADegron-BgaA і hysADegron-PspA) з використанням відповідних наборів праймерів (таблиця S3) і трансформовані в мутанти ΔbgaA і ΔpspA. Усі клони були перевірені секвенуванням ДНК. Експресію різних варіантів BgaA, PspA та HysA було підтверджено вестерн-блоттингом з використанням відповідних антитіл.

Антитіла та реагенти

Анти-енолазна та анти-PspA сироватка (S. Hammerschmidt, University of Greifswald, Німеччина); анти-BgaA сироватка (S. King, The Ohio State University, США); та антитіла, специфічні для His6 (Invitrogen, MA1-21315), зв’язку K48-Ub (Millipore, 05-1307), зв’язку K63-Ub (Millipore, 14-6077-80 ), Ply (Santa Cruz Biotechnology, sc-80500), FBXW7 (Bethyl Laboratories, A301-721A), SKP1 (Invitrogen, MA5-15928), Cullin1 (Invitrogen, {{15} }), гліцеральдегідфосфатдегідрогеназа (Millipore, MAB374), GSK3 [Cell Signaling Technology (CST), D5C5Z], фосфотреонін (CST, 9381S), IgA, каппа з мишачої мієломи, клон TEPC-15 (Sigma-Aldrich, M1421) та PSMB7 (Invitrogen, Пенсильванія5-111404). Були використані наступні вторинні антитіла: пероксидаза хрону (HRP) – анти-кролячі (BioLegend, 406401), HRP-мічені анти-мишачі (BioLegend 405306), анти-кролячі Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A27206), анти-кролячі Alexa Fluor 555 (Invitrogen, A31572), біотин-кон’югований антимишачий імуноглобулін А (Life Technologies, M31115), антимишачий Alexa Fluor (Invitrogen, A31570), антимишачий Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A21202), антикозячий Alexa Fluor 633 (Invitrogen, A21082) і FM4-64 (Thermo Fisher Scientific, T13320).

Експресія та очищення білка

BgaA-T та його варіанти клонували в pET28 з використанням сайтів рестрикції Xba I/Not I. Рекомбінантні плазміди, що кодують BgaA-T з N-кінцевою His-міткою, трансформували в клітини E. coli BL21 (DE3) для експресії білка. Свіжотрансформовані колонії вирощували в LB, що містить канаміцин (50 мкг/мл) при 37 градусах на шейкері-інкубаторі протягом 12 годин. Один відсоток первинної культури додавали до 1 літру бульйону LB та інкубували при 37 градусах на шейкері-інкубаторі, доки OD600 нм не досягне значення між 0,6 і 0,8. Експресію білка індукували додаванням 100 мкМ ізопропіл- -D-тіогалактопіранозиду (IPTG) і подальшим вирощуванням культури при 37 градусах протягом 5–6 годин із перемішуванням при 150 об/хв.

Клітини збирали центрифугуванням при 6000 об/хв протягом 10 хвилин при 4 градусах. Осад клітин ресуспендували в буфері А [25 мМ трис (pH 8,0) і 300 мМ NaCl] і лізували ультразвуком. Клітинний дебрис відокремлювали центрифугуванням (14,000 об/хв, 50 хв, 4 градуси), і супернатант наносили на колонку Ni-NTA, врівноважену буфером А. Колонку промивали 10 об’ємами колонки буфера A та білки, мічені His, елюювали імідазолом (250 мМ) у буфері A. Усі варіанти BgaA-T експресували та очищали за допомогою тієї ж процедури. FBXW7 було субклоновано у векторі pGEX-4 T-1, що має N-кінцеву глутатіон-S-трансферазу (GST) з вектора pCMV6-Entry-FBXW7, використовуючи фермент рестрикції Eco RI.

GST-мічений FBXW7 експресувався в клітинах E. coli BL21 (DE3) після індукції експресії білка за допомогою 0.1 мМ IPTG і росту при 30 градусах протягом 4 годин. GST-FBXW7 з неочищеного екстракту E. coli очищали за допомогою колонкової хроматографії на глутатіон-сефарозі (GE HealthCare). Фракції, що містять очищені білки, об’єднували та концентрували до 0,5 мг/мл, використовуючи 10-kDa фільтр відсікання за молекулярною масою (Amicon) центрифугуванням при 4700 об/хв при 4°. Чистоту білків перевіряли за допомогою електрофорезу в SDS-поліакриламідному гелі (SDS-PAGE) з подальшим фарбуванням кумасси синім.

Трансфекції клітин-господарів

BgaA-T клонували в доксициклін-індукований вектор pAK_Tol2_TRE_Blast (Addgene № 130261) за допомогою набору для інфузійного клонування (Takara). Позитивний клон був підтверджений секвенуванням Сенгера. Мутація FBXW7R505C була проведена шляхом сайт-спрямованого мутагенезу з використанням pMRX-GFP-FBXW7 як матриці та підтверджена секвенуванням Сенгера. Усі трансфекції проводили з використанням реагенту Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific), а відбір проводили в присутності бластицидину гідрохлориду (2 мкг/мл; HiMedia).

