Актеозид, отриманий із цистанхе, покращує остеопороз, спричинений глюкокортикоїдами, шляхом активації шляху PI3K/AKT/mTOR

Анотація

Мета

Глюкокортикоїди широко використовуються в клінічній практиці; однак вони можуть викликати побічні ефекти, такі якостеопороз. Актеозид(ACT) з Cistanche використовувався для боротьби з різними захворюваннями. Дослідження було проведено для оцінки ефективності ACT при глюкокортикоїд-індукованихостеопороз(GIOP) та його потенційний механізм.

методи
Внутрішньом'язово вводили дексаметазон (Dex) для індукціїостеопорозу моделі щурів, і ACT застосовували перорально. ACT був доповнений in vivo в Dex-стимульованомуостеобластнийКлітини MC3T3-E1. RT-qPCR проводили для оцінки рівнів мРНКформування кісток(Runx2, CoL1A1) і резорбції кістки (OPG і RANKL). Для оцінки рівнів OC і CTX у сироватці використовували комерційний набір ELISA. Для оцінки рівнів білка в сигнальному шляху PI3K/AKT/mTOR проводили Вестерн-блот. Для оцінки життєздатності та апоптозу остеобластів проводили аналіз CCK-8 і проточну цитометрію.

Натисніть тут, щоб отримати Cistanche Acteoside для лікування остеобластів, стимульованих Dex

Результати
ACT зменшив спричинене Dex погіршення мікроструктури кістки, підвищив рівень OC у сироватці крові та знизив рівень CTX (P< 0.05). In the MC3T3-E1 cells, Dex inhibited cell viability and сприяв апоптозу; однак цей ефект був значно послаблений ACT (P< 0.05). Concurrently, ACT reversed the reduction in Runx2, osterix, CoL1A1, and OPG mRNA levels, ALP activity, and the promotion of RANKL by Dex. Additionally, ACT attenuated Dex-induced inhibition of p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, and p-PI3K/PI3K protein levels by Dex (P < 0.05), while the PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitor LY294002 diminished the potential effect of ACT (P < 0.05).

Висновок
ДІЙ відЦистанхеможе проявляти остеопротекторну дію шляхом активації сигнального шляху PI3K/AKT/mTOR для полегшення остеопорозу, спричиненого Dex.

Ключові слова:Актеозид Цистанхеіндуковані глюкокортикоїдамиостеопороз

вступ
Остеопороз (ОП) — це генералізоване захворювання скелета, що характеризується низькою кістковою масою, деструкцією мікроструктури кісткової тканини та порушенням гомеостазу кісткової тканини [1]. ОП викликає понад 8,9 мільйонів переломів на рік, а остеопоротичні переломи трапляються майже кожні 3 секунди, що призводить до довічної інвалідності або смерті [2]. Глюкокортикоїди (ГК) зазвичай призначають для лікування неінфекційних запальних захворювань (таких як астма та запальні захворювання кишечника), а також аутоімунних станів [3]. Однак тривале застосування ГК спричиняє більш ніж 30 відсотків випадків ОП і більше ніж 10 відсотків випадків остеонекрозу [4]. ГК безпосередньо пригнічують проліферацію та диференціювання остеобластів [5], знижують дозрівання та активність, а також індукують апоптоз остеобластів, що, у свою чергу, призводить до розвитку глюкокортикоїд-індукованого остеопорозу (ГІОП) [6]. Крім того, все більше доказів свідчить про те, що дисфункція остеобластів є основною причиною втрати кісткової маси. Таким чином, збільшення кількості та функції остеобластів є основною стратегією профілактики ОП, особливо ГІОП.

