Видалення п'яти амінокислот у NKCC2 мишей C57BL/6 впливає на аналіз фосфорилювання NKCC2, але не впливає на функцію нирок
Feb 19, 2022
ВСТУП
Товста висхідна кінцівка (TAL) ссавцівниркамає вирішальне значення для контролю об’єму позаклітинної рідини, концентрації в сечі, гомеостазу кальцію (Ca 2 plus ) і магнію (Mg 2 plus ), а також балансу pH. 1 Основним шляхом транспортування Na плюс у TAL є котранспортер Na плюс - K плюс - 2Cl − (NKCC2), який спеціально інгібується петльовими діуретиками. 1 Котранспорт іонів Na plus, K plus та 2Cl- через NKCC2 є електронейтральним, але залежить від електрогенної секреції K plus через апікальний нирковийзовнішній мозковий К плюс канал ROMK. 2 Взаємодія NKCC2 з ROMK створює електрохімічний градієнт позитивного просвіту, який посилює реабсорбцію Na plus і керує парацелюлярним транспортом Ca 2 plus і Mg 2 plus. 3 Значення NKCC2 для TAL іфункції нирокприкладом є синдром Барттера I типу, генетичний розлад, спричинений мутаціями втрати функції в NKCC2, що проявляється важкимнирковийвтрата солі та рідини, гіпокаліємічний метаболічний алкалоз і гіперкальціурія. 3
NKCC2 є членом сімейства носіїв розчиненої речовини 12 (Slc12) мембранних транспортних білків, які також включають повсюдно експресований NKCC1 і специфічний для дистальних звивистих канальців (DCT) котранспортер Na plus - Cl − (NCC). 2 Активність NKCC2 позитивно корелює з фосфорилюванням котранспортера за кількома залишками серину та треоніну на N-кінцевому хвості цитоплазми. 4 Амінокислотні послідовності, що оточують ці сайти фосфорилювання, є висококонсервативними та демонструють високий ступінь подібності між NKCC2, NKCC1 та NCC. 2 Фосфорилювання NKCC2 стимулюється кількома гормональними та негормональними шляхами. Такі гормони, як аргінін-вазопресин (AVP) і ангіотензин II (ANGII), стимулюють NKCC2 через збільшення виробництва цАМФ і активації протеїнкінази А (PKA). Вважається, що 5 PKA безпосередньо фосфорилює NKCC2 на Ser126, що посилює екзоцитоз везикул, що містять NKCC2, і, отже, велику кількість транспортера в апікальній плазматичній мембрані. 6 Подібним чином зміни у внутрішньоклітинних концентраціях хлориду регулюють фосфорилювання NKCC2. Знижена міжклітинна концентрація Cl- стимулює безнолізин(K) кінази WNK1 і WNK4 до фосфорилювання та активації наступних кіназ Ste20-, пов’язаних з проліном-аланінбагатою кіназою (SPAK) або кіназою, що реагує на окислювальний стрес (OXSR1). ). 7- 9 Після зв’язування з мотивом «RFxV» у NKCC2 ці кінази потім фосфорилюють NKCC2 за двома залишками треоніну (T96 і T101). 2 Дефосфорилювання цих залишків опосередковується фосфатазою кальциневрином, підкреслюючи, що NKCC2 є мішенню для кількох сигнальних шляхів. 10
Щоб вивчити функцію NKCC2, кілька груп, включаючи нашу, розробили фосфоформ-специфічні антитіла проти Thr96 та/або Thr101. 11- 17 Антитіла використовували для оцінки фосфорилювання NKCC2 у гетерологічних системах експресії 7, 11, 17, 18, 19, 20 і на тваринних моделях, включаючи щурів 10, 21, 22, 23, 24, 25 і мишей. 14,15,16,17,19,26,27 Однак, використовуючи наше антитіло pT96/101 NKCC2, ми отримали суперечливі результати в наших різних моделях мишей. Хоча ми виявили сильні сигнали pNKCC2 у нирках мишей із генетичним фоном 129Sv, ми не отримали надійних сигналів pNKCC2 у нирках мишей C57BL/6, але спостерігали перехресну реактивність антитіл pNKCC2 із pNCC. Інші лабораторії, в тому числі лабораторії JA McCormick і AA McDonough (особисте повідомлення), зробили подібні спостереження. 18,28,29 Крім того, були описані разючі відмінності штамів у мишей длянирковийфункції 30, включаючи значно нижчу сечу Ca 2 плюс екскрецію у C57BL/6 порівняно з мишами 129Sv. 31 Тому ми припустили, що миші C57BL/6 експресують генетичний варіант NKCC2, який впливає на фосфорилювання NKCC2 і, можливо,функції нирокщо пояснює спостережувані відмінності деформацій. Наступне дослідження було розроблено для систематичної перевірки цієї гіпотези.
Ключові слова:іонний гомеостаз, нирки, NKCC2, фосфорилювання, штамові відмінності
РЕЗУЛЬТАТИ
2.1|Миші C57BL/6 мають делецію п’яти амінокислот у NKCC2, що заважає виявленню фосфорильованого NKCC2Спочатку ми вирівняли для кількох видів опубліковані N-кінцеві амінокислотні послідовності (ідентифікатори транскрипції в таблиці S1) NKCC2 і NCC (рис. 1A, B відповідно), які відповідають епітопам, розпізнаним антитілами проти pNCC і pNKCC. (Малюнок 1C). Вирівнювання підтвердило високий ступінь збереження сайтів фосфорилювання NKCC2 і NCC 7, що, ймовірно, пояснює перехресну реактивність антитіл pNKCC2 і pNCC, яку спостерігали ми та інші. 18, 28, 29 Цікаво та узгоджується з нашою гіпотезою, що вирівнювання також знову виявило досі не оцінену делецію п’яти амінокислот у послідовності NKCC2 мишей C57BL/6 (ΔF97- T101) (Малюнок 1A) . Секвенування ДНК двох різних мишачих колоній C57BL/6, які зберігалися в лабораторії Джексона в США або лабораторіях Janvier у Франції, підтвердило делецію нуклеотиду в екзоні 2 C57BL/6 NKCC2, що відповідає згаданій вище делеції амінокислот (рис. S1). , Таблиця S2).
