Новий природний антиоксидантний біоматеріал з листя Cinnamomum Osmophloeum Kanehira пригнічує меланогенез і захищає від пошкодження ДНК

Контакт: ali.ma@wecistanche.com

Yung-Shu Ho 1, Jane-Yii Wu 1* і Chi-Yue Chang 2

Анотація:Cinnamomoum ​​osmophloeum Kanehira (COK) є місцевим видом дерев на Тайвані. Хімічні склади,антиоксидантнийдіяльність, грибтирозиназаДосліджено інгібування, пригнічення синтезу меланіну та захист від пошкодження ДНК гідрозолю з листя COK шляхом дистиляції з водяною парою. Ми виконали аналіз 1,1-дифеніл-2-пікрилгідразилового радикалу, хелатування іонів металів, відновної здатності та еквівалентної антиоксидантної здатності Trolox (TEAC) і визначили кореляції між загальним вмістом фенолів і антиоксидантною активністю. Результати показали, що антиоксидантні властивості гідрозолю КОК тісно корелюють із вмістом фенолів. Крім того, основні компоненти гідрозолю, тобто коричний альдегід і бензальдегід, мали дозозалежну антитирозиназну дію проти як монофенолазної, так і дифенолазної активності. ГХ-МС аналіз показав, що основними біоактивними компонентами гідрозолю були транс-коричний альдегід (87,7 відсотка), бензальдегід (7.0 відсотків) і цинамілацетат (5,3 відсотка). Крім того, ми виявили, що гідророзчин із присутністю бензальдегіду є більш потужним, ніж чистий коричний альдегід, і посилюєтирозиназаінгібіторна активність гідрозолю. У кінетичному аналізі графіки та повтори Лайнвівера–Берка показали, що гідрозоль COK є інгібітором змішаного типу. Крім того, ми виявили, що дуже низькі дози гідрозолю КОК пригнічують індукований меланоцит-стимулюючим гормоном синтез фактора транскрипції, пов’язаного з мікрофтальмією, що призводить до зниження синтезу меланіну в клітинах меланоми B16-F10. Ці результати продемонстрували, що виробництво гідрозолю з листя COK за допомогою парової дистиляції може забезпечити безпечне та ефективне джерелошкіра-відбілюваннязасоби для косметичнихі фармацевтичних застосувань, сантиоксидантний, антитирозиназну, антимеланогенезну та ДНК-захисну активність.

Ключові слова: антиоксидантнийдіяльність; Cinnamomoum ​​osmophloeum; гідрозоль;тирозиназаінгібіторна активність;відбілювання; Захисні ефекти від пошкодження ДНК

Натисніть, щобЦистанхестебло і продукт для відбілювання шкіри

1. Введення

Захворювання шкіри людини, такі як лентиго, пігментні плями, мелазма та злоякісні меланоми, пов’язані з утворенням і накопиченням меланіну [1]. Інгібування тирозиназ і меланогенезу може полегшити дерматологічні розлади та синдром гіперпігментації. Крім того, останнім часом глобальний ринок засобів для відбілювання шкіри та космецевтичних продуктів розширився, оскільки багато темношкірих людей віддають перевагу світлому кольору шкіри [2]. Тому ефективний і безпечнийтирозиназаі інгібітори синтезу меланіну вважаються важливими для профілактики захворювань пігментації та інших проблем здоров’я людини, пов’язаних із меланіном [3,4]. Крім того, токсичні речовини навколишнього середовища спричиняють різні окислювальні стреси для людей і можуть утворювати активні форми азоту або активні форми кисню (АФК) [5]. Надмірна кількість вільних радикалів і АФК пов’язана із запальними сигнальними шляхами, які зрештою призводять до пошкодження клітин, старіння, нервових розладів, діабету, атеросклерозу, запальних, серцево-судинних захворювань, раку та меланогенезу [6,7]. Про це свідчить кілька дослідженьантиоксидантиможе пригнічувати пошкодження від окисного тиску, діючи як поглиначі вільних радикалів або поглиначі АФК [7,8]. Крім того, як інгібітори генерації АФК, так і поглиначі АФК можуть зменшувати вироблення пігментів меланіну [9]. Зокрема,тирозиназає ключовим ензимом, який каталізує швидкість обмеження на перших двох етапах під час процесів синтезу меланіну [10], а пригнічення тирозинази є важливою метою для запобігання шкірним захворюванням і виробленнювідбілювання шкіриагенти [11]. Тому розробка природних антиоксидантів, які ефективно інгібують тирозинази для профілактики або лікування небажаної гіперпігментації шкіри та захисту від пошкодження ДНК, є важливою.