Трав’яні ліки, особливо на основі природних сполук, практикуються протягом тисячоліть для лікування різних захворювань [7]. Цистанхе — дорогоцінна рослина, зареєстрована в Китайській фармакопеї, яка росте в південній частині Сіньцзян-Уйгурського автономного району і відома як женьшень пустелі [8]. Було доведено, що цистанхе має різні ефекти, такі як підвищення імунітету, захист нирок, антистаріння, антиоксидантну, протизапальну та нейропротекторну дію [9].Актеозид(ACT) є фенілетаноловим глюкозидом у Cistanche, який має біологічну активність, таку як інгібування нейронального апоптозу [10], полегшення пошкодження печінки [11], протизапальну [12], антиоксидантну [13] , профілактика діабету [14] та ожиріння [15], а також дегенерації суглобового хряща [16]. Крім того, кілька досліджень повідомляли про фармакокінетику ACT і підтверджували, що терапевтичний ефект існує, навіть якщо пероральне використання становить лише 0,12 відсотка. ACT вважається проліками з активними метаболітами in vivo [17].

Чжан та ін. продемонстрували потенційний захисний ефект ACT на спричинену оваріектомією втрату кісткової маси у щурів [18]. ACT модулює сигнальний шлях IGF-1/PI3K/mTOR, щоб запобігти втраті кісткової маси у щурів з діабетом [19]. Повідомлялося, що шлях PI3K/AKT/mTOR відіграє критичну регуляторну роль у різних захворюваннях, включаючи ГІОП [20]. Нарингін полегшує ГІОП, регулюючи сигнальний шлях PI3K/AKT/mTOR [21]. Крім того, цей сигнальний шлях регулює диференціацію остеобластів [22], формування кісток [23] і загоєння переломів [24]. Однак потенційна роль ACT на GIOP і те, чи регулюється вона модуляцією сигнального шляху PI3K/AKT/mTOR, невідома.

Дане дослідження мало на меті зрозуміти захисні ефекти ACT у моделі щурів GIOP та остеобластах in vitro та з’ясувати основні молекулярні механізми.

Матеріали та методи
Піддослідні тварини
Сорок 8-тижневих самців щурів Sprague-Dawley (SD) вагою 280–340 г було отримано з Шанхайського лабораторного центру тварин (CAS, Шанхай, Китай). Процедури догляду за експериментальними тваринами проводилися відповідно до протоколу, затвердженого Третьою афілійованою лікарнею Комітету з етики тварин Медичного університету Циціхар. І дослідження було проведено відповідно до рекомендацій ARRIVE. Тварин містили в тваринницькі центри, вільні від патогенів, з температурою 24 ± 2 градуси, 12-годинними циклами світла та темряви, 50 ± 5 відсотків вологості та з вільним доступом до їжі та води.

Побудова моделі ГІОП
Після 7 днів адаптивного годування щурів випадковим чином розділили на контрольну та модельну групи за допомогою таблиці випадкових чисел, вводили дексаметазон (Dex, Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA) 5 мг/кг двічі на тиждень протягом 6 тижнів. внутрішньом'язово для індукції ОП у щурів у модельній групі [25]. Щурам контрольної групи (n = 10) вводили рівну кількість фізіологічного розчину. У щурів в обох групах через 6 тижнів не спостерігалося істотних змін маси тіла. Згодом щури в модельній групі були розділені на модельну групу, групу низької дози ACT (модель плюс ACT-L) і групу високої дози ACT (модель плюс ACT-H). ACT (HPLC 98 відсотків) був отриманий від Baoji Herbest Bio-tech., Ltd. (Baoji, Китай) і оброблений водною суспензією розчинника. Дозу 50 мг/кг/день і 100 мг/кг/день ACT вводили перорально щурам у групах низьких і високих доз (8 щурів на групу), відповідно, і було продовжено протягом 8 тижнів. Серед них розмір вибірки було розраховано на основі попереднього дослідження [26]. Враховуючи двобічний рівень значущості 0,05 [95-відсотковий довірчий інтервал (= 0.05)], 80-відсоткову потужність і розмір ефекту 0,5, аналіз потужності оцінив необхідний розмір вибірки 6 тварин на групу, припускаючи, відповідний рівень ефекту 30 відсотків остеопорозу. Крім того, при рівні відсіву 20 відсотків 8 тварин на групу (всього 32 щури) вважалися ідеальними.

Зразки сироватки щурів
Через 8 тижнів щурів анестезували 10% хлоралгідратом (400 мг/кг, внутрішньочеревно, Solarbio, Пекін, Китай), кров збирали з черевної аорти, згортали при кімнатній температурі та центрифугували при 3500 об/хв протягом 10 хв. Сироватку зберігали в центрифужних пробірках на 1,5 мл до подальшого використання.

