Сприятливий/несприятливий вплив кверцетину на мембрани клітин нейробластоми SK-N-SH Частина 2

Будь ласка, натиснітьoscar.xiao@wecistanche.comдля отримання додаткової інформації

2.2.2. Антиоксидантна активність кверцетину

Щоб перевірити ефективність кверцетину в захисті мембран від окисного стресу, були проведені експерименти, в яких ліпідні моделі мембрани піддавали впливу озону за відсутності (рис. 4a) і в присутності кверцетину в концентрації 6,25 мкМ (рис. 4b).

Під впливом озону змінюється хід обох залежностей, тобто π{{0}}f(A) і Cs-1=f(rn). Отримані ізотерми розповсюдження моношару на озоновмісну підфазу характеризуються меншим нахилом та зсувом у бік менших значень А. Крім того, значення Cs-1 зменшилися під впливом озону. Ці зміни були найбільшими при концентрації озону приблизно 0,4 ppm.сінтанчеПодальше збільшення концентрації озону не призвело до збільшення змін характеристик моношару (вставка на малюнку 4а).

Рисунок 4. Ізотерми поверхневого тиску та відповідний модуль стисливості (вставка) ліпідної моделі шарів нейробластоми, поширених на підфазі, містили вказані концентрації озону, розчиненого в буфері. Ізотерми: (a) за відсутності антиоксидантів; (b) за наявності кверцетину (6,25 мкМ), доданого до озоновмісного буфера.

При введенні в субфазу кверцетину в концентрації 6,25 мкМ озон істотно не впливав на хід ізотерми r(A); однак значення модуля стиснення змінювалися у присутності озону так само, як і у випадку відсутності кверцетину (вставка на рис. 4б).

Натисніть тут, щоб дізнатися більше

Числові значення параметрів, що характеризують моношари, визначені за отриманими ізотермами, наведені в табл. 3.

Таблиця 3. Параметри поверхні моношарів Alim і Cs-I, розраховані для моношарів моделі розповсюдження мембрани нейробластоми на субфазі, містили вказані концентрації озону, розчиненого в буфері за відсутності та в присутності кверцетину (6,25 мкМ). Дані являють собою середнє значення трьох експериментів ± SD. Різні літери вказують на значні відмінності (p Менше або дорівнює 0.05).

У присутності озону спостерігається незначне зменшення площі поверхні на молекулу (Alim) у щільно упакованому моношарі. Максимальне зниження цього параметра становить 3,2 відсотка порівняно з контролем (моношар на чистому буфері). Параметр Cs-I також знижується, досягаючи значень плато при концентраціях озону вище 0.6 ppm O. Максимальне зниження цього параметра досягає 24 відсотків по відношенню до контролю.

Коли кверцетин у концентрації 6,25 мкМ присутній у субфазі, значення Alim (1-2 відсотків) трохи зменшуються, тоді як зниження значення Cs-1 становить приблизно 27 відсотків.

Характер змін Аліму в присутності озону та озону в поєднанні з кверцетином має різний характер. При концентрації озону приблизно 0,3 ppm, за відсутності кверцетину, Aim різко знижується приблизно до 88,3 A2. Потім він досягає мінімального значення плато, що дає характерну S-подібну залежність (рис. 5а, червоні точки). У присутності кверцетину спостерігається легке плавне монотонне зниження Alim, досягаючи вищої концентрації озону на плато приблизно 93,5 A2 (рис. 5а, зелені точки).

Рисунок 5. Залежність площі на молекулу від концентрації озону (а) і залежність модуля стиснення від концентрації озону (б) для мембрани нейробластоми на субфазі: Без кверцетин-червоних точок; з кверцетиново-зеленими точками. Лінії не представляють жодної фізичної моделі, були математично підігнані та намальовані для зручності відстеження змін параметрів. Значення максимального модуля стиснення шару змінюються однаково залежно від концентрації озону для обох: за відсутності та присутності кверцетину (рис. 5b).