Cinnamomum osmophloeum Kanehira (COK) — місцевий вид кориці Тайваню, який багато разів використовується як китайська фітотерапія. Активні сполуки ефірних олій COK демонструють чудовий потенціал як фармакологічні антибактеріальні засоби [12]. Хоча попередні дослідження спиртових екстрактів листя COK продемонстрували антитирозиназну активність, майже всі ці дослідження були зосереджені на екстрактах етанолу або ефірних оліях COK. Крім того, не повідомлялося про кількісні та систематичні дослідженняантиоксидантнийвластивості,тирозиназаінгібуючу дію та пригнічення синтезу меланіну водними екстрактами (гідрозолем) листя COK. Таким чином, це дослідження було проведено для вивчення впливу гідрозолю COK на окислювальний стрес і меланогенез у клітинах меланоми B16F10 і захисту від пошкодження ДНК. Це дослідження є першим детальним звітом про хімічний склад іантиоксидантний, пригнічення тирозинази, пригнічення меланогенезу та захисна активність гідрозолю з листя COK при пошкодженні ДНК.

2. Матеріали та методи

2.1. Хімічні речовини та антитіла

Грибтирозиназа, бутильований гідрокситолуол (BHT), -токоферол, 6-гідрокси-2,5,7,8-тетраметилкроман-2-карбонова кислота (Trolox), трихлороцтова кислота (TCA), галова кислота, фериціанід калію, хлорид заліза, хлорид заліза, ферозин, 1,1-дифеніл-2-пікрилгідразил (DPPH),2,20-азино-біс-3-етилбензтіазолін{{14} } сульфонова кислота (ABTS), реактив Фоліна–Чокальтеу, L-тирозин і L-3,4-дигідроксифенілаланін (L-DOPA) були отримані від Merck Co. (Дармштадт, Німеччина). Усі хімічні речовини і розчинники, використані в дослідженні, були аналітичного чи високоефективної рідинної хроматографії. Антитіла проти асоційованого з мікрофтальмією фактора транскрипції (MITF) і -актину були отримані від Cell Signaling Technology (Денверс, Массачусетс, США) і Sigma Chemical Co. (Сент-Луїс, США), відповідно.

2.2. Приготування гідрозолю: екстракція з листя COK за допомогою дистиляції з водяною парою

Листя 13--річного дерева COK у Тайвані (№ 186, Yongping Road, Zhongliao Township, Nantou County, Taiwan) було висушено на повітрі. За допомогою м’ясорубки з нержавіючої сталі листя потім подрібнили в дрібний порошок (менше ніж 10 меш) і потім зберігали при кімнатній температурі. Потім 3,5 кг сухого порошку листя COK екстрагували за допомогою дистиляції з водяною парою протягом 4 годин. Цей процес повторювався чотири рази. За допомогою вакууму екстракт фільтрували, а потім, використовуючи роторний випарник, отримували сухий екстракт (рис. 1). Екстракт остаточно випарювали для отримання кінцевої маси.

2.3. Аналіз гідрозолю методом газової хроматографії/мас-спектрометрії (ГХ/МС).

Прилад Thermo-GC/MS із капілярною колонкою THERMO WaxMS із зшитою 5% феніл- 95% метилполісилоксану (60 м × 0.25 мм внутрішній діаметр, товщина плівки {{1 0}}.25 мкм) використовували з гелієм як газ-носій при постійній швидкості потоку 1,0 мл/хв. Колонку підтримували при 200 ◦C протягом 5 хвилин після введення, а потім нагрівали зі швидкістю 5 ◦C/хв до 260 ◦C. Чисту ефірну олію (1,0 мл) вводили у співвідношенні 1:100. Температури інжектора, транспортної лінії та джерела іонів становили 250 ◦C, 250 ◦C і 200 ◦C відповідно. МС-детектування проводили в режимі електронного удару при енергії іонізації 70 еВіонізації та струмі іонізації 60 мкА; прилад працював у режимі повного сканування в діапазоні 50–350 а.е.м. Сполуки були ідентифіковані шляхом порівняння часу утримування та індексів хроматографічних піків з піками автентичних еталонних стандартів, введених за тих самих умов. Шаблони фрагментації МС порівнювали з такими для чистих сполук, а базу даних мас-спектру шукали за допомогою бази даних MSspectral Національного інституту стандартів і технологій (NIST) [13].

2.4.Загальний вміст фенолів

Загальний вміст фенолів (TPC) екстрактів визначали за допомогою аналізу Фоліна-Чокальтеу, описаного раніше [14]. Коротко, зразки гідрозолю (100 мкл) змішували з 100 мкл аліквот реагенту Фоліна–Чокальтеу (10-кратне розведення) та 10 мкл аліквот карбонату натрію (10 відсотків, мас./об.). Після зберігання протягом 30 хв, поглинання вимірювали при 735 нм. TPC виражається як еквівалент галової кислоти (GAE) у мг на 100 г свіжого матеріалу.