Щоб охарактеризувати вплив видалення п’яти амінокислот на імунодетекцію загального та фосфорильованого NKCC2, ми систематично досліджували нирки мишей C57BL/6 та 129Sv за допомогою імуногістохімії та імуноблотингу. Імунофлуоресценція з антитілом проти загального NKCC2 показала сильний флуоресцентний сигнал в апікальній плазматичній мембрані TAL мишей 129Sv і C57BL/6. Проте наше раніше розроблене антитіло pT96/T101 NKCC2 продемонструвало сильне апікальне мічення TAL лише у мишей 129Sv, тоді як TAL мишей C57BL/6 мали дуже слабке імунне фарбування (рис. 1D). Відповідно до цього, Вестерн-блот аналіз виявив сильну смугу для загального NKCC2 в обох лініях мишей, тоді як антитіло pT96/T101 NKCC2 виявило сильну смугу очікуваного розміру (170 кДа) лише у мишей 129Sv (рис. 1E). Натомість нирки мишей C57BL/6 виявили смугу при 130 кДа, що відповідає очікуваному розміру NCC (рис. 1E). Подібні результати були отримані з іншими антитілами, які раніше використовувалися для дослідження фосфорилювання NKCC2 (рис. S2). Антитіло pT212/T217 NKCC1 R5 11 показало на додаток до сигналу pNCC слабкий сигнал очікуваного розміру для pNKCC2 (рис. S2). Імунореактивна смуга для pNKCC2 стала більш інтенсивною, коли вона була свіжоюниркавикористовувалися лізати. Використання буфера лізису з детергентами (буфер RIPA) не покращило, але зменшило інтенсивність сигналу (рис. S3).
МАЛЮНОК 1. Антитіло pT96/T101 NKCC2 не виявляє видимого сигналу pNKCC2 у мишей C57BL/6. A, вирівнювання послідовності амінокислот NKCC2 різних видів і двох штамів мишей 129Sv і C57BL/6. Ідентифікатори послідовності NKCC2 для різних видів наведено в таблиці S1. Висококонсервативна ділянка, що відповідає мишачому Thr96 до мишачого Thr101, позначена сірим кольором. B, Вирівнювання послідовності амінокислот NCC у різних видів. Ідентифікатори послідовності NCC для різних видів наведено в таблиці S1. C, Список епітопів широко використовуваних і опублікованих антитіл, що розпізнають pT53 або pT58NCC, а також pNKCC2 у консервативному локусі навколо Thr96 до Thr101. D, Імунне фарбування загального та pT96/T101 NKCC2 у послідовних кріозрізах мишей із фоном 129Sv та C57BL/6. Масштаб=50 мкм. E, Імуноблот загального та pT96/T101 NKCC2 мишей із фоном 129Sv та C57BL/6. Значення є середніми значеннями ± SEM, n=5 мишей на групу, зелені стрілки вказують на конкретні смуги, тоді як червоні стрілки вказують на неспецифічні смуги. Маркери молекулярної маси включені. Загальна смуга та смуги pT96/T101 NKCC2 очікуються на рівні 170 кДа. F, Імуноблоти для загального та pT96/T101 NKCC2, загального та pT53 та pT58 NCC у мишей з NCC WT та NCC з нокаутом (KO) різного походження. Зелені стрілки вказують на певні смуги, тоді як червоні стрілки вказують на неспецифічні смуги. Маркери молекулярної маси включені. Загальні смуги та смуги pT58 і pT53 NCC очікуються на рівні 130 кДа, загальні смуги та смуги pT96/T101 NKCC2 очікуються на рівні 170 кДа
Щоб перевірити, чи справді наше антитіло pT96/T101 NKCC2 перехресно реагує з фосфорильованим NCC у мишей C57BL/6, ми дослідилиниркалізати мишей дикого типу 129Sv і C57BL/6 і мишей з нокаутом C57BL/6 NCC з антитілами проти загального NKCC2, pT96/T101 NKCC2, загального NCC і фосфорильованого NCC (pT53 і pT58 NCC) (рис. 1F). Антитіло pT96/T101 NKCC2 і антитіла проти загального NCC і pNCC не виявили смуг у 130- 170 кДа у мишей з нокаутом C57BL/6 NCC (рис. 1F). Цікаво, що імуноблот, а також додаткові імуногістохімічні експерименти (Рисунок S4) показують, що антитіла pNKCC2 не тільки перехресно реагують з NCC у мишей C57BL/6, але й наші антитіла pNCC (pT53 NCC і pT58 NCC) перехресно реагують з NKCC2 у 129Sv мишей у використовуваних концентраціях.
