Нерандомізоване дослідження впливу споживання коричневого рису на кишкову мікрофлору, увагу та короткочасну робочу пам’ять у тайських дітей шкільного віку Частина 2

2.4. Кількісний аналіз фекальної мікробіоти

Зразки фекалій відбирали у дітей на початковому етапі, на тижнях 4, 15, 56 і 61 і тижні 71 у стерилізовані контейнери та негайно заморожували при -80 ◦C. Екстракцію мікробної ДНК та кількісне вимірювання абсолютної кількості фекальних мікробіот проводили, як описано раніше [29].

Зв'язок між кількісними показниками та пам'яттю є темою, яка заслуговує на вивчення. Для багатьох проблем у житті людей часто турбують проблеми з пам’яттю, наприклад, неможливість запам’ятати важливі речі, забування часу зустрічей тощо. У цей час кількісні методи вимірювання можуть допомогти нам зрозуміти стан пам’яті та досягти цілеспрямованих покращень. .

Методи кількісного вимірювання можуть кількісно визначити пам’ять людей за допомогою наукових засобів. На цій основі пропонуються конкретні та ефективні методи тренування пам'яті. У повсякденному житті ми також можемо використовувати прості методи тренування пам’яті, такі як запам’ятовування слів, віршів тощо. Усе це ефективні способи розвитку гарної пам’яті.

У той же час ми також можемо покращити пам'ять у всіх аспектах життя. Наприклад, якщо ми хочемо запам’ятати нове словникове слово, ми можемо прочитати його кілька разів, написати кілька разів або пов’язати його з його значенням, щоб пам’ять була більш глибокою.

В епоху інформаційного вибуху ми часто почуваємось переповненими інформацією. Багато разів нам потрібно запам'ятати багато речей, але ми не знаємо, як з цією інформацією поводитися. У цей час ми можемо використовувати кількісні методи вимірювання, щоб визначити стан пам’яті, а потім тренуватися та вдосконалюватися на основі конкретних ситуацій. За допомогою розумних методів пам’яті ми можемо ефективно покращити нашу пам’ять і забезпечити більше зручностей для нашого життя та роботи.

Коротше кажучи, зв’язок між кількісним вимірюванням і пам’яттю нерозривний. Нам потрібно використовувати наукові методи, щоб виявити стан нашої пам’яті, а потім проводити ефективне навчання на основі конкретних ситуацій. Я вірю, що якщо ми невпинно тренуємося, ми зможемо зміцнити пам’ять і покращити якість життя. Видно, що нам потрібно покращити пам’ять, і Cistanche deserticola може значно покращити пам’ять, оскільки Cistanche deserticola також може регулювати баланс нейромедіаторів, наприклад підвищувати рівень ацетилхоліну та факторів росту. Ці речовини дуже важливі для пам'яті та навчання. Крім того, м’ясо також може покращити кровообіг і сприяти доставці кисню, що може гарантувати, що мозок отримує достатню кількість поживних речовин і енергії, тим самим покращуючи життєздатність і витривалість мозку.

Клацніть знати добавки для покращення пам’яті

Коротко кажучи, мікробну геномну ДНК витягували зі зразків фекалій за допомогою набору innuPREP Stool DNA Kit (Analytik Jena Biometra, Jena, Німеччина), а концентрацію та чистоту ДНК визначали за допомогою Take 3Micro-Volume Plate (Biotek, Winooski, VT, США).

Абсолютну чисельність генів рРНК мікробіоти 16 потім було кількісно визначено за допомогою КПЦР з використанням термоциклів реального часуCFX96 TouchTM (Bio-Rad, Сінгапур) на основі конкретних праймерів, наведених у таблиці S1.

Умови КПЦР та оцінки кількості копій мікробіоти проводили відповідно до попереднього протоколу [37]. Log10 кількості копій 16S рРНК на грам вологої ваги фекалій представлено в наших додаткових даних.

2.5. Статистичний аналіз

Розподіл даних перевіряли за допомогою тесту Шапіро–Вілка та тесту Лівена (пакет статистики версії 4.0.3). Для візуалізації даних використовувався R-пакет ggplot2 [38]. Корекція p-значення Бенджаміні-Хохберга (BH) була застосована для поправки багаторазового тестування (q-value). Значимість була визначена при q < 0.05. Усі статистичні аналізи проводили в програмному забезпеченні R версії 4.0.3 [39].

Відмінності в середній абсолютній кількості кишкової мікробіоти між групами втручання для кожного моменту часу визначали за допомогою t-критерію або критерію рангової суми Вілкоксона відповідно до нормальності розподілу даних.