Оцінка мінеральної щільності кісткової тканини
Мінеральну щільність кісткової тканини (МЩКТ) використовували за допомогою денситометра кісток DAX для маленьких тварин (Ranzhe Instrument Equipment Co., Шанхай, Китай). Коротко кажучи, щурів поміщали в положення лежачи, а задні кінцівки розташовували назовні. Праву стегнову кістку щурів сканували відповідно до інструкцій виробника та реєстрували значення МЩКТ [27].

Аналіз морфології кісток
Наприкінці експерименту щурів піддавали евтаназії шляхом внутрішньочеревної ін’єкції надлишку хлоралгідрату, а стегнові кістки фіксували в 70% етанолі. Згодом було проведено сканування на системі VivaCT 40μCT, як описано в попередньому дослідженні, і об’єм кістки/загальний об’єм (BV/TV), кількість трабекулярної кістки (Tb.N), товщину трабекулярної кістки (Tb.Tn) і поділ трабекулярної кістки (Tb.Sp) [28]. Для евтаназії щурів SD анестезували після аналізу морфології кісток шляхом внутрішньочеревної ін’єкції 10% хлоралгідрату (350 мг/кг).

Імуноферментний аналіз (ELISA)
Комерційні набори ELISA використовували для виявлення рівнів остеокальцину (OC, E-EL-R0243c, Elabscience) і С-кінцевого телопептиду (CTX, E-EL-R1405c, Elabscience) у сироватці крові щурів. Коротко кажучи, реагенти видаляли при 18-25 градусі для врівноваження та підготовки розчину для промивання та стандартної роботи. Планшети для ферментів. Планшети встановлювали зі стандартними, порожніми лунками та лунками для зразків. Приблизно 100 мкл розчину розчинника зразка додавали до лунок, інкубували протягом 90 хвилин при 37 градусах і замінювали біотинільованим антитілом протягом 60 хвилин при 37 градусах. Після промивання додавали робочий розчин, що зв'язує фермент, і інкубували протягом 30 хв. Додавали розчин субстрату (90 мкл) та інкубували протягом 15 хвилин із захистом від світла. Коли в стандартних лунках з’явився блакитний градієнт, додали 50 мкл розчину термінації та проаналізували зміну OD450.

Кількісна ПЛР зі зворотною транскрипцією в реальному часі (RT-qPCR)
Реагент TRlzol LS додавали до сироватки крові щурів і клітин MC3T3-E1, оброблених ACT, і загальну РНК екстрагували шляхом інкубації при кімнатній температурі з подальшим додаванням хлороформу. Концентрація та чистота РНК були підтверджені вимірюванням поглинання A260/280 на спектрофотометрі Nanodrop ND-1000. Для зворотної транскрипції РНК в кДНК використовувався набір SuperScript II Reverse Transcriptase. Згодом кДНК застосовували як матрицю, додавали праймер, набір головної суміші SYBR-Green PCR змішували та доповнювали ddH2O до 20 мкл, а реакцію ампліфікації ПЛР проводили за допомогою швидкої ПЛР у реальному часі Applied biosystems AMI7500 система (ABI, CA, США). GAPDH використовувався як внутрішній еталон для нормалізації, і відносні рівні експресії були розраховані за допомогою методу 2−ΔΔCt і виконані в трьох примірниках. Послідовність праймерів для пов’язаного з Runt фактора транскрипції 2 (Runx2), колагену типу I 1 (CoL1A1), активатора рецептора ліганду ядерного фактора-κB (RANKL), остериксу та остеопротегерину (OPG) представлено в таблиці 1.