Екскреція кальцію та магнію з сечею відрізняється у мишей 129Sv та C57BL/6
Щоб визначити, чи може делеція (F97- T101) у NKCC2 асоціюватися з фізіологічними відмінностями між мишами 129Sv і C57BL/6, ми порівняли споживання води, рівні іонів у плазмі, рідину з сечею та екскрецію іонів між двома лініями мишей. Як підсумовано в таблиці 1, більшість оцінених параметрів не відрізнялися між штамами. Проте миші C57BL/6 показали нижчу екскрецію Ca 2 plus із сечею та вищу екскрецію Mg 2 plus із сечею, ніж миші 129Sv. Рівні Ca 2 plus і Mg 2 plus у плазмі були подібними для обох груп, що свідчить про те, що миші перебували в стаціонарному стані, за якого спостерігався гомеостатичний баланс кишкової реабсорбції, мобілізації тканин (наприклад, з кісток) інирковийдосягнуто виведення іонів Са 2 плюс і Mg 2 плюс. Щоб перевірити, чи різні показники екскреції Ca 2 plus і Mg 2 plus із сечею є результатом відмінностей у кишковому поглинанні цих іонів, ми порівняли добове споживання їжі, виділення з фекаліями та екскрецію Ca 2 plus і Mg 2 plus для двох цих іонів. штами мишей. Як показано на малюнку S5, споживання їжі та виділення Ca 2 плюс фекаліями були подібними, але щоденна екскреція Mg 2 плюс фекаліями була нижчою у мишей C57BL/6, ніж у мишей 129Sv, що свідчить про те, що миші C57BL/6 мають вищу кишкову реабсорбцію Mg 2 плюс. ніж миші 129Sv. Згідно з цим припущенням, миші C57BL/6 мали сильнішу експресію магнієвого каналу TRPM6 у товстій кишці (Малюнок S6), а також тенденцію до вищих рівнів Mg 2 плюс у плазмі порівняно з мишами 129Sv, хоча відмінності не досягли статистичної значущості. Щоб оцінити можливий внесок кістки, ми проаналізували за допомогою мікро-КТ мінеральну щільність кістки в обох штамів. Подібно до попередніх звітів, 32 миші C57BL/6 мали досить низьку мінеральну щільність кісткової тканини (рис. S7), що може пояснити, чому ці миші мають тенденцію зберігати Ca 2 плюс іони через зниженийнирковийCa 2 плюс екскреція. Відповідно до підвищеної канальцевої швидкості реабсорбції Ca 2 плюс, нирки мишей C57BL/6
експресували більше каналу TRPV5 Ca 2 plus на рівнях білка, ніж нирки мишей 129Sv (рис. 2). Миші C57BL/6 також мали значно вищу експресію мРНК і білка NCC, ніж миші 129Sv (рис. 2A). Подібним чином вміст білка загального NKCC2, загального та фосфорильованого NCC і загального ENaC був вищим у C57BL/6, ніж у мишей 129Sv (Рисунок 2B,C). Кількість протеолітично розщеплених і, отже, активних форм - і - ENaC не відрізнялася, що свідчить про те, щонирковийАктивність ENaC була подібною для обох штамів (рис. 2B, C).
Немає доказів зміни функції товстої висхідної кінцівки у мишей C57BL/6 порівняно з мишами 129Sv
Вища кількість загального NKCC2, загального NCC і фосфорильованого NCC у нирках мишей C57BL/6 може бути компенсаторною реакцією на зниження фосфорилювання NKCC2. Щоб перевірити, чи відрізняється активність NKCC2 і NCC між штамами мишей, ми провели тест на буметанід і тіазид відповідно. Одна ін’єкція буметаніду або гідрохлоротіазиду викликала сильний натрійурез, який був більш вираженим для буметаніду, ніж для гідрохлоротіазиду. Однак сечогінні реакції були абсолютно подібними в обох штамів, що свідчить про те, що функціональні активності NKCC2 і NCC не відрізнялися між мишами C57BL/6 і 129Sv (рис. 3A-D). Очевидно, вміст білка та рівні фосфорилювання не обов'язково збігаються з функціональною активністюнирковийбілки транспорту іонів, на що нещодавно також звернули увагу Хантер та співавтори. 33 Для подальшої оцінки функції TAL ми провели тест з обмеженням води, під час якого миші протягом 24 годин мали доступ до зволоженої їжі, але не до водопровідної води. За цих умов обидві лінії мишей підвищували осмолярність сечі до однакових значень (табл. 1). Крім того, миші C57BL/6 і миші 129Sv продемонстрували однакову екскрецію з сечею уромодуліну (білка Тамма-Хорсфолла) (таблиця 1), який виробляється і виділяється в сечу залежно від функціональної активності клітин TAL. 3
Схрещування мишей 129Sv і C57BL/6 свідчить про те, що делеція п’яти амінокислот у NKCC2 не відокремлює певний фенотип
Представлені дані свідчать про те, що штамові відмінності в екскреції іонів із сечею танирковийкількість білка не пов’язана з делецією п’яти амінокислот у C57BL/6 NKCC2, але пов’язана з іншими генетичними відмінностями між двома лініями мишей. Щоб перевірити це далі, ми схрестили мишей 129Sv і C57BL/6 з поколінням F2, у якому генетичні відмінності штамів (включаючи відмінності в NKCC2) повинні бути випадковими
роздали мишам. Потім ми порівняли мишей F2, які були або гомозиготними щодо повної довжини NKCC2 (f/f), гомозиготними щодо делеції NKCC2 (Δ/Δ), або гетерозиготними щодо делеції NKCC2 (f/Δ). За винятком очікуваних різних моделей зв’язування фосфоформ-специфічних антитіл проти NKCC2 і NCC (і нечіткої різниці експресії ROMK на рівні мРНК, але не на рівні білка), жодна з раніше ідентифікованих відмінностей між двома штамами не була очевидною в миші f/f, Δ/Δ або f/Δ покоління F2 (рис. 4 і табл. 2). Зокрема, не було виявлено відмінностей у екскреції Ca 2 plus або Mg 2 plus із сечею, а також відмінностей у рівнях Ca 2 plus або Mg 2 plus у плазмі, що свідчить про те, що відмінності в штамах між мишами 129Sv і C57BL/6 не залежать від делеція п'яти амінокислот у NKCC2.
