Механізм ланцюга, що поєднує минуле та майбутнє навчання через зміни у сприйнятті. Частина 2

З’ясування схеми контролю, яка керує зміною сприйняття

Далі, щоб охарактеризувати ланцюгові механізми, які опосередковують цю індуковану навчанням зміну сприйняття, ми виміряли активність у двох інтернейронах вищого порядку, церебральному вентральному 1a (CV1a) і нейроні, що змінює шаблон (PRN). Ці клітини є командними нейронами в ланцюгах ковтання та ковтання, відповідно, і, коли вони активні, їх достатньо для керування відповідними руховими програмами (16, 31). Внутрішньоклітинні записи показали, що активність CV1a значно посилювалася через 4 години після інтенсивного тренування порівняно з тваринами, які не отримували лікування, тоді як активність PRN була значно знижена (рис. 3, A–E).

Зміна сприйняття — це зміна способу мислення та зміна менталітету. Він включає усвідомлення навколишнього середовища, усвідомлення самоідентичності, розуміння особистого досвіду, а також досягнення цілей і прагнень. Зміни сприйняття можуть спонукати людей приймати більш позитивний підхід до життя та краще справлятися з труднощами. І це позитивне ставлення та менталітет можуть покращити пам’ять людей.

По-перше, зміна сприйняття дозволяє людям більше зосереджуватися на позитивних моментах у своєму житті. Як сказано в «Пошуку оптимістичних облич», у житті часто є багато позитивних факторів, але ми часто не можемо їх виявити. І завдяки змінам у сприйнятті ми можемо краще усвідомлювати ці позитивні фактори та приділяти їм достатньо уваги та значення. Ці оптимістичні фактори можуть не тільки накопичувати наше щастя, але й сприяти кращому сприйняттю інформації в житті, тим самим покращуючи пам’ять.

По-друге, зміна сприйняття також може допомогти людям краще зрозуміти себе, зокрема свої сильні та слабкі сторони, цінності тощо. Це поглиблення самосвідомості дозволяє людям краще керувати своїми емоціями та стресом і стати більш мотивованими для досягнення своїх цілей і бажань. Такого роду амбіції та мотивація можуть стимулювати мозок людей бути більш творчими та мислити, а також покращувати їхню пам’ять.

Нарешті, зміни сприйняття також можуть спонукати людей приділяти більше уваги власному досвіду та розвитку. Будь то успіх чи невдачі, кожен досвід є цінним надбанням. Завдяки змінам у сприйнятті ми можемо краще розмірковувати та узагальнювати, не тільки краще виявляти свої точки зростання та недоліки, але й краще засвоювати та запам’ятовувати досвід та уроки.

Коротше кажучи, зміна у сприйнятті, хоч і є просто психічною адаптацією, може мати глибокий позитивний вплив на наше життя та навчання. З позитивним і сонячним настроєм ми можемо краще справлятися з викликами, продовжувати розвиватися, краще опановувати інформацію та запам’ятовувати вміст. Давайте активно інвестувати в трансформацію сприйняття та постійно вдосконалювати наше зростання та якість. Видно, що нам потрібно вдосконалювати пам'ять. Cistanche deserticola може значно покращити пам'ять, оскільки Cistanche deserticola також може регулювати баланс нейромедіаторів, наприклад підвищувати рівень ацетилхоліну та факторів росту. Ці речовини дуже важливі для пам'яті та навчання. Крім того, м’ясо може також покращити кровообіг і сприяти доставці кисню, що може гарантувати, що мозок отримує достатню кількість поживних речовин і енергії, таким чином покращуючи життєздатність і витривалість мозку.

Клацніть «Знай, як покращити роботу мозку».

Ми припустили, що цей взаємозв’язок антагоністичної активності, керований навчанням, можна пояснити загальним мотивом схеми, а саме гальмуванням між конкуруючими схемами (32). У цьому сценарії посилення активності в одній мережі сприяло б придушенню антагоністичної. На підтримку цього, CV1a отримує значні гальмівні дії протягом усієї фази протракції як під час спонтанного, так і під час PRN-керованих циклів виведення (рис. 3F). Ці гальмівні входи не виникали безпосередньо з PRN, що свідчить про те, що нейрони нижче за течією були набрані.