Зміни в кишковій мікробіоті між часовими точками кожної фази (в суб’єктах) оцінювали за допомогою попарних t-тестів або тестів Вілкоксона зі знаком рангу після значущих результатів одностороннього повторного вимірювання ANOVA або тесту Фрідмана (p < 0).05 ). Зміни в абсолютному вмісті кишкової мікробіоти між тижнями були виражені як log2 трансформовані кратні зміни (Log2FCs).

Зв’язки між абсолютною чисельністю кишкової мікробіоти та віком дітей шкільного віку визначали за допомогою коефіцієнта рангової кореляції Пірсона або Спірмена.

Зв’язок між кишковою мікробіотою та втручанням у кожен момент часу з поправкою на демографічні змінні (вік, стать, z-показник ІМТ, спосіб пологів, історія народження та етнічна приналежність) оцінювали за допомогою пермутаційного багатовимірного дисперсійного аналізу (PERMANOVA) за допомогою функції Адоніса . Щоб дослідити ефект втручання протягом тижнів кожної фази, було проведено PERMANOVA з використанням учасників як страт і коригуванням коваріантів. Умову однорідності на основі евклідової відстані вимірювали за допомогою бетадинової функції.

Перестановку було виконано на 999 у пакеті R vegan(2.6-2) [40]. Крім того, ми визначили вплив втручання на кишкову мікробіоту за допомогою аналізу надмірності (RDA) з коригуванням коваріантів.

Лікування використовували як обмежені пояснювальні змінні, а абсолютну чисельність мікробіоти кишечника використовували як змінні відповіді. Значущість обмежень оцінювали за допомогою ANOVA-подібного тесту перестановки (перестановка=999). Поетапний вибір пояснювальних змінних проводився за допомогою функції кроку на основі критеріїв AIC.

Когнітивні результати між групами втручання за кожен тиждень порівнювали за допомогою двовибіркового t-тесту Велча або сумарного рангового тесту Вілкоксона. Різницю в когнітивних показниках протягом тижнів кожної фази (в суб’єктах) визначали за допомогою знакового рангового тесту Вілкоксона після значущих результатів тесту Фрідмана (p < 0,05).

Ми використовували RDA, щоб визначити вплив втручання на когнітивні показники дітей шкільного віку з поправкою на вік і стать. Вплив часових точок на чисельність кишкової мікробіоти також оцінювали за допомогою RDA з використанням учасників як страт.

Стан RDA відбувався, як описано вище. Щоб визначити зв’язок між когнітивними можливостями та кишковою мікробіотою, ми використали коефіцієнт рангової кореляції Спірмена.

Було проведено багатофакторний аналіз (MFA), щоб дослідити варіації кишкової мікробіоти, які можна пояснити втручанням і змінними хазяїна (вік і стать) за допомогою FactoMine R версії 2.4 [41] і візуалізації за допомогою Factoextra версії 1.0. 7 [42].

3. Результати

3.1. Характеристика дітей шкільного віку

Після контролю якості даних (рис. 1) ми проаналізували решту 85 і 57 дітей у фазах I і II відповідно. Діти на початковому етапі були в середньому 7,02 і 10,52 року для груп WR і SLR відповідно.

Вихідні характеристики контрольної групи та групи втручання значно відрізнялися за віком (p < {{0}}.0001), вагою (p < 0,0001), зростом (p < 0,0001), ІМТ z- бал (p=0.03) і тип годування (p=0.02) (Таблиця S2).
Подібна картина також спостерігалася в усі часові точки дослідження, за винятком ІМТ, який суттєво не відрізнявся між групами на 71-му тижні (таблиці S3–S7).

3.2. Вплив втручання Sinlek Rice на кишкову мікробіоту дітей шкільного віку

Враховуючи кожну з часових точок, не було суттєвих відмінностей в абсолютній чисельності кишкової мікробіоти між контрольною (WR) і групами втручання Sinlek (SLR) на першому етапі втручання (фаза I; вихідний рівень, тиждень 4 і тиждень 15). ).

Багатофакторні порівняння з використанням PERMANOVA (з запасом) також показали, що втручання на Фазі I не мало суттєвого впливу на зміни мікробіоти кишечника після коригування демографічних змінних (додатковий файл S1).

Далі ми визначили зв’язок між великою кількістю кишкової мікробіоти та віком і виявили, що Lactobacillus негативно корелює з віком на початковому рівні (кореляція Пірсона; R {{0}} −0).24, p {{ 3}}.026) і Тиждень 4 (кореляція Пірсона; R=−0,3, p=0,002) (Малюнок 2b,d). Для другої фази втручання (фаза ІІ) зміни в чисельності мікробів, однак, були відзначені на 61-му та 71-му тижнях. Чисельність загальних бактерій (q=0.032) і Firmicutes (q=0.032 ) були значно збільшені, тоді як рівень гаммапротеобактерій (q < 0,0001) значно знизився після втручання SLR на 61-му тижні (рис. 2e–g).