Нове антитіло pT96 NKCC2 виявляє pNKCC2 в обох штамах
Оскільки делеція п’яти амінокислот у NKCC2 перешкоджає надійному виявленню фосфорилювання NKCC2 у мишей C57BL/6 при використанні доступних антитіл, ми створили нове антитіло, спрямоване проти фосфосайту T96 у мишей C57BL/6. Кроликів імунізували фосфопептидом, який відповідав амінокислотній послідовності C57BL/6 NKCC2, що оточує T96 (YYLQ(p)TMDA). Антисироватки були афінно очищені та охарактеризовані за допомогою імуноблоттингу та імуногістохімії (рис. 5). Антитіло виявило одну смугу з очікуваним розміром 170 кДа в нирках нокауту 129Sv, C57BL/6 дикого типу та C57BL/6 NCC
мишей (Малюнок 5A). Смуга явно відрізнялася від тієї, що була виявлена для NCC при 130 кДа. Дефосфорилювання 129Svнирказразки з лужною фосфатазою кишечника теляти (CIAP) повністю знищили сигнал, отриманий за допомогою нового антитіла pT96 NKCC2, тоді як сигнал з нефосфоформспецифічним антитілом NKCC2 був видимим у контрольних і дефосфорильованих зразках (рис. 5B). Цікаво, що фосфорилювання NKCC2 також було значною мірою усунено, колиниркалізати інкубували при 37 градусах протягом 1 години без CIAP (ймовірно, через активність ендогенної лужної фосфатази з проксимальних канальців). Експерименти дефосфорилювання з використанням лямбда-фосфатази на послідовних парафінових зрізах нирок мишей C57BL/6 додатково підтвердили, що нове антитіло розпізнає лише фосфорильований NKCC2 (рис. 5C). Крім того, імунофлуоресценція на послідовних кріозрізах продемонструвала, що нове антитіло забарвлює лише апікальну плазматичну мембрану NKCC2- позитивних TAL, але не NCC-позитивних DCT у мишей 129Sv і C57BL/6 (рис. 5D), що свідчить про те, що нові Антитіло pNKCC2 не реагує перехресно з pNCC. Цей висновок також було підтверджено з використанням клітинних лізатів з клітин MDCKI, що експресують NKCC2 людини (hNKCC2) і NCC людини (hNCC). Імуноблоти імунопреципітацій (IP) і лізатів цілих клітин продемонстрували, що нове антитіло pT96 NKCC2 розпізнає NKCC2 людини, але не NCC людини (рис. S8A). Цікаво, що, незважаючи на те, що нове антитіло було отримано проти pNKCC2 мишей C57BL/6, нове антитіло виявило фосфорилювання NKCC2 еквівалентно в нирках обох ліній мишей як за допомогою імуногістохімії (Рис. 6A), так і за допомогою імуноблоттингу (Рис. 6B).
Нове антитіло pT96 NKCC2 дозволяє аналізувати регульоване фосфорилювання NKCC2
Фосфорилювання і, отже, активність NKCC2 і NCC регулюються концентраціями позаклітинних іонів. Низький [Cl-] ex збільшує фосфорилювання NKCC2 на Thr96 і Thr101 і NCC на Thr53 і Thr58 через активацію шляху WNK/SPAK/OSR1. 7,8,18,29,35 Подібним чином високий [K плюс ] швидко знижує фосфорилювання NCC, але вважається, що він має незначний вплив або зовсім не впливає на фосфорилювання NKCC2. 12,36,37,38 Щоб перевірити, чи здатне нещодавно розроблене антитіло pT96 NKCC2 виявляти цей тип диференціальної регуляції фосфорилювання NKCC2,нирказрізи мишей C57BL/6 піддавали ex vivo впливу 110 або 5 мМ [Cl-] екс і 3 або 10 мМ [K плюс ] екс відповідно. Як і очікувалося, низький рівень [Cl-] ex значно посилив фосфорилювання NCC і NKCC2 (рис. 7A, B), тоді як високий рівень [K plus ] ex лише зменшив фосфорилювання NCC, але не змінив фосфорилювання NKCC2 (рис. 7C, D). Подібним чином виявлені нові антитіла однаково добре змінені
МАЛЮНОК 4 Жодних суттєвих змін в експресії мРНК і протеїну основногонирковийтранспортери іонів і канали в схрещеному поколінні F2. A, Стовпчаста діаграма відносних рівнів експресії мРНК у трьох групах мишей. Усі значення були нормалізовані для f/f мишей. Значення є середніми ± SEM. B, Велика кількість білка в організмі мишіниркалізати тварин покоління F2. Ці три групи відповідають повнорозмірному NKCC2 (f/f), NKCC2, гомозиготному щодо делеції (Δ/Δ) або NKCC2, гетерозиготному щодо делеції (f/Δ/). Маркери молекулярної маси включені. NKCC2 і pNKCC2 очікуються при 170 кДа, NCC і pNCC при 130 кДа, TRPM6 при 260 кДа, - ENaC при 95 кДа і 34 кДа (розщеплений), - ENaC при 100 кДа, - ENaC при 100 кДа і 85 кДа (розщеплений) , ROMK при 55 кДа (зрілий глікозильований), 43 кДа (гликозильований ядро) і 34 кДа (неглікозильований). Зелені стрілки вказують на певні смуги, тоді як червоні стрілки вказують на неспецифічні смуги. C, Денситометричний аналіз великої кількості білка, порівнюючи f/f і Δ/Δ мишей. Інтенсивність смуг від Δ/Δ мишей нормалізована до інтенсивності f/f. (Значення є середніми ± SEM; n=5 мишей на групу; *P < 0,05,="" †="" p="">< 0,01,="" ‡="" p=""><>
Фосфорилювання NKCC2, яке було спровоковано в клітинах MDCKI, що експресують NKCC2 людини (hNKCC2) або NKCC2 миші (mNKCC2(C57BL/6)) гіпотонічними умовами з низьким вмістом позаклітинного хлориду (Малюнок S8B). внирказрізи, інкубовані при 5 мМ [Cl − ] ex , також описані раніше антитіла проти мишачих pT96/T101 NKCC2 39 і антитіл проти людських pT212/T217 NKCC1 R5 11 виявляють слабкі сигнали для NKCC2 і NCC, які стають більш очевидними, коли завантажується більше білків, а імуноблоти зображуються в покращених налаштуваннях (Малюнок S9).