Fig. 2. Previous learning alters the perception of future training by shifting the feeding network state. (A) Example frames showing mouth movements during ingestion or egestion. Frames are color-matched to (B) (red: ingestion, blue: egestion). White dots indicate the distal tip of the radula tracked during bite classification. Scale bar, 0.5 mm. (B) Heat plots of radula movements during the first 15 bites in response to the CS + US during weak training in animals receiving weak training only versus animals receiving vital training 4 hours earlier. Red-white-blue lookup table represents radula movements. Positive (blue) is egestion; negative (red) is ingestion. (C) Statistical summary of (B) shows a significant change in the mean difference in radula movements between conditions (two-tailed t-test, P < 0.01, t = 3.1). (D) The plot of the fraction of ingestion/egestion bites produced during weak training shows a significant difference between conditions(Fisher's exact test, P < 0.01). (E) The plot of fraction of animals performing no egestion bites versus >{{0}} укусів егесії показує значну різницю між умовами (точний критерій Фішера, P < 0,001). (F) Активність B11 і N2v у препараті in vitro під час циклів прийому всередину та прийому всередину. В11 переважно активний у фазі ретракції під час ковтання та у фазі протракції під час ковтання.

N2v activity does not change during ingestion and egestion cycles. B11 is therefore a readout of ingestion versus egestion. Gray lines represent the retraction phase onset. (G) Heat plots of B11 activity during fictive feeding cycles. Lookup table colors are normalized B11 spike differences. Positive (blue) is egestion; negative (red) is ingestion. (H) Statistical summary of (G) shows a significant change in the 11 spike difference between conditions (Mann-Whitney test, P < 0.01, U = 70). (I) The plotof fraction of ingestion/egestion cycles shows a significant difference between conditions (Fisher's exact test, P < 0.001). (J) The plot of the fraction of preparations producing no egestion cycles versus >{{0}} циклів висмоктування показує значну різницю між умовами (точний критерій Фішера, P < 0,001). год, години.

Далі, щоб ідентифікувати джерело цих вхідних даних, ми провели широкий пошук типу нейрона, який би відповідав наступним критеріям: (i) він повинен інгібувати CV1a, коли він активний, (ii) він повинен бути активним під час фази протракції егекції. циклів, і (iii) він повинен збуджуватися активністю PRN. Використовуючи підхід флуоресцентного маркування для виявлення нейронів, що виступають із буккальних гангліїв, де розміщена більшість ланцюгів живлення (33), ми визначили один тип нейрона-кандидата, перемикач шаблону 1 (PS1) (рис. 4A), який задовольняв усім трьом критеріям . По-перше, штучна стимуляція PS1 моносинаптично інгібувала іпсилатеральний CV1a (рис. 4, B і C). По-друге, цей нейрон був дуже активним під час фази протракції циклів егекції як PRN, так і стимулу (рис. 4D і fFig. S9A), коли CV1a пригнічувався. По-третє, активність PRN збуджувала PS1 моносинаптично, що спостерігалося як збудливі постсинаптичні потенціали (EPSP) 1:1 (рис. 4, E і F). Щоб з’ясувати, чи був PS1 єдиним джерелом інгібування CV1a під час живлення, ми штучно маніпулювали його активністю під час циклів, керованих PRN. Після гіперполяризації спостерігалося значне збільшення активності CV1a (рис. 4, G і H) без доказів фазового гальмування синаптичних сигналів, які він зазвичай отримує. Крім того, гіперполяризація PS1 також була достатньою для підвищення активності CV1a під час сенсорно керованих циклів виведення (рис. S9B). Таким чином, цей ключовий тип гальмівних нейронів діє як перемикач під час вибору дій, запобігаючи руйнівній активації командних центрів прийому під час засвоєння.