2.5. DPPH аналізи поглинання вільних радикалів

Як описано раніше, за допомогою аналізу DPPH було визначено активність поглинання радикалів гідрозолю [15] з модифікаціями. Коротко, різні розведення зразків гідрозолю (75 мкл у трьох примірниках) додавали до 150 мкл аліквот DPPH (0.02 г/100 мл) і через 30 хв вимірювали абсорбцію при 517 нм. BHT використовували як позитивний контроль (0,5 мг/мл етанолу). Активність поглинання радикалів виражали як коефіцієнти інгібування (у відсотках) за допомогою наступного рівняння:

Коефіцієнт інгібування (відсоток)=[1 − (A/B)] × 100 відсотків

де А — абсорбція зразка гідрозолю, а В — абсорбція холостого зразка.

2.6. Дробові інгібуючі концентрації

Дослідження фракційних інгібуючих концентрацій (FIC) проводили, як описано раніше [16], з модифікаціями. Коротко, FeSO4 (20 мкл; 2 мМ) змішували з різними розведеннями гідрозольних зразків (200 мкл). Після додавання ферозину (40 мкл; 5 мМ) реакціям давали протікати протягом 10 хвилин, а потім вимірювали поглинання при 562 нм. Крім того, як позитивний контроль використовували 0,5 мг/мл етилендіамінтетраоцтової кислоти (EDTA). Відсоток інгібування утворення комплексу ферозин-Fe2 плюс розраховували за такою формулою:

Хелатний ефект металу (відсотки)=[1 − (A/B)] × 100 відсотків

де А — абсорбція зразка гідрозолю, а В — абсорбція холостого зразка.

2.7. Зменшення аналізів потужності

Відновну здатність гідрозолю COK визначали шляхом моніторингу відновлення Fe3 плюс до Fe2 плюс, як описано раніше [17], з модифікаціями. Коротко кажучи, до 50 мкл розведень гідрозолю додавали 50- мкл аліквоти фосфатного буфера (pH 6,6, 200 мМ) і 50- мкл аліквоти фериціаніду калію (1 відсоток, мас./об.). додано. Після інкубації при 50 ◦C протягом 20 хвилин додавали 50 мкл TCA (10 відсотків, мас./об.); і суміш центрифугували при 9,000 об/хв протягом 3 хв. Нарешті, 50 мкл супернатанту змішували з 50 мкл дистильованої води та 50 мкл хлориду заліза у воді (0,1 відсотка, мас./об.) і вимірювали поглинання при 700 нм проти холостого зразка через 10 хв часу реакції. Використаними позитивними контролями були бутильований гідрокситолуол (BHT) і -токоферол.

2.8. Аналіз еквівалентної антиоксидантної здатності Trolox (TEAC).

Антиоксидантактивності гідрозолю КОК оцінювали за раніше описаною методикою [15,18] з модифікаціями. Коротко, концентрований розчин катіон-радикалу ABTS (ABTS• plus ) розбавляли у фосфатно-сольовому буфері (pH 7,4) до кінцевої абсорбції 0.80 ± 0.05 при 734 нм. Після змішування (0,02 мл) зразка з 1 мл розчину ABTS плюс спостерігалося зниження поглинання при 734 нм через 5 хв. Trolox використовувався як стандарт, а гідрозольну активність виражали як TEAC шляхом побудови калібрувальних кривих Trolox. Значення молярного еквівалента TEAC зразків гідрозолю розраховували відповідно до зменшення абсорбції розчину Trolox. BHT і -токоферол використовували як позитивний контроль.

2.9. Вплив гідрозолю на інгібування тирозинази грибів

Грибтирозиназаактивність вимірювали за допомогою спектрофотометричного аналізу, як описано раніше, з модифікаціями [19]. Коротко, 20 мкл L-тирозину або 20 мкл L-DOPA в PBS (pH 6,8; 80 мкл) і 80 мкл PBS з досліджуваним гідрозолем або без нього додавали в 96-лункові мікропланшети, а потім 20 мкл грибної тирозинази (100 ОД/ мл) додавали. Після змішування та інкубації при 37 ◦C протягом 20 хвилин утворення (або споживання) допахрому в реакційній суміші визначали при поглинанні 475 нм. Як позитивний контроль використовували койєву кислоту, яка інгібує тирозиназу. Відсоток інгібування тирозинази розраховували наступним чином:

Інгібування (відсоток) ≡ {[(A − B) − (C − D)]/(A − B)} × 100 відсотків

де A вказує на поглинання з ферментом за відсутності зразка гідрозолю, B позначає поглинання без ферменту або зразка гідрозолю, C вказує на поглинання з ферментом, а поглинання гідрозолю та диндикату без ферменту, але з гідрозолем. Ми також підрахували 50 відсотківтирозиназаінгібуючі концентрації (IC50) зразків як такі, що пригнічують активність тирозинази на 50 відсотків.