Ці бактерії також були значною мірою пов’язані з віком, де велика кількість загальних бактерій (кореляція Пірсона; R {{0}} −0.32, p=0.0 15) і Firmicutes (кореляція Пірсона; R=−0,32, p=0.014, рис. 2h) зменшувалися зі збільшенням віку, тоді як абсолютна чисельність гаммапротеобактерій позитивно корелювала з віком (кореляція Пірсона; R { {11}}.62, p < 0,0001, рис. 2і).

На 71-му тижні рівень Bacteroidetes був значно знижений у групі SLR (q < 0.0001) (Малюнок 2j), а його кількість позитивно корелювала з віком (рангова кореляція Спірмена; R { {4}}.57, p < 0,0001, рис. 2l).

Беручи до уваги зміни кількості кишкової мікробіоти протягом тижнів (у суб’єктах) контрольної та інтервенційної груп, ми спостерігали подібні закономірності у двох групах учасників. Гаммапротеобактерії, здається, сильно коливалися після втручання: їх чисельність значно зменшилася на 4-му та 61-му тижні (рис. 3a, b, S1c та S2c, додатковий файл S2).

Рівні цих бактерій, як виявилося, поверталися, однак, у кінцевій точці кожної фази (тиждень 15 і тиждень 71). Крім того, кількість Bacteroidetes у групі SLR була нижчою на 71-му тижні порівняно з 56-м і 61-м тижнями (рис. 3a і S2e). Поступове зменшення чисельності двох мікробних таксонів, а саме Ruminococcus і Bacteroides, також спостерігалося під час фази II, причому їхня чисельність була найнижчою на кінцевій точці дослідження (71 тиждень) (рис. 3b і S2f,g), незалежно від втручання.

Крім того, ми оцінили, чи були відмінності в кількості кишкової мікробіоти між лікуваннями та протягом тижнів, використовуючи учасників як страти. PERMANOVA вказала, що присутність лікування та/або точка часу випробування (тиждень) протягом обох фаз мали значний маргінальний вплив на велика кількість кишкової мікробіоти (p < 0.05).

Дисперсії (розбіжності) між групами та модель, яка враховує демографічні змінні зі статистичною значущістю, узагальнені в додатковому файлі S3. Ми додатково дослідили міцність асоціації та варіації кишкової мікробіоти, пояснені втручанням із застосуванням RDA. Достовірні відмінності були виявлені лише в II фазі.

Велика кількість гаммапротеобактерій була більшою в контрольній групі (WR), ніж у групі SLR, тоді як більша загальна кількість бактерій, Firmicutes і Bacteroidetes була пов’язана з втручанням SLR на 61-му тижні (RDA1 пояснював 30,58% загальної дисперсії, R2adj {{5} }.29,p=0.001, малюнок 3c). На 71-му тижні кількість Bacteroidetes була вищою в контрольній групі, ніж у групі SLR (RDA1 пояснював 8,18% загальної дисперсії, R2adj=0.06,p=0.005, рис. 3d) .

Потім ми продовжили поетапний вибір пояснювальних змінних (втручання та демографічних змінних) на основі AIC. Модель виявила, що лише втручання суттєво пояснило варіації в профілях кишкової мікробіоти дітей шкільного віку (q=0.035).

3.3. Когнітивні показники між контрольною та групою втручання

У фазі I ми виявили значні відмінності між контрольною та інтервенційною групами в когнітивних результатах. Група SLR показала значно вищі бали в тесті Corsi block-tapping (так званий MMG, гра зіставлення пам’яті) і загальну ефективність (OVP) в тесті на психомоторну пильність (PVT-B), тоді як час реакції (RT) і пропуски були нижчими, ніж контрольна група. група (рис. 4).

У фазі II патерни когнітивної діяльності залишалися незмінними. Ми також порівняли когнітивні показники (в суб’єктах) протягом тижнів кожної фази та виявили, що контрольна група (фаза I) показала кращі результати щодо пропусків на 15-му тижні порівняно з базовим рівнем і тижнем 4 (q=0.02) (рис. S3). RT був вищим на 15-му тижні порівняно з 4-м тижнем (q=0,008), тоді як суттєвих відмінностей у ММГ або ОВП виявлено не було. MMG був єдиним когнітивним результатом, який був значно вищим для групи SLR (фаза I) на 15-му тижні порівняно з вихідним рівнем (q=0.003) і тижнем 4 (q=0.03) (Малюнок S4) .

У фазі II не було суттєвих відмінностей між тижнями в жодному з вимірювань когнітивної продуктивності як у контрольній, так і в групі SLR. Крім того, вік і стать також були включені в RDA, і результати показали відсутність впливу втручання на когнітивні показники дітей. в будь-якій групі в будь-який момент часу протягом 71 тижня випробування.