Оскільки CV1a не має моносинаптичного зв’язку з PRN, як він забезпечує пригнічення виділення, коли він активний? Ми змогли відповісти на це запитання, визначивши другий компонент ланцюга керування: тип буккального інтернейрону, PS2, який був міцно електрично пов’язаний із PRN і був достатнім для керування надійними циклами егекції (рис. S9, C і D). Він отримує сильне полегшене інгібування від CV1a і, таким чином, призводить до пригнічення виділення, коли генеруються цикли прийому (рис. S9, E та F). Крім того, штучна активація PS2 спричинила полісинаптичні гальмівні дії на CV1a, що виникають через його моносинаптичне збудливе з’єднання з PS1 (рис. S9, G і H). Разом ці результати демонструють, що взаємне гальмування використовується для запобігання активації конкурентних ланцюгів і що цей мотив ланцюга забезпечує контрольну точку, на яку може діяти пластичність (fFigS9I). Далі ми досліджували можливу роль придушення ланцюга егесії у зміщенні сприйняття подій навчання.

Маніпуляція ланцюгом управління сприйняттям дозволяє нове навчання in vivo

З огляду на те, що це сприяє вираженню поведінки егесії, ми припустили, що зниження активності PRN → PS1 може бути достатнім, щоб змінити сприйняття твариною слабкого тренування і, таким чином, покращити набуття пам’яті. Щоб дослідити це, ми розробили фармакологічну стратегію, яка дозволила нам маніпулювати шляхом виведення PRN. Раніше ми показали, що цей нейрон є дофамінергічним і що блокатор рецептора D2, сульпірид, є високоефективним у пригніченні його дії на наступні мотонейрони (16). Тут ми підтвердили, що з’єднання PRN → PS1 також є чутливим до сульпіриду (рис. 5, A і B), спричиняючи значне зниження амплітуди PRN → PS1 EPSP. Далі ми перевірили, чи може блокування цього зв’язку імітувати збільшення активності CV1a, що спостерігається через 4 години після інтенсивного тренування. Ми виявили, що сульпірид спричинив значне підвищення активності циклу CV1a порівняно з попереднім лікуванням (рис. 5, C і D), що узгоджується з нашою попередньою роботою, яка показала, що застосування сульпіриду зміщує активність у бік подій проковтування (16). Таким чином, сульпірид може суттєво змінювати стан мережі, замінюючи ефекти сильного тренування. Таким чином, цей агент дає можливість перевірити in vivo, чи лежить цей шлях в основі зміненого сприйняття твариною слабкого навчання. Тваринам вводили або сульпірид, або звичайний фізіологічний розчин, і вони проходили протокол слабкого навчання з реакцією на годування, виміряною, як показано на рис. 2 (A і B). Ми виявили, що тварини, яким вводили сульпірид, виконували значно більше подій проковтування у відповідь на слабке тренування, ніж тварини, яким вводили фізіологічний розчин (рис. 5, E–G), і значно більше тварин, яким вводили сульпірид, взагалі не виявляли відповіді на проковтування (рис. 5Н). Крім того, спостерігалося значне зниження ймовірності переходу між станами після ін’єкції сульпіриду (рис. S10, A–D). Тому як інтенсивне тренування, так і ін’єкція сульпіриду змінюють стан мережі in vitro та стабілізують сприйняття слабкого тренування in vivo.
Далі ми перевірили, чи було зрушення у сприйнятті, викликане сульпіридом, достатнім для придбання LTM після слабкого тренування, як ми показали у випадку сильного тренування. Тваринам вводили сульпірид або фізіологічний розчин, а потім проходили слабке тренування з тестуванням LTM через 1 день. Відповідно до ефектів інтенсивного тренування, ми виявили, що тварини, яким вводили сульпірид перед слабким тренуванням, мали значно більшу реакцію на GNL порівняно з наївними тваринами або тваринами, яким вводили фізіологічний розчин (рис. 5I). Крім того, ін’єкція сульпіриду за відсутності слабкого тренування не збільшила відповідь на годування на GNL при тестуванні через 1 день (рис. 5I). Таким чином, фармакологічне маніпулювання мережевим станом викликає зміну у сприйнятті слабкого тренування, якого достатньо для того, щоб тварина придбала та повністю закріпила пам’ять.