2.10. Кінетичний аналіз інгібування тирозинази грибів

Реакційні суміші містили 20 мкл L-тирозину або L-DOPA (0.25 мг/мл) як субстрати, 100 мкл грибної тирозинази (20 одиниць/мл) у 0,2 М натрій-фосфатному буфері ( pH 6,8) і 80 мкл кожного зразка гідрозолю в загальному об’ємі 200 мкл. Аналіз проводили при 25 ◦C, і інгібіторну кінетику кожного зразка гідрозолю зтирозиназааналізували за допомогою графіків Лайнвівера–Берка. Реципрокне рівняння було використано для швидкої рівноваги від неконкурентного інгібування змішаного типу, як виражено в рівнянні (1) [20]. Значення Ki для зразків гідрозолю були оцінені на основі повторних графіків нахилу (Рівняння (2)). Значення Ki для гідрозолю були розраховані на основі графіка відсікання осі 1/v (Рівняння (3)),

де Vmax – максимальна швидкістьтирозиназаактивність, Ksis константа дисоціації субстрату (S) від фермент-субстратного комплексу (ES), Ki є константа дисоціації інгібітора [I] від фермент-інгібіторного комплексу та Ki є константа дисоціації інгібітора від фермент-субстрату -інгібіторний комплекс (ЕСІ).

2.11. Клітинна культура та аналіз життєздатності клітин

Клітини меланоми B16-F10 (BCRC60031) були отримані з Центру колекцій і досліджень біоресурсів (BCRC), Тайвань. Клітини B16-F10 культивували в середовищі Ігла, модифікованому Дульбекко (Gibco, Каліфорнія, США), що містило 10% FBS при 37 ◦C у 5% CO2. За допомогою трипсинізації клітини збирали. Життєздатність клітин вимірювали за допомогою 3-(4,5-диметилтіазол-2-іл)-2,5-дифенілтетразолійброміду (МТТ), як описано Лі [15]. ].

2.12. Вміст клітинного меланіну

Вміст меланіну вимірювали за допомогою методу, описаного Lee. [15]. Коротко, клітини B16-F10 культивували в 6-лункових планшетах із щільністю 0.8 × 105 клітин на лунку, а потім інкубували протягом 24 годин. Потім клітини обробляли 100-nM -меланоцитстимулюючим гормоном (-MSH), койєвою кислотою (позитивний контроль) і гідрозолем у різних концентраціях протягом 24 годин. Після двічі промивання PBS клітини лізували в буфері, що містив 100 мМ фосфату натрію (рН 6,8), 1% Triton X-100 і 0,1 мМ фенілметансульфонілфториду, і зберігали при -80 ◦C протягом 30 хв. Після збору клітин клітинний осад розчиняли в 1N NaOH, що містить 10 відсотків ДМСО, при 65 ◦C протягом 1 години. Після цього вимірювали поглинання при 405 нм.

2.13. Вестерн-блот

Клітини лізували, як описано в Розділі 2.11, і піддавали Вестерн-блоттингу на білок MITF з використанням антитіл проти MITF.

2.14. Аналізи захисту ДНК

Окислювальне пошкодження ДНК визначали згідно з перетворенням кільцевої суперскрученої неоплазмідної ДНК pCI в кільцеві або подальші деградовані форми за допомогою описаного раніше методу [21,22] з невеликими модифікаціями. Реакційні суміші об’ємом 20 мкл містили 2,5 мкл supercoiledpCI neo (150 нг/мкл), 10 мкл реакційного розчину Фентона, що містив 30 мМ перекису водню, 100-мкМ хлориду заліза та 100 мкМ аскорбінової кислоти в 20 мМ Трис-HCl буфері (pH 7,6) і 5 мкл гідрозолю (0,3325–5,32 мг/мл) або кверцетину (позитивний контроль; 250 мкг/мл). Реакційні суміші інкубували при 37 ◦C протягом 30 хвилин, а форми плазмідної ДНК розділяли на 0,7% агарозних гелях і фарбували за допомогою SafeView™ (Applied Biological Materials (ABM) Inc., Річмонд, Канада).