ДИСКУСІЯ
Миші C57BL/6 і 129Sv є двома з найбільш часто використовуваних штамів мишей для біомедичних досліджень. Геном мишей C57BL/6 був першим, який секвенували для миші 40, і з тих пір він служив еталонним геномом для аналізу генетичних і фенотипових варіацій між лініями мишей. 41- 44 Дляниркадослідження, одна істотна відмінність між мишами C57BL/6 і 129Sv стосується експресії гена реніну. Як і люди, миші C57BL/6 містять лише один ген реніну, тоді як миші 129Sv мають дві копії, що може пояснити вищу сприйнятливість цієї лінії мишей до гіпертензії 45,46 та гіпертонічної травми. 47 У цьому дослідженні ми додаємо ще одну важливу генетичну відмінність, яку необхідно враховувати. Ми описуємо досі недооцінену делецію п’яти амінокислот у NKCC2 (ΔF97- T101), присутню в C57BL/6, але не в мишах 129Sv, що заважає виявленню фосфорилювання NKCC2 більшістю раніше доступних антитіл, але не має значного значення. впливфункції нирок.
N-кінцеві сайти фосфорилювання NKCC2 миші T96 і T101 є висококонсервативними для різних видів і між NKCC2, NKCC1 і NCC (рис. 1). 48 Тому не дивно, що антитіла, спрямовані проти цих сайтів фосфорилювання, перехресно реагують з іншими котранспортерами. Попередні дослідження показали, що антитіла проти фосфорильованого NCC також виявляють фосфорильований NKCC2 7,18,28,29 і що антитіло pNKCC1 дозволяє аналізувати рівні фосфорилювання як NKCC1, так і NKCC2. 11 Відповідно до цього ми спостерігали перехресну реактивність наших антитіл pNCC (pT53 і pT58) з фосфорильованим NKCC2 і нашого антитіла pT96/pT101 NKCC2 з фосфорильованим NCC. Однак перехресну реактивність антитіл pNCC з NKCC2 спостерігали лише в нирках мишей 129Sv, але не в нирках мишей C57BL/6. Навпаки, наше раніше розроблене антитіло до NKCC2 pT96/pT101 показало відсутність або в кращому випадку дуже слабкий сигнал для pNKCC2 у нирках мишей C57BL/6 і виявило в основному фосфорильований NCC у цьому штамі. Тепер ми пов’язуємо ці заплутані спостереження з делецією п’яти амінокислот у NKCC2 мишей C57BL6 (ΔF97- T101). Регуляція фосфорилювання NKCC2 була вивчена
тестували в різних експериментальних умовах і для різних стимулів, включаючи вазопресин, 14, 21, 24, 25, 49 уромодулін 19, 20, 50 та інгібітори кальциневрину. 10,26 Хоча більшість досліджень проводилися на гетерологічних системах експресії 10,19,20,25,50 або на щурах 10,24 і мишах 19,26, які експресують NKCC2 повної довжини, деякі дослідження також проводилися на мишах C57BL/6. 7,18,27,28,29,51 Як ми повідомляємо тут, миші C57BL/6 експресують варіант NKCC2 із делецією п’яти амінокислот, що перешкоджає належному виявленню фосфорилювання NKCC2 і несе ризик, що стандартний pT96/T101 NKCC2 антитіла та антитіло R5 проти фосфо-NKCC1 перехресно реагують з фосфорильованим NCC принаймні за умов, які використовуються в нашій роботі. Неможливо оцінити вплив цієї перехресної реакції на попередні експериментальні висновки, але, згідно з нашими спостереженнями, дані мишей C57BL/6 слід переглянути та інтерпретувати з обережністю. Незважаючи на те, що делеція п’яти амінокислот мала сильний вплив на виявлення фосфорилювання NKCC2, ми не маємо доказів того, що делеція істотно впливає на функціональну активність котранспортера. Миші C57BL/6 справді мали вищу екскрецію Mg 2 із сечею та нижчу екскрецію Ca 2 із сечею 31, ніж миші 129Sv, але ми виявили, що ці відмінності, ймовірно, не пов’язані зі зміненим парацелюлярним транспортом цих катіонів уздовж TAL, а є результат посиленого TRPM6- залежного Mg 2 плюс поглинання в кишечнику та збільшення TRPV5- залежного Ca 2 плюс реабсорбції в DCT2 і CNT. Останній викликає позитивний Ca 2 плюс баланс, який може сприяти збільшенню низької мінеральної щільності кісткової тканини мишей C57BL/6. Виявлено, що миші C57BL/6 і 129Sv демонструють те саменирковийвідповіді на петльові та тіазидні діуретики та на обмеження води додатково припускають, що делеція п’яти амінокислот у NKCC2 суттєво не порушує функцію TAL. Найважливіше те, що миші покоління F2 схрещених мишей C57BL/6 і 129Sv мають однаковінирковийфенотип незалежно від того, експресують миші повну довжину (f/f) NKCC2 або NKCC2
гомозиготний (Δ/Δ) для делеції. Ці спостереження на мишах узгоджуються з попередніми функціональними даними гетерологічних систем експресії. Хоча мутації окремих залишків у NKCC1 (T217 у людини, T211 у миші) або NCC (T60 у людини, T58 у миші) скасовують активність цих котранспортерів, мутації відповідного залишку в NKCC2 (T105 у людини, T101 у миші) ) мають досить незначний вплив або навіть не впливають на базову та стимульовану активність NKCC2. 35,52,53 Навіть коли обидва залишки треоніну в NKCC2 мутують на аланін, функціональна активність NKCC2 все ще досягає ~70 відсотків максимальної активності, 35 що свідчить про те, що фосфорилювання цих сайтів є показовим, але не суттєвим для активності NKCC2.