Далі ми перевірили, чи була ідентифікована індукована навчанням зміна стану мережі після життєво важливого навчання залучена до вираження початкової сильної пам’яті, чи це був паралельний процес, який служив меті покращення майбутніх подій навчання. Щоб перевірити це, ми вводили тваринам сульпірид або фізіологічний розчин і записували їхню реакцію на інтенсивне тренування CS (AA), але за відсутності попереднього життєвого тренування. Ми припустили, що якщо індукована навчанням зміна стану мережі була залучена до вираження оригінальної пам’яті, то харчова поведінка у відповідь на CS (AA), що використовується для інтенсивного тренування, буде посилена шляхом штучного викликання тієї ж зміни в мережі. стан із застосуванням сульпіриду, але за відсутності попередньої життєвої підготовки. Проте ми виявили, що ін’єкція сульпіриду не спричинила посилення відповіді на AA порівняно з тваринами, яким раніше не вводили фізіологічний розчин (рис. 5J). Таким чином, хоча життєво важливе тренування викликає зміну стану мережі, ця зміна, спричинена навчанням, не бере активної участі у вираженні самої сильної пам’яті, що свідчить про те, що задіяні різні механізми. Разом ці результати демонструють, що сильне навчання викликає паралельні зміни в нейронній активності: одна для вираження самої пам’яті, а інша для зміни сприйняття майбутнього апетитного навчання.

Пов'язані з пам'яттю зміни сприйняття узагальнюють альтернативну парадигму навчання

Яку роль відіграє описаний тут механізм? Здатність зв’язувати сильні та слабкі події навчання, які тісно пов’язані у часі, свідчить про те, що Lymnaea може використовувати цю здатність для ідентифікації «багатих навчанням» періодів, наприклад, сумісних із приходом тварини у щедрому середовищі. Якщо це так, ми очікуємо, що навчання має бути узагальненим, а не залежати від тих самих США як для сильної, так і для слабкої підготовки. Щоб перевірити цю важливу ідею, ми провели експерименти, в яких ми замінили сахарозу США, що використовується в протоколі слабкого тренування, L-серином (рис. 6A), відомим альтернативним стимулом апетиту в Lymnaea (29). Таким чином, і CS, і US відрізняються між двома різними парадигмами навчання. Ми виявили, що, незважаючи на те, що спаровування GNL + L-серин саме по собі не дало умовної відповіді, спостерігалося стійке 1--денне вираження пам’яті на GNL, якщо йому передувало сильне тренування (рис. 6B). Таким чином, вираження пам’яті не обмежується одним УЗ, а натомість може сприяти формуванню різних асоціацій, що свідчить про те, що було б дуже доцільно для забезпечення узагальненого зниження порогу для формування нових спогадів.

ДИСКУСІЯ

Здатність вивчати нові асоціації має вирішальне значення для виживання в непередбачуваному середовищі. З огляду на те, що накопичення та консолідація пам’яті є енергетично дорогими процесами (1, 2, 34), є ключові потенційні переваги у використанні стратегій, які допомагають приймати рішення про те, що і коли вчитися. Тут ми ідентифікуємо простий механізм у Lymnaea, за допомогою якого минулі події використовуються для упередження сприйняття. Примітно, що ми також демонструємо, що цей механізм може керувати майбутнім навчанням — полегшуючи запам’ятовування асоціацій, які раніше ігнорувалися, — і ми з’ясовуємо відповідальні нейронні ланцюги. Ми припускаємо, що це слугує для того, щоб попередити тварину про ефективне спрямування ресурсів на нове навчання, де останній досвід показує, що може бути особлива перевага у формуванні позитивних асоціацій.

Ключовою особливістю механізму, який ми з’ясовуємо, є те, що сильне навчання ініціює паралельні процеси в мозку: один для вираження початкової пам’яті, а інший – для зміни сприйняття майбутніх подій навчання та сприяння придбанню нової пам’яті. Вони здаються незалежними, оскільки зміна стану нейронної мережі, виміряна після сильного тренування, недостатня для вираження оригінальної пам’яті, про що свідчить відсутність помилкової пам’яті, коли стан мережі змінюється фармакологічно. Подібні паралельні шляхи були виявлені в експериментах з кондиціонуванням на мишах. Наприклад, у завданні нюхової дискримінації інтенсивне навчання змінило збудливість пірамідних нейронів грушоподібної кори, що збігалося з розширеною здатністю вивчати нові завдання (вивчення правил), але це не корелювало з вираженням початкової пам’яті (35). , 36). Таким чином, незважаючи на те, що ці зміни, спричинені навчанням, не є частиною «енграми», що виражає пам’ять, вони, тим не менш, виконують критичні адаптивні функції у тварин, дозволяючи їм використовувати їхній минулий досвід, щоб керувати своєю майбутньою поведінкою — процес, мабуть, такий же важливий, як і пригадування. самої пам'яті.