Напівкількісно визначитиантиоксидантнийактивності екстрактів, кількість суперскручених і розрізаних форм pCI neo кількісно визначали за допомогою приладу AlphaImager Mini (proteinsimple), а інтенсивність смуг на агарозних гелях визначали за допомогою програмного забезпечення Gelpro. Як негативний і позитивний контроль, неоплазміду pCI інкубували окремо та з сумішшю реагентів Фентона відповідно. Дані виражені як кількість суперскрученої ДНК відносно такої (100 відсотків) у негативному контролі. Захисні активності екстрактів розраховували за кількостями суперскрученої та розрізаної плазмідної ДНК за допомогою наступних рівнянь [23]:

Захист суперскрученої плазміди (відсотки) =інтенсивність суперскрученої формиpCI neo Інтенсивність смуги ДНК × 100

Захист розрізаної плазміди (відсоток) =інтенсивність розрізаної формиpCI neo Інтенсивність смуги ДНК × 100

2.15. Статистичний аналіз

Усі дані виражені як середнє ± стандартне відхилення (SD). Відмінності між методами лікування були визначені за допомогою t-критерію Стьюдента або ANOVA з наступним тестом Шеффе. Відмінності вважалися достовірними, коли p <>

3. Результати та їх обговорення

3.1. Ідентифікація летких сполук у гідрозолі

Вміст гідрозолів аналізували за допомогою ГХ/МС. Компоненти ідентифікували відповідно до часу утримування стандартів, а їх кількість визначали за площею піків елюентів (рис. 2). Як показано на малюнках 2A–D, транс-коричний альдегід, бензальдегід і цинамілацетат були основними сполуками в гідрозолі COK і були присутні при 87,7 відсотка, 7.0 відсотків і 5,3 відсотка відповідно. Евгенол раніше був знайдений в ефірних оліях C. verum у кількості 7,29 відсотка [24], але не був виявлений у нинішньому гідрозолі COK (рис. 2). Відмінності в процесах екстракції та методах аналізу можуть сприяти відмінностям у вмісті коричного альдегіду в ефірних оліях C. cassia [25].

3.2. Антиоксидантні властивості гідрозолю з листя COK

3.2.1. DPPH радикальна активність

На малюнку 3A активність гідрозолів поглинання радикалів DPPH від 1.06×10−2 до 5,32×10−1 мг/мл була між 5.04 відсоток ± 0,96 відсотка та 41,76 відсотка ± 2,50 відсотка відповідно. Ці дані вказують на дозозалежне поглинання радикалів гідрозолем COK. Для порівняння, позитивні контролі BHT і -токофероли поглинали 94,32% ± 0,08% і 93,82% ± 0,13% реакційноздатних радикалів DPPH, відповідно, при 0,5 мг/мл. Активність поглинання радикалів гідрозолю COK, швидше за все, зумовлена ​​коричним альдегідом (рис. 2). ). Багато досліджень показують, що фенольні сполуки та флавоноїди запобігають утворенню радикалів DPPH шляхом віддавання атомів водню. Таким чином, активність видів Cinnamomum щодо поглинання радикалів DPPH також може відображати дії як донора водню [26,27].

3.2.2. Хелатування іонів металів

Ми оцінили здатність гідрозолів до зв’язування Fe2 плюс 1,06 × 10–3 і 5,32 × 10–1 мг/мл, як показано на малюнку 3A. Хелатування металів гідрозольними компонентами незначно збільшувалося з концентрацією, але при 6 мг/мл було лише 37,3 відсотка хелатоутворюючої активності EDTA (рис. 3A).

3.2.3. Зниження потужності

Як показано на малюнку 3A, відновна здатність компонентів гідрозолю залежала від концентрації та була вищою, ніж у BHT і -токоферолу (0.22 ± 0.01 і {{9 }}.33 ± 0.15 відповідно) при 0,5 мг/мл. У попередніх дослідженнях відновна здатність сирих екстрактів гілок C. osmophloeum у фракціях BuOH була найвищою серед усіх фракцій і зростала лінійно з концентрацією [28].антиоксидантнийпотенціали різняться між сполуками в екстрактах, загальна антиоксидантна активність екстрактів сильно залежить від розчинника екстракції. Проте відновлювальна здатність (значення ОП {{0}}.7) водних екстрактів з гілок C. osmophloeum була подібною (значення ОП=0.66 ± 0.01) до такої для поточного C. osmophloeum hydrosols (рис. 3A), які були отримані за допомогою дистиляції з водяною парою. Відновлювальна здатність, як правило, пов’язана з наявністю відновників і антиоксидантною активністю, що відображає припинення вільнорадикальних ланцюгових реакцій шляхом забезпечення відновлювальних атомів водню. Відновлювальна здатність C. osmophloeum, ймовірно, зумовлена ​​наявністю гідроксильних груп у фенольних сполуках (рис. 2), які можуть діяти як донори електронів.

