Наночастинки, націлені на нирки для збільшення щільності ниркової лімфи, знижують артеріальний тиск у мишей з гіпертонією
Nov 10, 2023
Анотація:Хронічне інтерстиціальне запаленняі ниркова інфільтрація активованих імунних клітин відіграють невід'ємну роль у гіпертензії. Лімфатичні шляхи регулюють запалення черезочищення імунних клітині надлишок міжтканинної рідини. Раніше ми демонструвалипосилення ниркового лімфангіогенезузапобігає гіпертензії у мишей. Ми припустили, що цілеспрямована доставка фактора росту судинного ендотелію-C (VEGF-C) у нирки за допомогою наночастинок може індукувати нирковий лімфангіогенез, знижуючи артеріальний тиск у мишей з гіпертонією. Наночастинку, націлену на нирки, заповнювали специфічною формою VEGF-C-3-рецептора VEGF і вводили мишам із гіпертензією, спричиненою ангіотензином II або гіпертензією, спричиненою LNAME, кожні 3 дні. Миші, яким вводили наночастинки, показали збільшення щільності та ширини ниркових лімфатичних судин порівняно з мишами з гіпертонією, яким вводили лише VEGF-C. У мишей, які отримували наночастинки, спостерігалося зниження систолічного артеріального тиску, зниженняпрозапальні ниркові імунні клітинита збільшення фракційної екскреції натрію з сечею. Наші результати показують, що фармакологічне розширення ниркової лімфатичної системи знижує артеріальний тиск і пов’язане зі сприятливими змінами вімунні клітини нирокіпідвищена екскреція натрію.
Ключові слова:нирка; лімфатичні;запалення; імунітет; гіпертонія
ОТРИМАЙТЕ ТРАВ’ЯНИЙ СОСТАВ ЦИСТАНШИ ДЛЯ НИРОК
1. Введення
Майже 1 з 2 дорослих жителів США має гіпертензію, і у багатьох пацієнтів вона неконтрольована [1]. Незважаючи на покращену освіту, зусилля громадської охорони здоров’я та призначені ліки, приблизно 30–60% пацієнтів з гіпертонією не можуть досягти ідеального артеріального тиску. Це прикро, оскільки зниження систолічного артеріального тиску навіть на 10 мм рт.ст. значно знижує ризики для здоров’я та покращує результати [2]. Потрібні додаткові варіанти лікування, щоб допомогти цій популяції з гіпертонією знизити артеріальний тиск, в ідеалі, до нормотензивного діапазону.
Інфільтрація імунних клітин нирок, запалення та затримка натрію тісно пов’язані з гіпертензією [3–5]. Лімфатичні судини транспортують рідину, електроліти, клітини та білки з інтерстиціального простору до дренуючого лімфатичного вузла, а потім назад до кровообігу [6,7]. Лімфангіогенез, пов'язаний із запаленням, спостерігається при гострому ураженні нирок і прихронічні запальні захворюванняяк отдіабетична нефропатіяіниркова карцинома[8]. В анзапальний стан, збільшення лімфатичних шляхів намагається допомогти з видаленням імунних клітин, білків і рідини з органу. Раніше ми повідомляли, що лімфангіогенез також відбувається в нирках як компенсаторна відповідь у різних моделях гіпертензії [9–11]. Однак цього компенсаторного збільшення ниркової лімфатичної системи було недостатньо для усунення запалення та гіпертензії. Генетично індукований нирково-специфічний лімфангіогенез у мишей запобігав розвитку солечутливої гіпертензії, інгібування оксиду азоту (L-NAME)-індукованої гіпертензії (LHTN) та ангіотензин-індукованої гіпертензії (A2HTN), і це було пов’язано зі зниженням накопичення ниркових імунних клітин і збільшення екскреції натрію [9,11,12]. Крім того, генетична індукція нирково-специфічного лімфангіогенезу у мишей послаблювала наявну LHTN, і це супроводжувалося збільшенням екскреції натрію [12].