3. Обговорення

Механізм дії кверцетину інтенсивно вивчається протягом багатьох років, але результати експериментів часто суперечливі і вказують на те, що в одних обставинах це з'єднання приносить користь, а в інших - несприятливо для клітин. Аналіз наявних досліджень показує, що дія цієї сполуки на клітини пов’язана з двома аспектами – взаємодією з мембранами та антиоксидантною активністю. Однак у клітинах неможливо розрізнити ці два способи дії кверцетину та оцінити придатність цієї сполуки як потенційної речовини, наприклад, що має протипухлинну дію. З цієї причини експерименти були сплановані таким чином, щоб якісно та кількісно оцінити вплив цієї сполуки на механічні властивості мембран, а також її антиоксидантну активність у модельній системі, яка усуває ефекти активність інших метаболічних шляхів.

На підставі проведених експериментів було підтверджено, що навіть при найнижчих концентраціях (6,25 мкМ) кверцетин модифікує (на що вказує збільшення Alimvalue) модельні моношари, імітуючи ліпідну частину мембрани клітин нейробластоми. Це вказує на можливість взаємодії кверцетину з мембранами цих клітин при досягненні мозку навіть у низьких концентраціях. Це особливо важливо для нервових клітин, мембрани яких містять відносно велику кількість ліпідів.

Цистанхе може підвищити імунітет

Приблизне співвідношення ліпідів і білків для нервових клітин становить 80:20 відсотків, а, наприклад, для мембрани еритроцитів це співвідношення становить 50:50 відсотків [29]. Такий рівень ліпідів у мембрані нервових клітин пов’язаний із роллю цих клітин у передачі електричних сигналів. У той же час навіть незначні зміни фізико-хімічних властивостей, таких як гнучкість і жорсткість клітинної мембрани, можуть істотно порушити цю функцію.

Потенціал дії передається по мембрані нервової клітини завдяки роботі іонних каналів, а потім, завдяки дії іонних насосів, відновлюється потенціал спокою. Правильне функціонування цих білків (зокрема, визначається їх формою) тісно залежить від ліпідного середовища. Крім того, зміни в механічних властивостях мембрани можуть порушити роботу каналів, механізм лініювання яких залежить саме від механічних властивостей мембрани.

Ці тези підтверджуються дослідженнями, які показали, що вплив кверцетину на клітинну мембрану пов’язаний, серед іншого, з транспортом іонів Са2 плюс та/або метаболізмом Са2 плюс [30,31]. Таким чином, введення молекул кверцетину в середовище мембрани (особливо нервових клітин) може мати значні наслідки для їх функціонування.

Щоб перевірити, чи діє кверцетин, визначене в модельних системах, відіграє корисну чи несприятливу роль у клітинах, результати, отримані для модельних мембран, порівнювали з ефектом цієї сполуки на цілі клітини нейробластоми. Для клітин SK-N-SH було проведено тест МТТ,Екстракт цистанчі проти хвороби Альцгеймеранадання інформації про життєздатність клітин, яка, у свою чергу, прямо пропорційна ферментам мітохондріальної дегідрогенази.

Отримані результати показали, що присутність кверцетину в концентраціях 100 і 200 мкМ збільшує кількість життєздатних клітин. Подібні результати були отримані Bao et al. [32], досліджуючи вплив кверцетину на клітини PC-12. Витік ЛДГ у позаклітинне середовище, що дає інформацію про руйнування клітинної мембрани, також досліджували на тих же рівнях кверцетину. Отримані результати показали, що мембрани досліджуваних клітин за таких умов не пошкоджувалися. Чоботи та ін. [2], вивчаючи вплив кверцетину на епітеліальні клітини легень, спостерігали схожі результати. Отже, можна зробити висновок, що в цих концентраціях кверцетин позитивно впливає на клітини, підвищуючи їх життєздатність.