3.2.4. Тести TEAC

Значення TEAC цього гідрозолю збільшувалися при концентраціях, вищих за 5,32 × 10-3 мг/мл, і були вищими, ніж у контрольних сполук -токоферолу та BHT, як показано на малюнку 3A. Стерична доступність до радикального сайту ABTS plus є основний критерій активності в аналізах TEAC. Відповідно, фенільні групи нинішніх компонентів гідрозолю дещо менш утруднені, ніж у Trolox.

3.2.5. Кореляції між TPC та антиоксидантною активністю

Як показано на малюнку 3B, існує дуже значуща кореляція між TPC та активністю поглинання вільних радикалів DPPH при GAE від 1,75 ± 0.438 до 100.41 ± 1,581 мг/г . Коефіцієнти кореляції TPC з активністю поглинання вільних радикалів DPPH, активністю FIC, відновлювальною здатністю та TEAC становили 0.980, 0.925, 0.967 і 0.902 відповідно (Малюнок 3B). У сукупності ці дані демонструють, щоантиоксидантнийактивності гідрозолів COK тісно корелюють із вмістом фенолу.

3.3. Вплив концентрації гідрозолю COK на активність тирозинази

Ми визначили вплив концентрації гідрозолю COK на окислення L-тирозину та L-DOPA грибамитирозиназаі провели порівняння з активністю койєвої кислоти, яка є добре відомим інгібітором тирозинази (рис. 3C, D). Справжній гідрозоль потужно та залежно від дози інгібував L-тирозин- та L-DOPA-оксидазну активність тирозинази грибів (рис. 3C), але мав вищу інгібіторну активність щодо тирозинази в присутності субстрату L-тирозину (монофенолазна активність), ніж L-DOPA (дифенолазна активність). Значення IC5{{10}} койєвої кислоти щодо активності монофенолази та дифенолази становили 4.0 × 10−5 та 7,8 × 10−3 мг/мл (рис. 3C), відповідно, значно більше, ніж у поточного гідрозолю (7,96 × 10-4 мг/мл і 0,35 мг/мл відповідно; рис. 3D). Отже, для досягнення 90-відсоткової інгібіторної активності тирозинази (активності монофенолази) гідрозоль і койєва кислота були потрібні в концентраціях 0,52 мг/мл і 4,0 × 10-3 мг/мл відповідно, коли L-тирозин використовувався як субстрат (рис. 3C, D). ). Незважаючи на те, що інгібуючі ефекти тирозинази вимагають більш високих концентрацій гідрозолю КОК, ніж койєва кислота, потужна інгібуюча активність тирозинази була очевидною в цих експериментах.

різноманітнітирозиназапрепарати, методи аналізу активності, чистота та компоненти інгібітора могли внести свій внесок у відмінності в кінетиці інгібування ферментів [29]. Однак біологічна активність рослинних екстрактів залежить від їх біологічно активних компонентів, на які можуть впливати вид рослини, час збору врожаю, сезон, географічне походження, агротехнічні прийоми та методи вилучення. Інгібітори були ідентифіковані та охарактеризовані з природних джерел у багатьох нещодавніх дослідженнях, і взаємозв’язок між інгібіторною діяльністю та природними інгредієнтами добре встановлений (таблиця 1). Зокрема, багато альдегідів та інших сполук були виділені та охарактеризовані як інгібітори тирозинази. До них належать коричний альдегід, 2-гідрокси-4-метоксибензальдегід, анісовий альдегід, кумінальдегід, кумінова кислота, флавоноли, флавони та ізофлавани [4,19,30–37]. Нинішній гідрозоль містить 87,7% коричного альдегіду та 7,0% бензальдегіду, що свідчить про те, що коричний альдегід, а потім бензальдегід, є основною речовиною, відповідальною за інгібуючу дію гідрозолю на тирозиназу. Відповідно до таблиці 1 ми виявили, що гідрозоль із присутністю бензальдегіду є більш потужним ніж чистий коричний альдегід, і підсилюєтирозиназаінгібіторна активність гідрозолю. Було також підтверджено, що бензальдегіди пригнічують як дифенолазну, так і монофенолазну активність тирозинази грибів [38]. Інгібіторний механізм тирозинази інгібіторів типу бензальдегіду, імовірно, походить від їхньої здатності утворювати основу Шиффа з первинною аміногрупою у ферменті [33,39]. Додавання електронодонорної групи в пара-положенні бензальдегіду підвищує інгібіторну активність тирозинази, ймовірно стабілізуючи базу Шиффа.