Вестерн-блот аналіз
Лізат RIPA, що містить 1 відсоток інгібітора протеази, додавали до клітин, і загальний білок із кожної групи збирали після лізису клітин струшуванням протягом 5 хвилин при 4°. Для кількісного визначення концентрації білків у кожній групі використовували набір для аналізу BCA. Після цього зразки білка змішували з 10-відсотковим буфером додецилсульфату натрію (SDS) рівним об’ємом і кип’ятили на водяній бані при 95 градусах протягом 5 хвилин для денатурації білка. Був приготований 12-відсотковий SDS-поліакриламідний вертикальний гель, і після того, як гель затвердів, відібрали 30 мкг білка для 120 мА 90 хв розділення гель-електрофорезу. Потім білок переносили на мембрану PVDF при 90 В протягом 120 хв. Після запечатування 5-відсотковим бичачим сироватковим альбуміном мембрану PVDF розрізали на основі молекулярної маси маркера та смуги цільового білка та інкубували з відповідним первинним антитілом протягом ночі при 4 градусах. Кролячі поліклональні антитіла проти p-AKT, p-mTOR і p-PI3K розводили до співвідношення 1:1000 (Proteintech, Wuhan, China). TBST промивали протягом 30 хвилин та інкубували з відповідним вторинним антитілом, міченим пероксидазою хрону, при кімнатній температурі протягом 1 години. Блот візуалізували за допомогою реагентів з посиленою хемілюмінесценцією. Щільність білкових смуг кількісно визначали за допомогою Image J. GAPDH використовували як контроль для розрахунку відносних рівнів білка.

Культура клітин і групування
Мишачі преостеобласти MC3T3-E1 були придбані в Китайській колекції тканинних культур (CTCC, Китай) і культивовані в -MEM, що містить 10 відсотків фетальної бичачої сироватки та 100 ОД/мл пеніциліну та 100 мг/мл стрептоміцину в зволожений інкубатор при 37 градусах і 5% CO2. Для культури диференціювання кісток середовище для остеогенної індукції було виготовлено шляхом змішування 10 мМ- -гліцерофосфату та 50 мг/мл аскорбінової кислоти (Sigma-Aldrich) з -MEM і додавання до клітин MC3T3-E1 для індукції їх диференціація. Середовище змінювали через 3 дні. Культури протягом 14 днів використовували для визначення життєздатності лужної фосфатази (ALP). Крім того, клітини попередньо обробляли інгібітором PI3K LY294002 (10 мкМ) протягом 30 хвилин з подальшою обробкою Dex і ACT.

Дослідження життєздатності клітин
Набір для підрахунку клітин-8 (CCK-8) проводився для оцінки життєздатності остеобластів, оброблених ACT. Клітини MC3T3-E1 інокулюють у 96-лункові планшети по 5 × 103 клітин/лунку. Кількість 1 мкМ Dex розглядалася на основі попередніх досліджень [29] і була спільно інкубована з градієнтними концентраціями ACT (10-8, 10-7, 10-6 і 10-5 М). Культуральне середовище в 96-лункових планшетах замінювали після додавання середовища для змішування та реагенту CCK-8 у співвідношенні 10:1. Після продовження інкубації протягом 1 години при 37 градусах оцінювали зміну OD450.

Визначення кількості апоптозу остеобластів
Клітини MC3T3-E1, які піддавалися різним обробкам, розщеплювали за допомогою трипсину, що не містить EDTA, і збирали центрифугуванням. Після промивання буфером для зв’язування 1 × додавали 5 мкл Annexin V-FITC та інкубували при кімнатній температурі протягом 5 хвилин, доповнювали 5 мкл PI та пропускали через 200-сітчасту нейлонову сітку. Зразки аналізували за допомогою системи проточної цитометрії FACScan.

Аналіз активності ЩФ
Клітини MC3T3-E1 були засіяні в 24-лункові планшети, і ACT і Dex були додані після гіпсування. Середовище для культивування клітин було замінено на середовище для остеогенної диференціації. Після використання лізису клітин розчином для лізису клітин (P0012J, Beyotime Biotechnology) супернатант збирали центрифугуванням і будували стандартну криву. Набір ALP (P0132S, Beyotime Biotechnology) використовували для оцінки активності ALP і розраховували OD450.

Статистичний аналіз
Після проведення трьох незалежних експериментів у трьох повторах дані були проаналізовані за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism 6.0 і виражені як середнє ± стандартне відхилення. ANOVA використовувався для порівняння статистичних відмінностей між кількома групами. Значення P < 0.05 вважалося статистично відмінним.