Сайти фосфорилювання часто є гомологічними між білками. Таким чином, проблема перехресної реактивності фосфоформ-специфічних антитіл не є унікальною для антитіл, спрямованих проти фосфорильованих NCC, NKCC2 і NKCC1, але повідомлялося також про інші білки, такі як циклінзалежні кінази 1 і 2 54 і позаклітинні білки. сигнал-регульовані кінази 1 і 2. 55 Послідовно, щоразу, коли використовуються специфічні для стану фосфорилювання антитіла, необхідний суворий експериментальний контроль для підтвердження специфічності виявлених сигналів. Це може включати (а) підтвердження того, що використане антитіло виявляє білок з очікуваною молекулярною масою (імуноблотинг) та/або в очікуваній клітинній та субклітинній локалізації (імунофлуоресценція), (б) перевірку того, що антитіло специфічно взаємодіє з фосфорильованим епітопом за допомогою з використанням аналізів конкуренції з фосфорильованими та нефосфорильованими пептидами та (c) демонстрація того, що
антитіло є фосфоформспецифічним шляхом порівняння фосфорильованих і дефосфорильованих зразків тканини. Цей контроль може бути доповнений генетичним контролем, який включає тестування тканин нокаутних тварин та/або клітин, які гетерологічно експресують цікавий білок. У цьому дослідженні ми використали вищезазначені підходи для детальної характеристики нового антитіла pT96 NKCC2, яке виявляє фосфорильований NKCC2 унирказразки мишей C57BL/6 і 129Sv однаково добре. Антитіло є фосфоформспецифічним і не виявляє явної перехресної реактивності з фосфорильованим NCC за будь-яких тестованих умов. Використовуючи це антитіло, ми підтвердили, що низькі концентрації позаклітинного хлориду збільшують фосфорилювання NKCC2 у цьому місці, 7,8 тоді як змінені концентрації позаклітинного калію не відіграють значної регуляторної ролі. 24 Підсумовуючи, наша робота показує критичну різницю штамів у послідовності амінокислот NKCC2 миші, яка впливає на виявлення та, отже, на аналіз фосфорилювання та регуляції NKCC2. Нещодавно розроблене антитіло pT96 NKCC2 обходить це технічне застереження та дозволяє надійно виявляти змінене фосфорилювання NKCC2 незалежно від генетичного фону мишачих моделей. Крім того, наше дослідження знову підкреслює, що при аналізі мишачих моделей необхідно враховувати генетичні відмінності.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
Тварини,Миші чоловічої статі відповідного віку (6- 8 тижнів) були або інбредними штамами 129S6/SvEvTac, C57BL/6J, які далі називаються 129Sv і C57BL/6, або змішаним гібридом штаму 129S/B6 у поколінні F2. Усі експерименти на тваринах проводилися відповідно до законів Швейцарії про добробут тварин і схвалені ветеринарною адміністрацією кантону Цюрих, Швейцарія (Ліцензії: 141/2014, 185/2017 та 135/2018). Мишей генотипували для видалення 15 основ за допомогою стандартної ПЛР з праймерами, наведеними в таблиці S3. Повнорозмірний (f/f) NKCC2 має очікуваний продукт ПЛР 87 bp, тоді як видалена послідовність NKCC2 (Δ/Δ) очікується на рівні 70 bp.
Обробка тканинМишей анестезували комбінацією ізофлурану (2 відсотки - 4 відсотків, 0.5 л/хв; Provet; CH) і темгезику (бупренорфін; 0.05- 0). 4 мг/кг маси тіла; Indivor; CH). Для біохімічного аналізу мишей анестезували та перфузували через лівий шлуночок серця фосфатно-сольовим буфером (PBS). Нирки та дистальні частини товстої кишки збирали, швидко заморожували в рідкому азоті та зберігали при температурі -80 градусів до подальшої обробки. Для імуногістохімії нирки фіксували за допомогою 3% параформальдегіду (PFA) у 0.1 М фосфатному буфері (рН 7,4, 300 мОсм) шляхом ретроградної перфузії миші під глибокою анестезією через черевної аорти з подальшим коротким промиванням 0.1 М фосфатним буфером (0,2 М NaH 2 PO 4 x H 2 O, 0,2 M NaH 2 PO 4 x 2H 2 O, 0,1 M CaCl 2 ). Згодом нирки виймали, розрізали на шматки та заморожували в рідкому пропані та зберігали при -80 градусах.