Механізм, який ми ідентифікували, демонструє ключові характеристики часу. Це дозволяє розширити можливості навчання від 30 хвилин до 4 годин після інтенсивного тренування, припускаючи, що придбання нової пам’яті полегшується в критичному часовому вікні. Згідно з нашою попередньою роботою, цей часовий проміжок узгоджується з появою середньочасової пам’яті для сильного навчання і триває до появи LTM (17). Вираження цієї пам’яті протягом цього періоду часу залежить від синтезу білка, тоді як слід пам’яті, записаний у коротший, 10-хвилинний момент часу, не залежить (17). Це переконливо свідчить про те, що зміна стану мережі, виявлена ​​в нашому поточному дослідженні, також залежить від синтезу білка, що пояснює відсутність ефекту через 10 хвилин після сильного тренування. Крім того, покращена здатність до навчання не зберігається в більш тривалий час: формування слабкої навчальної пам’яті відсутнє приблизно з 6 годин, хоча початкова сильна пам’ять все ще присутня та виражається. Таким чином, індукований навчанням зсув у стані мережі є тимчасово індукованим і не переживає молекулярні механізми, які, як відомо, необхідні для консолідації початкової пам’яті протягом перших 6 годин після інтенсивного тренування (37). Ми припускаємо, що постійна зміна сприйняття через минуле навчання може бути шкідливою для тварини, призводячи до енергетично дорогих і потенційно дезадаптивних спогадів. Існує також вимога щодо суворої послідовності у часі сильних і слабких тренувань. Це відрізняється від раніше визначеного процесу, поведінкового мічення (38, 39), який полегшує взаємодію та покращення спогадів на основі синаптичних міток і захоплення (40, 41). Під час поведінкового мічення мітка, що приводиться в рух слабкою подією навчання, націлюється та посилюється сильною подією навчання незалежно від часової послідовності двох подій навчання (42, 43).

Ця ключова особливість поведінкового маркування призводить до зміни пам’яті події, а не самої події навчання. Навпаки, зміна сприйняття, спричинена навчанням, яку ми тут ідентифікуємо, спрямовує тварину вирішувати, про які майбутні події дізнаватися, а не про те, які нещодавно придбані спогади слід додатково консолідувати. Таким чином, хоча ці два механізми мають деякі паралелі та обидва служать для збільшення кількості консолідованих довгострокових спогадів, вони функціонують за різних обставин і використовують різні механізми схеми. Ми також демонструємо, що індукований навчанням зсув у сприйнятті узагальнює інші форми апетитного навчання, оскільки другий тип слабкого апетитного навчання також може бути посилений минулим сильним навчанням. Подібне узагальнене покращення здатності до навчання було виявлено у мишей, де, як вважають, залежне від гіпокампу навчання розрізнення нюху перемикає мережу гіпокампу в «режим навчання», посилюючи інші типи залежного від гіпокампу навчання, наприклад просторове навчання (44). ). Хід часу та неспецифічний характер механізму, виявленого в Lymnaeae, можуть служити для того, щоб попередити тварину про «багатий навчанням» період, що дозволяє робити позитивні асоціації з сигналами, які, якби вони зустрічалися окремо, швидше за все, були б проігноровані.

Який механізм сприяє слабкому тренуванню після сильного? Ми зазначаємо, що наївні тварини, які піддавалися слабкому тренуванню «перекидання», або перехід між поведінкою ковтання та ковтання, припускаючи, що тварина має бістабільне сприйняття стимулів CS + US під час навчання, що представляє період неоднозначності ( 45). Примітно, що ми також виявили, що сильне навчання змінює та стабілізує сприйняття твариною слабкого навчання, щоб сприяти поведінці ковтання. Ми припускаємо, що бістабільне сприйняття під час слабкого тренування є властивістю, що виникає відносної активності ланцюгів ковтання та ковтання, оскільки те саме перемикання зберігається in vitro за відсутності будь-якої зовнішньої стимуляції. Характеризуючи зв’язок між двома ланцюгами, ми показуємо, що конкурентні взаємодії зумовлені мотивом схеми взаємного гальмування (32, 46), припускаючи, що вибір дій, ймовірно, породжується моделлю «переможець отримує все». Інгібування прямого зв’язку з ланцюга засвоєння запобігає коактивації ланцюга поглинання (PRN + PS2 → PS1 → CV1a), тоді як ланцюг поглинання безпосередньо пригнічує частину електрично пов’язаного ланцюга поглинання (CV1a → PS2) (рис. 6C і рис. S9I).