Тут ми хотіли розробити потенційну трансляційну терапію, яка б спеціально націлювалася на нирки та сприяла лімфангіогенезу для зниження артеріального тиску при гіпертонічних станах. Ми використали технологію наночастинок для доставки лімфатичних факторів росту на основі попередніх звітів про наночастинки, націлені на нирки [13–15]. Існують інші системи доставки ліків, що використовують наночастинки, і всі вони призначені для підвищення ефективності, специфічності та біодоступності. Наночастинки можуть бути сконструйовані таким чином, щоб демонструвати унікальні фізико-хімічні властивості, такі як розмір (50~200 нм), форма та хімічний склад поверхні, і вони можуть бути обладнані для перенесення одного або кількох діагностичних та/або терапевтичних агентів, вивільнення їх через зовнішні тригери, такі як температура , рН і ферменти. Крім того, інкапсуляція цих терапевтичних або діагностичних агентів у наночастинки дозволяє їм збільшити їх системний період напіврозпаду, і, таким чином, вони можуть бути значно локалізовані в цільовій області. В даний час існують різні наночастинки, включаючи міцели, ліпосоми, наносфери, нанотрубки, нанокапсули, кубосоми та гідрогелі на основі їх морфології. Тут ми протестували як міцели, так і наночастинки ліпосом, щоб визначити, що було більш ефективним.
Наша гіпотеза полягала в тому, що наночастинка, націлена на нирки, доставляє пролімфангіогенний фактор росту, специфічну ізоформу рецептора судинного ендотеліального фактора росту-3 (VEGFR-3) фактора росту судинного ендотелію C (VEGF-C) , збільшить щільність ниркової лімфи та знизить артеріальний тиск у самців і самок мишей з A2HTN або LHTN. Ми також припустили, що зниження артеріального тиску буде пов’язане зі зниженням прозапальних імунних клітин нирок, збільшенням протизапальних імунних клітин нирок і збільшенням екскреції натрію. Через тривалий час для індукції чутливої до солі гіпертензії та обмежену кількість ін’єкцій хвостової вени мишам ця модель не використовувалася в поточному дослідженні
2. Матеріали та методи
2.1. Розробка та характеристика наночастинок
Блок-сополімер PLGA-PEG-фолат був придбаний у PolySciTech (Вест-Лафайєт, Індиана, США), а сертифікат аналізу, що демонструє ЯМР, FTIR-аналіз та GPC, можна побачити на малюнку S1. Використовуючи 50 мг PLGA-PEG-фолатного блок-сополімеру, 10 мг барвника Coumarin 6, 10 мг FITC-овальбуміну або 1 мг VEGF-C інкапсулювали в наночастинки за допомогою методу діалізу для створення міцел наночастинка 1 (NP1). Зокрема, препарат і полімер розчиняли в диметилсульфоксиді (ДМСО), і розчин переносили в діалізну мембрану (MWCO 100, 000). Діаліз проводили протягом 24 годин проти DI води. Після цього водний розчин частинок центрифугували та обробляли ультразвуком для концентрації частинок. Для створення ліпосомальних наночастинок ми використовували кілька ліпідних компонентів, включаючи DSPC (120 мг), холестерин (16 мг), DSPE-PEG-фолат (24 мг) і барвник кумарин 6 (10 мг) або FITC-овальбумін (10 мг). . Спочатку всі вищезазначені компоненти розчиняли в DCM (10 мл), а потім DCM видаляли через потік повітря, щоб утворити тонку плівку на поверхні скляних флаконів. Потім до тонкої плівки додали 10 мл PBS, щоб отримати ліпосомну наночастинку 2 (NP2). Розмір наночастинок визначали методом динамічного розсіювання світла (DLS) за допомогою Zetasizer (Malvern Panalytical, Malvern, UK). Концентрацію зразка підтримували на рівні 0,5 мг/мл. Обсяг інкапсуляції барвника кумарину 6 було отримано з вимірювання його поглинання шляхом розчинення 100 мкл наночастинок у 900 мкл ДМСО, що вивільнило кумарин 6 у розчин ДМСО.