Другий важливий аспект механізму дії кверцетину пов'язаний з його антиоксидантними властивостями. Щоб оцінити асоційований ефект досліджуваного поліфенолу, були проведені експерименти, в яких перевірено, чи відіграє кверцетин захисну роль у клітинах, які піддаються окислювальному стресу. Окислювальний стрес був створений шляхом введення H, O2 у клітинне середовище.Цистанче для поліпшення пам'ятіЯк було показано в цьому дослідженні, перекис водню викликає значну смертність клітин, що виражається у пошкодженні мітохондрій.

Коли клітини SK-N-SH культивували протягом 3 годин у середовищі, що містить 3 і 5 мМ H2O2, життєздатність клітин знизилася приблизно до 44 відсотків від життєздатності необроблених клітин (аналіз МТТ). Дослідження показали, що 24-годинна попередня обробка клітин кверцетином викликає збільшення кількості живих клітин по відношенню до клітин, оброблених H2O2. Суемацу та ін. [13] повідомили про подібні ефекти.

Ми також вимірювали рівень MDA, який є біомаркером окисного стресу як кінцевого продукту перекисного окислення ліпідів [33]. Попередня обробка клітин високими концентраціями кверцетину з подальшим додаванням перекису водню призвела до незначного збільшення вмісту MDA порівняно з клітинами, які піддавалися впливу окремо H2O. Це може бути тому, що кверцетин (у більш високих концентраціях) також може піддаватися оксидно-відновній активації та бути предметом окисно-відновного циклу, генеруючи внутрішньоклітинні реактивні форми кисню [34].

Не було суттєвих змін у руйнуванні мембран (на що вказує незмінний рівень LDH) клітин, оброблених кверцетином і H2O2, порівняно з випадком, коли клітини піддавалися лише окислювальному стресу. Таким чином, можна зробити висновок, що, незважаючи на збільшення перекисного окислення ліпідів (при високих концентраціях кверцетину), це не було достатньо значним, щоб знищити мембрани та порушити їх безперервність.

Спостереження, отримані для нативної системи, були зіставлені з даними, отриманими для модельної системи, де можна точно контролювати як концентрацію кверцетину, так і рівень стресу. Було перевірено, наскільки ліпідна частина мембрани нейробластоми стійка до окислювального стресу. Умови стресу були створені шляхом введення озону в буфер, при цьому озон водного середовища піддається реакціям розкладання з утворенням окислювальних радикалів, серед інших гідроксильних радикалів і супероксидних аніон-радикалів [35]. Отримана суміш активних форм кисню відповідає тим, які природно зустрічаються в клітинах, через дисбаланс порушення окисно-відновного статусу [36-38].

Під впливом напруги форма ізотерм змінювалася, що свідчить про значне зменшення площі однієї молекули в щільно упакованому моношарі. Такі зміни відбулися внаслідок окислення ненасичених зв'язків у ланцюгах жирних кислот. Цей ефект посилювався зі збільшенням концентрації озону приблизно до {{0}}.3 ppm, а потім цей параметр ізотерми залишався на тому ж рівні, незважаючи на збільшення ROS. Це означає, що при концентрації озону приблизно 0,3 ppm усі ненасичені жирні кислоти, присутні в моношарі, окислюються (у моделі нейробластоми загальна кількість ненасичених жирних кислот становила 52 відсотки)

Окислені моношари мають значну жорсткість,cistanche китайськоюяк представлено значенням Cs-1 (що вище значення цього параметра, то більша жорсткість шару). У присутності кверцетину, навіть при низькій концентрації （6,25 мкМ）, модифікації мембрани під впливом озону, як видно за змінами значення Alim, були значно зменшені (рис. 5а), що доводить антиоксидантну активність цієї сполуки. . Однак варто зазначити, що хоча кверцетин очищав радикали, захищаючи ненасичені жирні кислоти від окислення, він не змінював жорсткість мембрани (рис. 5b).

Таким чином, було показано, що кверцетин має антиоксидантну дію, але сама його присутність між молекулами ліпідів впливає (визначає) параметри лаверу, тобто, незважаючи на захист ланцюгів жирних кислот від окислення, жорсткість мембрани значно зменшилася (Cs- Я оцінюю приблизно на 25 відсотків менше порівняно з контролем).