нокдаун гена, скерований siRNA

Для опосередкованого РНК-інтерференцією нокдауну специфічних генів використовувалися такі siRNA: siFBW7 (Dharmacon ON-TARGET SMARTpool L-004246-00-0005), siCullin1 (Qiagen, 1027423), siSKP1 (Qiagen, SI00301819) і siGSK3 (Dharmacon ONTARGET SMARTpool L-003010-00-0005). Коротко, клітини A549, вирощені в 24-планшеті з лунками, тимчасово трансфікували ген-специфічними siRNAs або scramble (siControl) (150 пмоль) з використанням Lipofectamine 3000 згідно з інструкціями виробника. Через тридцять шість годин після трансфекції клітини обробляли для вестерн-блоттингу та імунофлуоресценції або аналізів захисту від пеніцилін-гентаміцину.

Прогнозування та моделювання структури

Усі структури були передбачені AlphaFold (механізм розпізнавання гомології/аналогії білка V 2.0) (57) та візуалізовані за допомогою PyMOL (система молекулярної графіки PyMOL, версія 2.0 Schrödinger, LLC). Структури були позначені кольором у PyMol на основі балів IUPred (54) у діапазоні від упорядкованого (синій) до невпорядкованого (червоний) і білого.

Вестерн-блот

Культури SPN, вирощені до {{0}}.4 OD600nm, лізували ультразвуком, а неочищені екстракти збирали після центрифугування (15,000 об/хв, 30 хв, 4 градуси). Для A549 моношари кілька разів промивали PBS і лізували в крижаному буфері для радіоімунопреципітації (RIPA) [50 мМ трис-Cl (рН 7,89), 150 мМ NaCl, 1 відсоток Triton X-100, 0,5 відсотка натрію деоксихолат і 1 відсоток SDS], що містить суміш інгібіторів протеази (Promega), фторид натрію (10 мМ) і EDTA (5 мМ). Клітинну суспензію короткочасно обробили ультразвуком і центрифугували для збору клітинних лізатів. Білки, присутні в бактеріальних або клітинних лізатах A549 (10 або 20 мкг), були розділені на 12% SDS-PAGE гелях і перенесені на активовану полівінілідендифторидну мембрану. Після блокування в 5-відсотковому знежиреному молоці мембрани досліджували відповідними первинними та вторинними антитілами, позначеними HRP. Нарешті блоти були виявлені з використанням підкладки з покращеною хемілюмінесценцією (Bio-Rad).
Пеніцилін-гентаміциновий захист

Штами SPN, вирощені до OD600нм 0.4 у бульйоні Тодда-Хьюїта з додаванням 0.2% дріжджового екстракту (THY), були осаджені, ресуспендовані в PBS ( pH 7,4) і розбавляли в досліджуваному середовищі для інфікування моношарів A549 з множинністю інфікування (MOI) 10. Через 1 годину інфікування моношари промивали DMEM та інкубували в досліджуваному середовищі, що містить пеніцилін (10 мкг/мл). ) і гентаміцин (400 мкг/мл) протягом 2 годин, щоб знищити позаклітинний SPN. Потім клітини лізували 0,025% Triton X-100, і лізат висівали на чашки з агаром Brain Heart Infusion для підрахунку життєздатних SPN. Відсоток інвазії розраховували як [колонієутворюючі одиниці (КУО) в лізаті/КУО, використані для інфікування] × 100. Для оцінки внутрішньоклітинного виживання через 9 годин після інфікування (від початку лікування пеніциліном-гентаміцином) лізати клітин готували як згадано вище, і були перераховані бактерії, що розповсюдилися, і вижилі бактерії. Ефективність виживання (у відсотках) була представлена ​​як кратна зміна відсотка виживаності відносно контролю в зазначений момент часу (нормований до 0 годин).