Потім вимірювали поглинання при 444 нм. Використовуючи попередньо виміряну калібрувальну криву поглинання кумарину 6 відповідно до його титрованої концентрації, було розраховано концентрацію інкапсульованого кумарину 6 (NP1: 5 ± 0,35 мг і NP2: 4 ± {{10 }}.89 мг для кумарину 6). Використовуючи попередньо виміряну калібрувальну криву поглинання FITC-овальбуміну відповідно до його титрованої концентрації, було розраховано концентрацію інкапсульованого FITC-овального альбуміну (4 ± 0,51 мг). Обсяг інкапсуляції VEGF-C у NP визначався за допомогою ELISA і становив ~500 ± 17 мкг. Усі наночастинки були покриті фолатами, які націлювали їх на проксимальні канальці нирок, враховуючи високу експресію фолатних рецепторів. Схему збірки NP можна побачити на малюнку S2
Профілі вивільнення кумарину 6 або FITC-овальбуміну вивчали за допомогою мембранного трубкового діалізу. Один мл розчину наночастинок додавали в діалізну трубку (Cutoff MW 3500), а потім занурювали в 10 мл PBS, що містить 0,5% об’ємний розчин Tween 80. На даний час носії були зібрані та замінені. Інтенсивність флуоресценції зібраних зразків вимірювали при Ex/Em=444/500 нм (кумарин 6) або Ex/Em=488/530 нм для FITC-овальбуміну за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів. Кумулятивний % вивільнення як кумарину 6, так і FITC-овальбуміну з наночастинок фолату можна побачити на малюнку S3.
Для дослідження трансмісійної електронної мікроскопії (TEM, JEOL JEM-2010, Японія) суспензії зразків опускали на мідну сітку з вуглецевим покриттям і висушували під вакуумом. Потім сітку спостерігали під трансмісійним електронним мікроскопом JEOL при прискорювальній напрузі 200 кВ. Для визначення біорозподілу in vivo 100 мкл кожного NP1 (10 мг/мл) або NP2 (10 мг/мл) вводили самкам мишей C57BL/6J (n=3) через хвостову вену. Сигнали флуоресценції кумарину 6 реєстрували при Ex/Em=444/500 нм. Через дванадцять годин після ін'єкції тварин піддавали евтаназії та відбирали кожен орган. Зібрані органи сканували за допомогою сканера In Vivo FX Pro для кількісного визначення розподілу NP. Усі процедури, проведені на мишах, були схвалені Техаським університетом A&M IACUC відповідно до Керівництва NIH щодо догляду та використання лабораторних тварин.
2.2. миші
Миші C57BL/6J дикого типу були придбані в Jackson Laboratories (Бар-Харбор, Мен, США). Самцям і самкам мишей віком 10–14 тижнів хірургічно імплантували під інгаляційним ізофлураном (1,5–5%) анестезією осмотичні міні-насоси (Alzet, модель 1004, Купертіно, Каліфорнія, США), що містять ангіотензин II (490 нг/кг/хв; BACHEM, Торранс, Каліфорнія, США) (A2HTN), а потім місцево лідокаїном. Іншій групі самців і самок мишей давали L-NAME (Sigma, St. Louis, MO, USA) у питній воді (0,5 мг/мл) протягом усього експерименту (LHTN). Через 2 дні гіпертонія була підтверджена вимірюванням артеріального тиску в манжеті хвоста в усіх групах. Потім мишей рандомізували та вводили у хвостову вену або міцелярну наночастинку, наповнену VEGFR-3-специфічним мутантом VEGF-C (VEGF C c156s) [16], або лише вільний білок VEGF-C кожні 3 дні протягом курс 16 днів (4 загальні ін’єкції хвостової вени). Цей графік ін’єкцій був змодельований на основі попередньої роботи [17] і дозволив достатній час для ремоделювання судин на рівні, достатньому для впливу на артеріальний тиск. Крім того, 3-денний період відпочинку подовжив життя крихких мишачих хвостових вен, зберігаючи при цьому стабільність пролімфангіогенного сигналу. Навіть після періоду відновлення хвостові вени витримали лише 5 ін’єкцій, перш ніж вони зазнали непоправної шкоди. Усіх мишей умертвляли через 16 днів після початкової ін'єкції. Мишей піддавали евтаназії перфузією тканин під глибокою анестезією ізофлураном, а потім дислокацією шийки матки перед збором тканин. Усі процедури, проведені на мишах, були схвалені Техаським університетом A&M IACUC відповідно до Керівництва NIH щодо догляду та використання лабораторних тварин.