Ці результати вказують на те, що саме зміна мембрани є головним чинником клітинних ефектів, спричинених присутністю кверцетину. Однак наслідки цієї зміни (модифікація сигналізації, транспорт) змінюються залежно від кількості молекул поліфенолу, початкового складу мембрани та функції клітини. Це пояснює, чому в різних обставинах і в різних дослідженнях кверцетин виявляє захисну дію, а в інших – зовсім протилежну.

У ситуації високого окислювального стресу антиоксидантний ефект допомагає клітині, захищаючи її компоненти від пошкодження. Однак, якщо мембрани суттєво модифіковані шляхом розміщення цієї сполуки в їхньому середовищі, що призводить до розподілу сигнальних або транспортних шляхів шляхом зміни жорсткості мембрани, це може призвести до несприятливих ефектів. Слід також пам’ятати, що багато процесів у клітині відбуваються одночасно, як ті, що пов’язані з мембранами, так і ті, що породжують окислювальний стрес. Ефект, який можна спостерігати та виміряти шляхом визначення рівня конкретних показників, завжди є сумарним. Тому існують ситуації, в яких дія кверцетину сприймається як сприятлива і несприятлива.

4. Матеріали та методи

4.1.Матеріали

Склад моделі ліпідної частини мембрани клітин нейробластоми встановлено на основі роботи авторів [39-41]. Фосфоліпіди: 1-олеоїл-2-пальмітоїл-sn-гліцерин-3-фосфохолін;1-гексакозаноїл-d4-2-гідрокси-sn-гліцерин-3-фосфохолін; 1,2-діолеоіл-sn-гліцерин-3-фосфохолін; L- -фосфатидилетаноламін (мозок); сфінгомієлін (мозок)-(Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL, USA). Холестерин був придбаний (Sigma-Aldrich, Дармштадт, Німеччина). Співвідношення фосфоліпідів і холестерину становило 79% до 21%. Співвідношення насичених і ненасичених жирних кислот становило 48 відсотків до 52 відсотків.

Розчинники (хлороформ, етанол) хімічної чистоти-Poch (Глівіце, Польща); свіжа деіонізована вода виробництва HLP 5 Hydrolab (м. Страшин, Польща). Культуральне середовище, сироватка та антибіотики були придбані у CytoGen GmbH. Хімічні реагенти, використані в експериментах, були отримані від Sigma Aldrich.

4.2. Культура клітин

Лінія клітин нейробластоми людини SK-N-SH (Європейська колекція автентифікованих клітинних культур (ECACC) культивували в 10% фетальної бичачої сироватки (FBS) у модифікованому середовищі Ігла за Дульбекко (DMEM), доповненому 0,01% пеніциліну -стрептоміцин при 37 градусах у зволоженій атмосфері, що містить 5 відсотків CO2.

4.3. Вимірювання життєздатності клітин (аналіз МТТ)

Клітини висівали в {{0}}лунковий планшет із щільністю 1×104 клітин на лунку в об’ємі 0,1 мл. Клітини обробляли протягом 24 годин різними концентраціями кверцетину (3.75-200 мкМ). Після цього часу додавали 3 мМ і 5 мМ перекис водню на 3 години. Через відсутність відмінностей між ефектами HO2 при концентраціях 3 і 5 мкМ, для статистичних досліджень вони розглядалися як ті самі процедури та описувалися як 3-5 мкМ H2O2.

Після цього 50мкл розчину MTT（3-【4,5-диметилтіазол-2-іл】-2,5-дифенілтетразолію броміду） (стерильний вихідний розчин 5 мг/мл) додавали до клітин та інкубували протягом 2 годин при 37 градусах у зволоженій атмосфері 5 відсотків CO. Потім до кожної лунки додавали 0,4 мл диметилсульфоксиду (ДМСО) і витримували протягом 10 хв. Після центрифугування оптичну щільність супернатанту вимірювали при 570 нм за допомогою мікролітрового рідера планшетів (BioTek Instruments, VT, США).