Оскільки обидва контури іннервуються одним і тим же центральним живильним генератором шаблону (16, 31), ми припускаємо, що вираження циклу диктується першим контуром, щоб досягти достатнього порогу частоти спайків для інгібування іншого. Після сильного тренування відбувається зсув у відносній активності двох ланцюгів, і, таким чином, експресія циклів прийому їжі є домінуючою (рис. 6C). Подібний мотив схеми спостерігається під час кондиціонування страху у мишей, де може бути створена одна з двох несумісних поведінок: втеча або заморожування. Навчання зміщує баланс двох реципрокних гальмівних класів нейронів у центральній мигдалині, що зміщує експресію в бік однієї чи іншої поведінки (47). Однак у Lymnaea зміна активності, викликана навчанням, використовується не для вираження пам’яті, а скоріше для сприяння новому навчанню (рис. 6C). Ми показуємо, що фармакологічної стабілізації ланцюга ковтання шляхом блокування прямого інгібування ланцюга ковтання достатньо, щоб змінити сприйняття твариною CS + US під час слабкого навчання in vivo. Крім того, ми показуємо, що це може замінити придбання міцної пам’яті, зміщуючи стан мережі, щоб увімкнути нові позитивні асоціації, припускаючи, що формування пам’яті може бути полегшено шляхом зменшення неоднозначності під час навчальної події. Попередні дослідження на людях продемонстрували, що попереднє навчання може змінити контроль уваги, який налаштовує сприйнятливу чутливість (3–5), а також було показано, що увага відіграє роль у мультистабільності сприйняття (45, 48).

Хоча в цьому дослідженні було виміряно лише сприйняття тварини, можливо, що механізм, визначений тут, також включає зміщення уваги, яке могло б модулювати сприйняття слабкого навчання. Той факт, що зсув у стані мережі присутній до впливу слабкого навчання, може свідчити про наявність механізму випереджаючої уваги, який, у свою чергу, налаштовує сприйняття майбутніх навчальних подій. Однак, якщо бере участь таке переміщення уваги, воно здатне модулювати сприйняття і, таким чином, посилювати формування нової пам’яті приблизно через 30 хвилин після сильного тренування.

Чому стабілізація мережі до подій прийому сприяє слабкому навчанню? Одне просте пояснення полягає в тому, що під час ковтання тварина активно втягує КС і УЗ в ротову порожнину, а потім в стравохід, дозволяючи кожному проковтнути. Це контрастує з егецією, коли вміст ефективно викидається із щічної порожнини. Попередня робота продемонструвала, що успішне кондиціонування in vitro залежить від досягнення УЗ стравоходу (17) та активації нейронів стравоходу (49), які підсилюють КС через активацію рецептора D1 у наступних нейронах (50–52). Таким чином, сприяння циклам прийому буде сприяти збільшенню досягнення УЗ і активації цих нейронів, таким чином посилюючи CS + УЗ.