3.4. Кінетичні режими інгібування тирозинази грибів гідрозолем COK

Було вивчено кінетичну поведінку гідрозолю на монофенолазну та дифенолазну активність тирозинази з використанням L-тирозину та L-DOPA як субстрату відповідно. Theтирозиназаінгібіторну кінетику гідрозолю аналізували за допомогою подвійних зворотних графіків Лайнвівера–Берка, як показано на малюнку 4. На рисунку 4A, B чотири лінії представляють неінгібований фермент (лінія 1) та інгібування трьома концентраціями (лінія 2 – лінія 4) гідрозолю, і ці лінії перетинаються ліворуч від осі 1/v вище осі 1/S. За неінгібованих експериментальних умов максимальна швидкість (Vmax) реакції окислення L-тирозину та L-ДОФА, що каталізується тирозиназою, становила {{10}}.055 ∆OD475/хв та 0,096 ∆OD475/хв без вмісту гідрозолю (рядок 1 на рисунку 4A, B) відповідно. Кінетичні параметри Km (постійна Міхаеліса) для грибатирозиназаотримані з plotus Lineweaver–Burk з використанням L-тирозину та L-DOPA як субстратів відповідно, показують, що Km становив 0.534 мг/мл та 0.511 мг/мл без вмісту гідрозолю (рядок 1 на малюнку 4A, B).

Чотири лінії, отримані від неінгібованого ферменту та від трьох різних концентрацій гідрозолю, перетинаються ліворуч від осі 1/v над віссю 1/S. Підвищення концентрації гідрозолю призвело до зниження Vmax і збільшення Km. Зокрема, коли L-тирозин використовувався як субстрат, підвищення концентрації гідрозолю призводило до появи кількох ліній із різними нахилами та перетинаннями, але вони перетиналися одна з одною у другому квадранті (лінії 1–4 на малюнку 4A). Подібні результати були отримані при використанні L-DOPA як субстрату (рядки 1–4 на малюнку 4B), що підтверджує твердження, що гідрозоль містить інгібітори тирозинази змішаного типу. Відповідно до інгібування змішаного типу компоненти гідрозолю, ймовірно, зв'язують вільний фермент і фермент-субстратний комплекс. Інгібування змішаного типу може виникати багатьма способами: інгібування гідрозолю може виникнути через те, що вони взаємодіють із наступним проміжним продуктом у паттерні реакції, але не з початковим фермент-субстратним комплексом [40]. Таким чином, ми визначили константи дисоціації (Ki та Ki, відповідно) для зв’язування інгібітора з вільним ферментом (E) і фермент-субстратним комплексом з використанням подвійних зворотних графіків і графіків нахилу та вертикального відсіку від концентрацій гідрозолю в присутності L-тирозину (Рис. 4C, D) або L- DOPA як субстрати (рис. 4E, F). Як показано на малюнку 4A, B, значення Ki, коли L-тирозин використовувався як субстрат, було приблизно в 1,28 рази нижчим, ніж у присутності L-DOPA, що вказує на більш ефективне інгібіторне зв’язування ферменту з L-тирозином, ніж з L-DOPA. Крім того, значення Ki було в 1,71 раза більше, ніж значення Ki для окислення L-DOPA, що вказує на те, що спорідненість компонентів гідрозолю до вільного ферменту сильніша, ніж спорідненість комплексу фермент-субстрат. Ці дані свідчать про те, що гідрозоль впливає на спорідненість фермент для L-DOPA, але не зв'язує активний центр. Крім того, значення Ki було майже таким самим, як Ki для окислення L-тирозину, що вказує на те, що змішані інгібітори є неконкурентними інгібіторами, які зв’язуються з вільним ферментом і фермент-субстратним комплексом з тією самою константою рівноваги за допомогою L- тирозин як субстрат (рис. 4A). Однак константи рівноваги зв’язування для вільного ферменту та фермент-субстратного комплексу, відповідно, відрізняються при використанні L-ДОФА як субстрату (рис. 4B), що вказує на те, що інгібітор змішаного типу (конкурентний і неконкурентний змішаний) може зв’язуватися не лише з вільний фермент, але також із фермент-субстратним комплексом, використовуючи L-DOPA як субстрат. Попередні дослідження також виявили, що ефірна олія C. cassia та коричний альдегід є інгібіторами змішаного типу [19]. Навпаки, транс-коричний альдегід, виділений з кори C. cassia, вказує на конкурентне пригнічення окислення L-DOPA грибамитирозиназа[32], тоді як коричний альдегід, виділений з кореня P. cernua було неконкурентним гальмуванням [35].