Імунофлюоресценція

Для імунофлюоресцентного аналізу клітини A549 або HeLa вирощували на скляних покривних скельцях і інфікували штамами SPN або STm при MOI ~25 протягом 1 години з наступною обробкою антибіотиками протягом 2 годин. У бажані моменти часу після зараження (9 годин для інфекції SPN в A549s і 3 години для інфекції STm в HeLa) клітини промивали DMEM і фіксували охолодженим льодом метанолом при -20 градусах протягом 10 хвилин. Крім того, покривні скла блокували 3% бичачим сироватковим альбуміном (BSA) у PBS протягом 2 годин при кімнатній температурі (RT). Потім клітини обробляли відповідним первинним антитілом в 1% BSA в PBS протягом ночі при 4°C, промивали PBS та інкубували з відповідним вторинним антитілом в 1% BSA в PBS протягом 1 години при кімнатній температурі. Нарешті, покривні скельця промивали PBS і встановлювали на предметні скла разом із VECTASHIELD з 4′,6-діамідіно-2-феніліндолом або без нього (Vector Laboratories) для візуалізації за допомогою лазерного скануючого конфокального мікроскопа (LSM 780, Carl Zeiss). ) під масляними об’єктивами 40× або 63×. Зображення були отримані після оптичного розрізу, а потім оброблені за допомогою програмного забезпечення ZEN lite (версія 5.0). Мікроскопію з надвисокою роздільною здатністю проводили аналогічно за допомогою Elyra 7 (Carl Zeiss) у режимі SIM. Для аналізу колокалізації бактерії оцінювали шляхом візуального підрахунку n > 100 бактерій на повторність.

Просвічуюча електронна мікроскопія

Після зараження SPN і STm клітини промивали {{0}}.1 М натрій-какодилатним буфером, фіксованим 2,5% глутаровим альдегідом (Sigma-Aldrich) у 0.1 М натрій-какодилатному буфері ( Sigma-Aldrich) протягом 3 годин при 4 градусах. Після фіксації клітини збирали через клітинний скребок і осаджували при 2000 об/хв протягом 10 хв. Потім клітини промивали 0,1 М натрій какодилатним буфером і постфіксували 1% чотириокисом осмію в 0,1 М натрій какодилатному буфері протягом 20 хвилин при 4 градусах. Після наступних промивань какодилатним буфером і дистильованою водою клітини зневоднювали у зростаючих концентраціях етанолу (50, 70, 95 і 100 відсотків) і пропіленоксиду протягом 30 хвилин і, нарешті, заливали в епоксидну смолу (Electron Microscopy Sciences, 14300) за допомогою полімеризація при 75 градусах протягом 45 хв. Згодом капсули переносили в духовку при 95 градусах на 45 хвилин. Ультратонкі зрізи (70 нм) вирізали алмазним ножем на ультрамікротомі Leica EM UC7 і пофарбували 2 відсотками уранілацетату та 1 відсотком цитрату свинцю та переглядали за допомогою трансмісійного електронного мікроскопа (Talos L120 C, Thermo Fisher Scientific) при 120 кВ.

Убіквітування ex vivo

BgaA-T, що експресує A549-, та його варіанти обробляли MG132 (5 мкМ), а експресію білка індукували доксицикліном (100 мкг/мл) протягом 24 годин. Потім клітини лізували в буфері RIPA, а зразки піддавали електрофорезу за допомогою SDS-PAGE (8 відсотків). Підтвердження експресії білка та убіквітування BgaA-T та його варіантів було доведено Вестерн-блоттингом після зондування антитілами проти BgaA та анти-K48-Ub відповідно.

Убіквітування in vitro

Для аналізів убіквітування in vitro рекомбінантні білки очищали, як описано раніше (58). Лігазний комплекс SCFFBW7 E3 інкубували з рекомбінантним 0.1 мМ E1 (UBE1; Boston Biochem), 0.25 мМ E2 (cdc34; Boston Biochem) та убіквітином (2,5 мкг/мл; Boston Biochem) у присутності очищеного BgaA-T та його варіантів. Реакції убіквітилювання проводили в буфері для аналізу [50 мМ трис (рН 8), 5 мМ MgCl2, 5 мМ аденозинтрифосфату (АТФ), 1 мМ -меркаптоетанолу та 0,1 відсотка Твіну 20] протягом 2 годин при 25 градусах . Реакції зупиняли 5× буфером Леммлі, розділяли на SDS-PAGE гелі та аналізували імуноблоттингом з використанням антитіл проти BgaA.

Тест кінази in vitro

Для проведення аналізу кінази in vitro використовували ферментну систему кінази GSK3 (Promega) згідно з протоколом виробника з наступними модифікаціями. Коротко, 3 мкг рекомбінантного BgaA-T було додано до 0.5 мкг активного GSK3 з 400 мкМ АТФ у реакційному буфері, що складається з 40 мМ трис (pH 7,5), 20 мМ MgCl2 , BSA (0,1 мг/мл) і 50 мкМ дитіотреїтолу. Реакцію інкубували протягом 2 годин при 30 градусах і зупиняли додаванням 1 × буфера Леммлі. Потім зразки кип’ятили та піддавали електрофорезу для Вестерн-блоттингу, як згадувалося раніше. Фосфорильований BgaA-T був виявлений за допомогою антитіл проти фосфотреоніну.