2.3. Кров’яний тиск
Систолічний артеріальний тиск (САТ) вимірювали в різні моменти часу за допомогою хвостової манжети. Для всіх вимірювань використовували неінвазивну систему вимірювання артеріального тиску IITC Life Science для мишей (IITC Inc., Woodland Hills, CA, США). Артеріальний тиск вимірювали після 30-хвилинного періоду акліматизації у визначеному тихому місці. За цей час нагрівальній камері та камерам обмеження дозволили нагрітися до 34 ◦C. Мишей обережно завантажували в камери для утримування відповідного розміру та залишали для акліматизації в камері зігрівання протягом 5 хвилин перед вимірюванням САТ. Вимірювання САТ було отримано з відстеження тиску двома незалежними дослідниками.
2.4. Збір та вимірювання сироватки та сечі
Збір сироватки та сечі та вимірювання: мишей поміщали в метаболічні клітини (Hatteras, Cary, NC, США) і давали акліматизуватися протягом ночі. Після акліматизації сечу збирали протягом 24 годин, завершуючи евтаназією. Вимірювали зібрану сечу. Кров збирали під час евтаназії через лівий шлуночок, а сироватку виділяли для подальших заходів. Сироватку та сечу аналізували за допомогою капілярного електрофорезу на натрій з використанням DxC 700 AU Chemistry Analyzer (Beckman Coulter, Бреа, Каліфорнія, США) та методом прямої потенціометрії на креатинін з використанням системи капілярного електрофорезу P/ACE MDQ Plus (Sciex, Redwood City, CA) , США). Ці вимірювання використовували для розрахунку екскреції із сечею, фракційної екскреції натрію (FENa) і кліренсу креатиніну.
2.5. Імунофлюоресценція
Під час евтаназії нирки збирали, розрізали сагітально навпіл і фіксували в 10% буферному розчині формаліну (Sigma, St. Louis, MO, USA) протягом 48 годин. Після фіксації половинки нирок промивали 100% етанолом і заливали парафіном. Половинки нирок розрізали на зрізи 5–7 мкм, які депарафінували, повторно гідратували та пермеабілізували 0,1% розчином Тритону (BioRad, Hercules, CA, США). Тканина була заблокована 10% розчином AquaBlock (EastCoastBio, North Berwick, ME, США) перед імунологічним міченням маркерами лімфатичних ендотеліальних клітин LYVE-1 або подопланіном (козячий поліклональний; R&D Systems, Міннеаполіс, Міннесота, США) протягом ночі інкубація при 4 ◦C. Для візуалізації лімфатичних судин використовували вторинні антитіла Alexafluor 488 або 594 (Life Technologies, Карлсбад, Каліфорнія, США). Зразки інкубували з належним чином кон'югованими вторинними антитілами протягом години при кімнатній температурі. Негативні контролі інкубували лише з вторинним антитілом. Усі мічені слайди монтували за допомогою реагенту ProLong Gold проти вицвітання, що містить DAPI (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США). Для отримання зображень використовували систему флуоресцентної мікроскопії Olympus BX51 з камерою Olympus Q5. Зображення були зроблені зі збільшенням 40× за допомогою програмного забезпечення для обробки зображень Olympus CellSens (Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan). Ті самі методи були використані для зображення лімфатичних судин серця, печінки, легенів і шкіри (10- або 20-кратне збільшення).