Проте виявилося, що вік суттєво описує варіації когнітивних результатів на початку (p=0,008), тижні 4 (p=0,005) і тижні 15 (p=0 .028) (Рисунок 5), для якого вік позитивно корелював із MMG та OVP. На 56-му, 61-му або 71-му тижні не було виявлено значних впливів втручання, віку чи статі на когнітивні функції.

Розглядаючи когнітивні профілі протягом тижнів кожного лікування в кожній фазі, як тиждень (p=0,001), так і стать (p=0,001) суттєво описували варіації в когнітивних показниках контрольної групи (фаза I). , для яких жіноча стать і тиждень 15 позитивно корелювали з MMG і OVP (рис. S5a).

Діти показали кращі результати в MMG на 15-му тижні в групі SLR (фаза I), тоді як жіноча стать позитивно корелювала з пропусками та RT (рис. S5b). Ефект лікування з поправкою на вік і стать також оцінювали для кожної фази, контролюючи тиждень (часові точки). RDA показало, що вік мав сильний зв’язок із OVP та MMG у Фазі I (Малюнок S6a), тоді як у Фазі II результати щодо RT та провалів були гіршими в групі SLR, ніж у контрольній групі (Малюнок S6b).
Загалом вікові та часові точки були більше пов’язані з когнітивними показниками дітей шкільного віку, ніж із втручанням, і ефект втручання спостерігався лише при обмеженні вибірки протягом кожного тижня Фази ІІ після коригування віку та статі.

3.4. Зв'язок між кишковою мікробіотою та когнітивними можливостями дітей шкільного віку

Ми виявили слабкі кореляції між кишковою мікробіотою та когнітивними результатами в усі моменти втручання на основі коефіцієнтів кореляції Спірмена. Кілька асоціацій були значущими (p < {{0}}.05), але лише одна асоціація, виявлена ​​на 4-му тижні для групи SLR (Roseburia проти Lapses, rho=−0,40, q {{6 }}.04), залишався суттєвим після коригування для багатьох порівнянь (рис. S7).

Кілька асоціацій, які наближалися до значущих, були виявлені на 56-му та 71-му тижнях. Асоціації, виявлені в групі SLR на 56-му тижні, включали Faecalibacterium–RT (rho=0.62, q=0.07 ), Prevotella–OVP(rho=−0.55, q {{10}}.08), Gammaproteobacteria–OVP (rho=−0.58, q=0.07) і Faecalibacterium–OVP (rho=−0.64, q=0.05). На 71-му тижні Faecalibacterium позитивно корелювала з RT у контрольній групі (rho=0.62, q=0.07).

Враховуючи вік і стать, подальший аналіз зв’язку між кишковою мікробіотою та когнітивними показниками в кожен момент часу проводився за допомогою MFA для виявлення варіацій між окремими профілями груп лікування (додатковий файл S4).

Хоча індивідуальні варіації пояснювали великою кількістю кишкової мікробіоти в Dim 1 обох фаз (p < 0.0001), сильне розмежування між контрольною та SLR групами було відмічено в Dim 2 (рис. 6 і 7). Профіль контрасту між цими двома групами залежав від віку та OVP, які позитивно корелювали з Dim 2 (p < 0,0001), тоді як RT і пропуски мали негативну кореляцію (p < 0,0001).

Проте гаммапротеобактерії були найвпливовішими в описі індивідуальних варіацій у цьому вимірі на 61-му тижні (p < 0.0001). Рівень цієї бактерії був нижчим у групі SLR (координата=−1,35, p < 0,0001).

Незважаючи на неоднаковий розмір вибірки, МЗС вказало, що на різницю в профілях дітей шкільного віку в цьому нерандомізованому клінічному дослідженні більше вплинули вік і когнітивні показники, ніж кишкова мікробіота, що свідчить про менший внесок втручання в індивідуальні варіації в цьому дослідженні.

4. Обговорення

Наше дослідження не спостерігало значних змін в абсолютній чисельності кишкової мікробіоти після першого етапу втручання рису Сінлек у дітей шкільного віку. Однак значні відмінності між групами були відмічені на фазі II (тижні 61 і 71) для totalbacteria, Firmicutes, Bacteroidetes і Gammaproteobacteria.

Ми також спостерігали значні відмінності в когнітивних показниках між контрольною групою та групами втручання в обох фазах. Ми не виявили сильної кореляції між кишковою мікробіотою та когнітивними можливостями в будь-який момент часу.

Подальші аналізи показали, що в цій когорті рисове втручання Sinlek не сприяло варіаціям кишкової мікробіоти та когнітивних профілів дітей шкільного віку, оскільки на результати в основному впливав вік.

For more information:1950477648nn@gmail.com