Модель in vivo

All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >20 відсотків початкової маси тіла та виражені виділення з носа чи очей. Зразки крові отримували шляхом пункції серця під термінальною анестезією, а селезінки вирізали посмертно для підрахунку бактерій. Зразки тканини обробляли за допомогою ручного гомогенізатора тканин, а гомогенати послідовно розводили в PBS перед нанесенням на чашки з кров’яним агаром. Планшети інкубували протягом ночі при 37°C, 5% CO2, а наступного дня оцінювали кількість бактеріальних колоній.

Статистичний аналіз

Для статистичного аналізу використовувався GraphPad Prism версії 5. Статистичні тести, проведені для окремих експериментів, згадуються у відповідних легендах до малюнків. P < 0.05 вважалося статистично значущим. Дані перевіряли на нормальність і для визначення дисперсії кожної досліджуваної групи. Усі багатопараметричні аналізи включали поправки для кількох порівнянь, і дані представлені як середні значення ± SD, якщо не вказано інше.

ЛІТЕРАТУРА ТА ПРИМІТКИ

ME Bianchi, DAMPs, PAMPs і alarmins: все, що нам потрібно знати про небезпеку. Я. Левок. Biol. 81, 1–5 (2007).

2. Т. Х. Могенсен, Розпізнавання патогенів і сигналізація запалення у вродженому імунному захисті. Clin. мікробіол. 22, 240–273 (2009).

3. K. Ray, B. Marteyn, PJ Sansonetti, CM Tang, Життя всередині: внутрішньоклітинний спосіб життя цитозольних бактерій. Нац. Rev. Microbiol. 7, 333–340 (2009).

4. X. Jiang, ZJ Chen, Роль убіквитиляції в імунному захисті та уникненні патогенів. Нац. Rev. Immunol. 12, 35–48 (2011).

5. В. Возандичова, П. Стойкова, К. Герцик, П. Регулка, Дж. Стулік, Система убіквітування у взаємодії бактерій-господар-патоген. Мікроорганізми 9, 638 (2021).

6. E. Fiskin, T. Bionda, I. Dikic, C. Behrends, Глобальний аналіз хазяїна та бактеріального убіквітиному у відповідь на інфекцію Salmonella typhimurium. мол. Cell 62, 967–981 (2016).

7. Q. Chai, X. Wang, L. Qiang, Y. Zhang, P. Ge, Z. Lu, Y. Zhong, B. Li, J. Wang, L. Zhang, D. Zhou, W. Li, W. Dong, Y. Pang, GF Gao, CH Liu, Поверхневий білок мікобактерії туберкульозу рекрутує убіквітин, щоб викликати ксенофагію господаря. Нац. Комун. 10, 1973 (2019).

8. EG Otten, E. Werner, A. Crespillo-Casado, KB Boyle, V. Dharamdasani, C. Pathe, B. Santhanam, F. Randow, Убіквітилація ліпополісахариду RNF213 під час бактеріальної інфекції. Nature 594, 111–116 (2021).

9. А. Ямада, М. Хікічі, Т. Нозава, І. Накагава, убіквітинлігазний комплекс FBXO2/SCF керує ксенофагією через розпізнавання поверхневого глікану бактерії. EMBO Rep. 22, e52584 (2021).

10. P. Engstrom, TP Burke, CJ Tran, AT Iavarone, MD Welch, Метилювання лізину захищає внутрішньоклітинний патоген від убіквітиляції та аутофагії. Sci. Adv. 7, eabg2517 (2021).

11. Дж. Челлі, LRSAM1, убіквітин-лігаза E3 зі чутливістю до бактерій. Cell Host Microbe 12, 735–736 (2012).

12. LH Franco, VR Nair, CR Scharn, RJ Xavier, JR Torrealba, MU Shiloh, B. Levine, Убіквітинлігаза Smurf1 бере участь у селективній аутофагії мікобактерій туберкульозу та протитуберкульозному захисті господаря. Cell Host Microbe 21, 59–72 (2017).

13. J. Noad, A. von der Malsburg, C. Pathe, MA Michel, D. Komander, F. Randow, LUBAC, синтезовані лінійні ланцюги убіквітину, обмежують бактерії, що вторгаються в цитозоль, шляхом активації аутофагії та NF-κB. Нац. мікробіол. 2, 17063 (2017).

14. PS Manzanillo, JS Ayres, RO Watson, AC Collins, G. Souza, CS Rae, DS Schneider, K. Nakamura, MU Shiloh, JS Cox, убіквітинлігаза паркін опосередковує стійкість до внутрішньоклітинних патогенів. Nature 501, 512–516 (2013).

15. M. Polajnar, MS Dietz, M. Heilemann, C. Behrends, Expanding the host cell ubiquitylation machinery targeting cytosolic Salmonella. EMBO Rep. 18, 1572–1585 (2017).

For more information:1950477648nn@gmail.com