Тут ми розкрили поки що невідомий механізм, за допомогою якого зміни у сприйнятті можуть поєднувати попереднє та нове навчання за певних умов і часових рамок. Ми припускаємо, що це може служити загальним механізмом встановлення стану, дозволяючи тварині формувати асоціації між новими комбінаціями стимулів, які окремо були б недостатніми для індукції пам’яті. Оскільки зв’язки між навчанням і змінами сприйняття добре встановлені у вищих тварин, включаючи людей, ми припускаємо, що шлях навчання → сприйняття → навчання може бути широко збереженою особливістю, яка заслуговує на подальшу увагу в дослідженнях навчання. З огляду на те, що формування LTM пов’язане зі збільшенням енергетичних витрат — зокрема, залучення та залучення молекулярних механізмів для консолідації пам’яті — механізм, який спрямовує навчання, має потенційно важливе значення для виживання. У випадку тварин, які шукають їжу, таких як Lymnaea, які працюють з обмеженим бюджетом енергії (53), вивчення різних асоціацій є дуже корисним, попереджаючи їх про потенційні джерела їжі або можливі небезпеки в їхньому середовищі, але це потрібно збалансувати з енергією витрати на консолідацію цих спогадів. Таким чином, цей механізм дозволяє їм налаштувати своє майбутнє навчання на минулі успіхи навчання, ефективно знижуючи поріг, необхідний для вивчення нових асоціацій.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Утримання тварин

Тварин утримували групами у великих резервуарах, що містили воду без міді при температурі 20 градусів за 12-години світла/12-години темряви. Тварин годували листям салату тричі на тиждень і кормом для риб на рослинній основі (Tetra-Phyll; TETRA Werke, Melle, Німеччина) двічі на тиждень. Тварин переводили в менші резервуари для зберігання і позбавляли їжі протягом 2 днів перед експериментами. Для всіх експериментів використовували дорослих (3-4-місячних) равликів (Lymnaea stagnalis). Lymnaea — це нижчий безхребетний (молюск) організм, який не підпадає під дію Закону про тварин (наукові процедури) 1986 року (Великобританія). Таким чином, для цих експериментів не було потрібно жодного етичного схвалення чи вказівок.

Процедури одноразового тренування апетиту та тестування

Потужне кондиціювання апетиту в одному дослідженні було виконано шляхом поєднання AA (0.004%) як CS із сахарозою ({{10}}).33% ), як у США, використовуючи раніше добре описаний метод (23, 24). Слабке кондиціонування апетиту в одному дослідженні було виконано шляхом поєднання GNL (0.004%) як CS із сахарозою (0,11%) або L-серином (0,11%) як США. В експерименті з контролем противаги сильне кондиціонування проводили шляхом поєднання GNL як CS із сахарозою (0,33%) як США, а слабке кондиціонування проводили шляхом сполучення AA як CS із сахарозою (0,11%) як США. Коротко, тварин поміщали індивідуально в чашки Петрі, що містили 90 мл води, вільної від Cu2+-, на 10 хвилин, щоб акліматизуватися до нового середовища перед початком процедури навчання. У воду додавали п’ять мілілітрів КС, а через 30 с – 5 мл УЗ. Тварин залишали в розчині, що містив CS і US, на 2 хвилини, потім промивали водою, вільною від Cu2+-, і повертали в їхні домашні резервуари. Щоб перевірити реакцію CS через 1 день після кондиціонування, тварин із навчених груп і груп, які не отримували лікування, переносили з їхніх домашніх акваріумів у чашку Петрі, наповнену 90 мл води, вільної від Cu2+-, і давали акліматизуватися протягом 10 хвилин.

Потім у тарілку додавали п’ять мілілітрів води та підраховували кількість реакцій на годування (укусів) протягом наступних 2 хвилин. Далі в чашку додавали 5 мл КС і підраховували кількість відповідей на годування протягом наступних 2 хв. Відповіді CS потім оцінювали за допомогою «оцінки різниці» (∆ кількість укусів). Це було отримано шляхом віднімання кількості циклів годування, що спостерігалися протягом 2 хвилин після внесення води, від кількості циклів годування через 2 хвилини після внесення CS. Під час експериментів з подвійним кондиціонуванням тварини отримували як сильний, так і слабкий апетит, розділені інтервалами часу, як описано в результатах. Щоб перевірити, чи попередня експозиція до УЗ під час інтенсивного тренування (0.33% сахарози) покращила слабке тренування, ми провели інтенсивне тренування, як описано вище, але за відсутності презентації CS (AA). Потім через 4 години тварини отримували слабке тренування GNL і сахарози (0.11%), а через 1 день перевіряли їх реакцію на GNL.