3.5. Залежні від концентрації ефекти концентрацій гідрозолю на меланогенез

Щоб перевірити вплив гідрозолю на життєздатність клітин і меланогенез у різних концентраціях ({{0}},0035–10,64 мг/мл), ми індукували меланогенез у клітинах меланоми B16-F10 за допомогою -MSH і порівняли ефекти використання койєвої кислоти як позитивного контролю (рис. 5). Результат цього аналізу життєздатності клітин показав, що гідрозоль не мав цитотоксичності в концентраціях 0,0035–1,064 мг/мл у клітинах меланоми B16F10 (рис. 5а). Оскільки інгібітори меланогенезу розробляються, безпека та ефективність мають бути найважливішими міркуваннями для багатьох застосувань. Однак обробка клітин меланоми B16F10 гідрозолем призвела до помітного зниження життєздатності клітин у концентраціях 5,32–10,64 мг/мл. За результатами досліджень проведено перевірку безпеки та ефективностівідбілювання шкірипродуктів у культурах клітин B16F10, 1,064 мг/мл є пороговою концентрацією для первинного скринінгу на основі клітин. Таким чином, концентрації 0,1064–1,064 мг/мл були використані для вивчення механізмів антитирозинази в клітинах меланоми B16F10 за допомогою гідрозолю.

Придушення меланогенезу обробкою гідрозолем у різних концентраціях визначали як відсоток вмісту меланіну в клітинах (рис. 5b). Ми також проаналізували рівні експресії MITF за допомогою вестерн-блоттингу (рис. 5c). У цих експериментах вміст меланіну та рівні експресії MITF залежно від дози пригнічувалися гідрозолем COK, що свідчить про те, що гідрозоль COK знижує вміст меланіну в клітинах шляхом пригнічення синтезу MITF.

3.6. Аналізи захисту ДНК

Добре відомо, що активні форми кисню пошкоджують ДНК і викликають старіння клітин і рак. Аналізи DNAnicking пропонують зручну безклітинну модельну систему для точного визначення виробництва радикалів, що пошкоджують ДНК [41]. У цих експериментах реакції Фентона виробляли гідроксильні радикали, які розщеплювали суперскручену плазмідну ДНК і перетворювали її на розрізану форму ДНК, яка має знижену електрофоретичну рухливість. [42,43]. Таким чином, щоб оцінити ДНК-захисну активність гідрозолю, ми інкубували pCI neo ДНК з реактантами Фентона [44]. Як показано на малюнку 6, форми плазмід із суперскручкою та розрізами чітко розрізняються за їх відносною електрофоретичною рухливістю на агарозному гелі; суперскручена ДНК рухалася найшвидше, а розрізана ДНК рухалася найповільніше, відповідно. Після обробки гідрозолем пошкодження ДНК було дещо зменшено при концентраціях гідрозолю 1,33–5,32 мг/мл із 28–58-відсотковим захистом суперскрученої форми відповідно (доріжки 6–8). При концентраціях гідрозолю 0.3325–0.665 мг/мл не спостерігалося жодного захисту порівняно з негативним контролем (доріжки 4 і 5). Навпаки, кверцетин ефективно захищав плазмідну ДНК від гідроксильних радикалів. опосередкована фрагментація, як було показано раніше [45]. Це перші дані, які демонструють захисну дію гідрозольних екстрактів C. osmophloeum Kanehira залишає на пошкодження ДНК реакціями Фентона. Ці ефекти, ймовірно, зумовлені наявністю поліфенольних сполук.

4. Висновки

COK давно використовується як лікарська рослина на Тайвані. Однак, наскільки нам відомо, це перший звіт, який демонструє, що гідрозолі, одержані шляхом дистиляції з водяною парою з листя COK, мають антиоксидантну активність, як це спостерігалося в аналізахантиоксидантнийактивності та пошкодження ДНК. Ми також показали, що цей гідрозоль пригнічує меланогенез. У аналізах ГХ/МС було виявлено, що основними сполуками в гідрозолі COK є коричний альдегід і бензальдегід, і ці агенти були потужними інгібіторами монофенолазної та дифенолазної активності тирозинази. Згідно з нашими оцінками кінетики інгібування тирозинази, гідрозоль COK продемонстрував залежне від дози інгібування активності L-тирозину та L-ДОФА-оксидази змішаного типу.тирозиназа. Справжні гідрозольні сполуки також пригнічували експресію білка MITF, що призводило до зниженого -MSH-індукованого синтезу меланіну.

Нарешті, безпека є головним фактором для інгібіторів тирозинази, особливо для тих, що використовуються в косметичних і харчових продуктах, які можна використовувати в регульованих кількостях. COK вже є їстівною та широко використовуваною природною добавкою для їжі та косметики. Крім того, коричний альдегід загалом визнано безпечним для споживання людиною. Гідрозоль КОК - чудовий природний біоматеріал, який має ефективність і безпекутирозиназаа також інгібіторну активність синтезу меланіну та потенціал захисту від пошкодження ДНК. Таким чином, ми вважаємо, що гідрозол COK можна використовувати як безпечний і ефективний засіб для депігментації для багатьох застосувань.