2.6. Імунофлюоресценція нирок
Кількісна оцінка З кожного зрізу нирки було зібрано 5–7 зображень у 20× із заздалегідь визначених ділянок, загалом уникаючи дефектів тканини, незначних чашечок і великої кількості клубочків. ImageJ використовувався для збору значень площі, що вимірюють загальну кількість пікселів подопланін+ після встановлення порогового значення для позитивного ендотелію.
2.7. Кількісне визначення максимальної ширини ниркових лімфатичних судин
З кожного зрізу нирки були зібрані зображення всіх пов’язаних з артеріями лімфатичних судин у корі головного мозку у 20×. Лімфатичні судини ідентифікували за наявністю фарбування подопланіном. ImageJ використовувався для збору довжини в пікселях найширшої точки всіх лімфатичних судин, що містять просвіт.
2.8. Проточна цитометрія
Під час евтаназії збирали нирки та видаляли капсули. Тканина була ретельно подрібнена і розщеплена в буфері, що містить колагеназу D (2,5 мг/мл, Roche Sigma, Сент-Луїс, Міссурі, США) і Dispase II (1 мг/мл, Sigma) при 37 ◦C протягом 1 години. Переварені зразки фільтрували та промивали через фільтри 100 і 40 мкм. Потік центрифугували для виділення клітинних компонентів, а еритроцити лізували в NH4Cl/EDTA. Спленоцити були виділені подібним чином для використання в якості контролю антитіл і для стробування прямого чи бічного розсіювання розміру та форми імунних клітин. Ниркові клітини ресуспендували в 0,1% розчині FBS. Щоб запобігти неспецифічному зв’язуванню Fc, зразки інкубували з антитілом проти CD16/CD32 миші (BD Pharmingen, Сан-Хосе, Каліфорнія, США) протягом 10 хвилин на льоду. Потім клітини інкубували з флуоресцентно-кон’югованими антитілами проти CD45, F4/80, CD11c і CD3e і фільтрували через інший стерильний фільтр 40 мкм. Усі антитіла були придбані в BD Biosciences. Описову панель див. в Інтернет-таблиці S1. Для збору даних використовувався проточний цитометр BD LSR Fortessa X-20 із програмним забезпеченням FACS DIVA (BD Biosciences, Сан-Хосе, Каліфорнія, США). Популяції до 500 000 клітин були проаналізовані за допомогою FlowJo v10.6.2.1 (FlowJo, LLC, Ashland, OR, USA). Популяції CD3e+ кількісно оцінювали в межах воріт CD45+. Популяції CD3e PacBlue+ були негативними для флуорофорів PE та PerCP-Cy5.5. Популяції F4/80+ і CD11c+ були кількісно визначені в межах CD45+/CD3e-gate (Малюнок S4). Ці популяції були негативними для флуорофорів PacBlue, APC і APC-Cy7. Результати виражені у відсотках від загальної кількості CD45+ клітин на нирку. Стратегію стробування можна знайти на малюнку S4. Інформацію про антитіла можна знайти в таблиці S1.
2.9. Статистика
Результати представлені у вигляді точкових графіків і середніх значень або середнього значення ± SEM. Відмінності між 2 групами оцінювали за 2-хвостим непарним t-критерієм Стьюдента, а між 3 або більше групами — за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу з наступним тестом Стьюдента–Ньюмена–Кейлза. Для всіх порівнянь було встановлено рівень значущості 0.05. Усі статистичні аналізи проводили за допомогою програмного забезпечення SigmaPlot 10 (Systat, Сан-Хосе, Каліфорнія, США).
Служба підтримки Wecistanche - найбільшого експортера cistanche в Китаї:
Електронна адреса:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Тел.:+86 15292862950
Зверніться в магазин, щоб дізнатися більше про технічні характеристики:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