Метаболічні кліткові дослідженняПісля адаптації до метаболічних клітин (Techniplast) мишей утримували в метаболічних клітинах протягом чотирьох днів поспіль із вільним доступом до водопровідної води та стандартної лабораторної їжі (Ssniff, Spezialdiäten GmbH). Масу тіла, споживання їжі та води реєстрували щодня, а сечу та фекалії збирали за 24 години.
Протокол обмеження водиМишей тримали протягом 24 годин у метаболічних клітинах (Techniplast) без доступу до водопровідної води. Стандартний лабораторний порошок (Ssniff, Spezialdiäten GmbH) змішували з водою 1:1, 24-годинну сечу та фекалії збирали та аналізували. Через 24 години мишей повертали в звичайні клітки (T 2L (IVC), LASC, UZH).
Біохімічні вимірюванняКонцентрації Na plus, K plus, Ca 2 plus аналізували полум’яною фотометрією (EFOX 5053, Eppendorf). Концентрації Mg 2 plus у сечі та плазмі вимірювали в Цюріхському центрі інтегративної фізіології гризунів за допомогою системи(-й) SYNCHRON LX ®, клінічної системи UniCel ® DxC 800 Synchron ® та мультикалібратора Synchron ® System. Креатинін у сечі вимірювали за методом Яффе. Концентрації газів та іонів крові вимірювали в гепаринізованій цільній крові за допомогою аналізатора газів крові (радіометра) ABL825Flex відразу після взяття крові з порожнистої вени. Рівні альдостерону в плазмі та концентрацію уромодуліну в сечі (UMOD) вимірювали за допомогою комерційно доступних наборів ELISA (набір Aldosterone ELISA від Cayman; № 501090 і набір Mouse Uromodulin ELISA від Abcam; ab245726 відповідно).
Кількісна полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі (RT-qPCR)
РНК виділяли з нирок і дистального відділу товстої кишки за допомогою набору для виділення загальної РНК SV (PROMEGA). Рівні концентрації ізольованої РНК (250 нг у 129Sv проти C57BL/6 або 500 нг у f/f, Δ/Δ та f/Δ) були зворотно транскрибовані в кДНК за допомогою набору зворотної транскриптази GoScript™ (PROMEGA). Отримані кДНК додатково розбавляли водою, вільною від ДНКази/РНКази (1:5). Праймери були розроблені для кількісного визначення загального Slc12a1, Slc12a3, Trpm6, Trpv5, Scnn1a, Scnn1b, Scnn1g і Kcnj1 (Таблиця S3). Кількісний ПЛР-аналіз проводили з використанням LightCycler ® 480 (Roche) для вимірювання рівнів експресії цікавих генів. Відносну експресію генів розраховували за допомогою методу дельта Ct з використанням -актину як еталонного гена.
Вестерн-блот аналізНирки гомогенізували в буфері для лізису без детергентів (DFLB), що містив маніт 200 мМ, HEPES [4- (2- гідроксилетил)- 1піперазинетансульфонову кислоту кислоти] 80 мМ, гідроксид калію 41 мМ, інгібітори протеази (Complete Ultra, Roche) та інгібітори фосфатази (PhosSTOP, Roche) з використанням 32 зелених кульок Magna Lyser (Roche) у тканинному гомогенізаторі Precellys 24 (Bertin Instruments, Montigny-le- Бретонне). Намистини осадили центрифугуванням протягом 10 хвилин (1987 rcf), а супернатант, що містить білок, зберігали в одноразових аліквотах при -80 градусах. Для Вестерн-блоттингу 50 мкг білка денатурували в буфері Леммлі, розділяли за допомогою SDS-PAGE з використанням 8% - 12% гелів і згодом переносили на нітроцелюлозні мембрани. Неспецифічні сайти зв’язування блокували за допомогою 1x Odyssey Blocking Solution (Li-COR Biosciences) перед тим, як мембрани інкубували з первинними антитілами (таблиця S4), розведеними в 0,2x Odyssey Blocking Solution при 4 градусах протягом 12 годин. Після промивання в PBS- 0.1% Tween мембрани інкубували з вторинними антитілами (козячий антикролячий IRDye 800 або козячий антимишачий IR dye 680, 1:10'000, LI - COR Biosciences), розведений у 0,1x буфері для блокування казеїну (Sigma). Виявлені смуги візуалізували за допомогою системи інфрачервоного зображення Odyssey (Li-COR Biosciences). Щоб забезпечити рівне білкове навантаження, мембрани або спільно фарбували антитілом проти актину, або загальний білок фарбували за допомогою REVERT Total Protein Stain (Li-COR Biosciences) перед виявленням антитіл. Імунореактивні смуги кількісно визначали на Фіджі (ImageJ) і нормалізували відповідно до сигналу актину або фарбування загального білка REVERT.
ІмуногістохіміяЗрізи кріостата (товщина 4 мкм) блокували для неспецифічного зв’язування антитіл 10-відсотковою нормальною козячою сироваткою, а потім інкубували з первинними антитілами (Таблиця S4)
ніч при 4 градусах. Після промивання 1X PBS слайди інкубували з вторинними антитілами (Cy3 – кон’югований козячий антикролячий IgG, номер продукту 111- 165- 144, 1:1000 та FITC – кон’югований козячий антимишачий IgG , номер продукту 115- 095- 068, 1:100 відповідно, обидва від Jackson Immuno Research Laboratories) протягом 2 годин при кімнатній температурі. Усі антитіла розводили в 1% BSA/1xPBS. Ядра клітин фарбували DAPI (4′,6- діамідіно- 2- фентиліндол, Sigma-Aldrich, Co.) у концентрації 0,1 мкг/мл. Зображення проводили за допомогою флуоресцентного мікроскопа Leica DM6000 B (Leica Microsystems, 35578) з флуоресцентною монохромною цифровою камерою Leica DFC350 FX (Leica Microsystems, 35578). Зображення оброблено на Фіджі (ImageJ).