4.4. Аналіз пошкодження мембрани (аналіз LDH)

Як маркер цілісності клітинної мембрани використовували тест на лактатдегідрогеназу (ЛДГ).

Клітини в кількості 1×1{{10}}* клітин на лунку висівали в 96-лунковий планшет та інкубували в присутності кверцетину （3.75-200 мкМ） протягом 24 год; Потім протягом 3 годин додавали 3 мМ і 5 мМ H2O. До пробірок, що містять 0.5 мл 0,75 мМ пірувату натрію та 10 мкл NADH (140 мкМ) (нагрітих при 37°С протягом 10 хв), додають 150 мкл супернатанту та інкубують протягом 30 хв при 37°. Потім до зразка додавали 0,5 мл 2,4-динітрофенілгідразину і через 1 годину вимірювали поглинання при 450 нм.

4.5. Визначення перекисного окислення ліпідів (концентрації MDA)

Перекисне окислення ліпідів мембран оцінювали за реакцією тіобарбітурової кислоти (ТБК) з малоновим діальдегідом (МДА). Клітини висівали в {{0}}лункові планшети, що містили кверцетин і H, O2 (у концентраціях і часах, описаних вище) у кількості 1×104 клітини на лунку в об’ємі { {10}}.25 мл. Після обробки зразки відбирали та центрифугували (1000×&,5 хв). До гранул додавали 0.5 мл 0,5% TCA, перемішували протягом 1 хвилини та лізували ультразвуком протягом 5 хвилин. Після центрифугування при 10000×g протягом 10 хвилин 0,4 мл супернатанту додавали до 1,25 мл 20% TCA з 0,5% TBA і нагрівали в сухому термоблоку (100°) протягом 30 хв. Після охолодження абсорбцію виміряли при 532 нм із використанням молярного коефіцієнта екстинкції MDA, що дорівнює 155 M-1 см-1.

4.6. Модельні мембрани

Буферне озонування. Фосфатний буфер (0.01 М, pH 7,4) був насичений озоном, отриманим генератором озону FM 500 (Grekos, Польща). Концентрацію озону в буфері визначали за Bader і Hoigne [42].

Ізотерми поверхневого тиску.зростання статевого членаДля реєстрації ізотерм поверхневого тиску використовували жолоб Ленгмюра (KSV, Фінляндія) при постійній швидкості стиснення, що відповідає бар’єрній швидкості 5 мм/хв. Ліпідний моношар був утворений шляхом розподілу певної кількості розчину ліпідного хлороформу в концентрації 1 мг/мл на підфазу, що складається з водного 0.01 М фосфатного буфера, pH 7,4 з кверцетином або без нього, з озоном або без нього. Поверхневий натяг вимірювали за допомогою пластини Pt-Wilhelmy. Експерименти проводили при 25 градусах ±1 градус.

4.7. Статистичний аналіз

Від трьох до шести незалежних аналізів було проведено для кожного тестованого варіанту та усереднено (± SD). Значні відмінності порівняно з контролем оцінювали за допомогою процедури SAS ANOVA. Статистичний аналіз проводився за допомогою тесту множинного діапазону Дункана, взявши стор<0.05. statistical="" tests="" were="" carried="" out="" using="" statistica="" 13.3(cracow,="">

Авторські внески: Conceptualization, BK, BD, and ER-S.methodology, BKBD; програмне забезпечення, BK, BDvalidation, BK, BD, ER-S., ABwriting—підготовка оригіналу BK, BD, ER-S., написання—перегляд та редагування, BK, BD, ER-S., ABvisualization, BK, BDsupervision, BK, BD, ER-S., ABусі автори прочитали та погодилися з опублікованою версією рукопису.

Фінансування:Це дослідження не отримало зовнішнього фінансування.

Заява інституційної ревізійної ради: Не застосовується.

Заява про інформовану згоду: Не застосовується.

Заява про доступність даних: Дані містяться в статті. Конфлікт інтересів: автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів.

Ця стаття взята з Molecules 2021, 26, 4945. https://doi.org/10.3390/molecules26164945 https://www.mdpi.com/journal/molecules