Створення афінно очищеного кролячого антитіла проти pT96 NKCC2 мишіВиробництво антитіл проводилося службою антитіл Pineda (Берлін, Німеччина). Кроликів імунізували фосфопептидом, що містить амінокислоти 105- 114 послідовності NKCC2 миші C57BL/6 (NH2- YYLQ(p) TMDAV-COOH). Моноспецифічну фракцію IgG афінно очищали проти фосфопептиду, а потім попередньо абсорбували дефосфопептидом, у результаті чого утворювалася фракція специфічних до фосфоформ антитіл. Специфічність антитіл цієї фракції перевіряли за допомогою імуногістохімії та Вестерн-блот аналізу (рис. 5 і рис. S4).
Лікування фосфатазоюБілкові лізати інкубували протягом 1 години при 37 градусах з кишковою лужною фосфатазою теляти (CIAP) (1 Од/1 мкг білка), щоб індукувати гідроліз 5'-фосфатних груп фосфорильованих білків, що пригнічувало специфічне зв’язування pT96. Антитіло NKCC2 до білків на нітроцелюлозній Вестерн-блот мембрані (рис. 5B). Використовували заархівовані парафіновані нирки мишей C57BL6. Обробку зрізів із застосуванням лужної фосфатази кишечника теляти (Sigma Aldrich) проводили, як описано раніше, з незначними модифікаціями. 56 Після блокування вільних альдегідних груп зрізи промивали п’ять разів у буфері для лужної фосфатази (100 мм трис, 50 мкм CaCl 2 , 0,1 мкм MgCl 2 , 8,4 мкм лейпептин, 4 мкм пефаблок, pH 9,0). Пізніше зрізи інкубували в буфері для лужної фосфатази з або без лужної фосфатази кишечника теляти (~130 одиниць/мл) в інкубаторі при 35 градусах протягом 2 годин. Згодом було проведено імуногістохімію та світлову мікроскопію, як детально. 57
Вирівнювання послідовності амінокислотАмінокислотні послідовності для різних видів і штамів мишей були отримані з відкритої бази даних «Ensembl Genome Browser» (www.ensem bl.org, Sanger Institute). 42 Джерела ідентифікаторів транскриптів наведено в таблиці S1. Послідовності були вирівняні за допомогою Qiagen © CLC Main Workbench 20.
Зрізи нирокнирказрізи мишей C57BL/6 використовували для експериментів ex vivo, як описано раніше. 12 Коротко, мишей голодували протягом ночі з вільним доступом до води, щоб уникнути будь-яких потенційних впливів споживання іонів з їжею на рівні фосфорилювання NKCC2 і NCC. Нирки виймали з анестезованих тварин, нарізали на шматочки товщиною 280 мкм за допомогою вібраційного мікрорізака (Vibratome, Microm; Thermo Scientific) і поміщали в розчин Рінгера (у мМ): 98,5 NaCl, 25 NaHCO 3 , 3 KCl, 1 Na 2 HPO 4 , 2,5 CaCl 2 , 1,8 MgCl 2 і 25 глюкози протягом 30 хвилин при 30,5 градусах з постійним барботуванням 95 відсотків O 2 і 5 відсотків CO 2 . Згодом розчин Рінгера було замінено подібними розчинами, але з іншими концентраціями Cl - (5 мМ для низького Cl - , 110 мМ для нормального Cl - ) і K plus (3 мМ для нормального K плюс , 10 мМ для високого K плюс ) для додаткові 30 хвилин. Нарешті, шматочки були швидко заморожені в рідкому азоті.
СтатистикаДля порівняння двох груп використовували непарний критерій Стьюдента та критерій Велча у випадку нерівних дисперсій (GraphPad Prism, версія 8.0.2). Для множинного порівняння було виконано односторонній або двосторонній дисперсійний аналіз із подальшим множинним порівнянням Тьюкі (GraphPad Prism, версія 8.0.2). Дані відображаються як середнє значення ± SEM (у таблицях і на малюнках). Відмінності вважалися достовірними, коли P <>
ПОДЯКА Автори дякують д-ру Гарі Шуллу (Університет Цинциннаті, Цинциннаїт, Огайо) за надання мишей NCC-KO, д-ру Біффу Форбушу (Єльська школа медицини, Нью-Гейвен, Коннектикут) за його антитіло до pNKCC1 "R5" та д-ру Хенріку Дімке ( Університет Південної Данії, Оденсе, Данія) для його мишачого моноклонального загального антитіла NCC. Автори також висловлюють подяку Монік Каррелл та Інгер Мерете Полсен за технічну допомогу та доктору Естер Банкі за наданнянирказразки. Вимірювання мінеральної щільності кісткової тканини та частковий аналіз сечі та плазми проводили доктор Петра Зеєбек і Надін Негеле (Цюрихська інтегративна фізіологія гризунів, Університет Цюріха) відповідно. Був високо оцінений дуже корисний внесок д-ра Алісії Макдоно (Університет Південної Каліфорнії) та д-ра Олів’є Девюста (Університет Цюріха).
КОНФЛІКТ ІНТЕРЕСІВ Група JL отримує гонорари за ліцензовані антитіла проти NCC і фосфорильовані Nedd4- 2 від Milipore та Abcam відповідно. Обидва антитіла не використовувалися в поточному дослідженні. Крім того, у 2019 році JL отримав гонорар від VIFOR за усну доповідь на симпозіумі, організованому VIFOR.