Вимірювання сприйняття під час слабкої підготовки

Вплив минулого навчання на сприйняття твариною слабкого тренування перевіряли шляхом виконання життєво важливого тренування з подальшим слабким тренуванням через 4 години, як зазначено вище. Під час слабкої презентації CS + US реакції тварин на годування знімалися на відео (33 кадри/с) знизу. Напрямок руху радули та нижньої структури одонтофора вимірювали протягом перших 15 відповідей на годування, як у (16). Коротко кажучи, положення дорсальної нижньої щелепи було вперше позначено в кадрі, що передує першому кадру, в якому радулу було видно під час кожного укусу за допомогою програмного забезпечення ImageJ. Потім радулу відстежували протягом усього прикусу та обчислювали відстань від початкового положення дорсальної нижньої щелепи. Потім була виміряна середня різниця між кадрами. Таким чином, негативна оцінка вказувала на те, що радула та дорсальна нижня щелепа були віддалені на початку прикусу, а радула рухалася до дорсальної нижньої щелепи під час укусу, тоді як позитивна оцінка представляла нижню щелепу та радулу, які були близько одна до одної на початку укусу. і радула відходить у міру прогресування укусу. Критерії для визначення того, чи була реакція ковтанням чи ковтанням, ґрунтувалися на тому, чи була різниця в русі негативною (ковтання) чи позитивною (ковтання). Щоб визначити, як попереднє життєве тренування змінює стабільність сприйняття CS + US, що використовується при слабкому тренуванні, були проаналізовані пари послідовних укусів. Стабільна пара укусів була класифікована як два однакові послідовні укуси (ковтання-ковтання або егест-егест). Перемикання пари укусів було класифіковано як два різні послідовні укуси (проковтування або проковтування).

Тоді ймовірності переходу були розраховані шляхом підрахунку кількості перемикаючих укусів, виражених як частка від загальної кількості пар укусів. Щоб перевірити, чи змінило сприйняття слабкого тренування попередній вплив УЗ під час інтенсивного тренування ({{0}}.33% сахарози), ми провели інтенсивне тренування, як описано вище, але за відсутності презентації CS (AA) і виміряна поведінка проковтування/проковтування, як зазначено вище. Щоб перевірити, чи попереднє слабке тренування змінило сприйняття пізнішого слабкого тренування, тварини спочатку отримували AA в поєднанні з 0.11% сахарозою, а потім їхні відповіді на ковтання/поглинання GNL і 0.11% сахарози були оцінені вимірювали через 4 години. Щоб перевірити вплив інтенсивного тренування на реакцію тварини на CS або УЗД, які використовуються під час слабкого тренування, тварини проходили інтенсивне тренування, як зазначено вище. Через чотири години тварин помістили в чашку Петрі з 90 мл води, вільної від Cu2+-, і дали акліматизуватися протягом 10 хвилин. Потім вони отримували 5 мл води, і їхні відповіді на годування підраховувалися. Згодом вони отримали 5 мл або GNL, або 0,11% сахарози, і відповіді на годування підраховувалися, щоб число укусів ∆ можна було розрахувати, як зазначено вище.

Препарати та електрофізіологічні методи

Дотримуючись процедур, описаних раніше в (16), ми провели експерименти in vitro з використанням ізольованого препарату ЦНС. Невелика ділянка передньої частини стравоходу була прикріплена до ЦНС дорсальними щічними нервами. Препарати перфузували фізіологічним розчином, що містив 50 мМ NaCl, 1,6 мМ KCl, 2 мМ MgCl2, 3,5 мМ CaCl2 і 10 мМ буфер Hepes у воді. Моносинаптичні зв'язки перевіряли шляхом промивання препарату високо двовалентним (HiDi) фізіологічним розчином, який підвищує поріг потенціалу дії, зменшуючи полісинаптичні зв'язки. Фізіологічний розчин HiDi складався з 35.0 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 8.0 мМ MgCl2, 14,0 мМ CaCl2 і 10 мМ буфера Hepes у воді. Внутрішньоклітинні записи проводили з використанням гострих електродів (від 10 до 40 МОм), наповнених 3 М KAc і 0,5 мМ KCl. Сигнали збирали за допомогою підсилювачів NL 102 (Digitimer Ltd.) і Axoclamp 2B (Axon Instrument, Molecular Device), а дані отримували за допомогою інтерфейсу micro 1401 Mk II і аналізували за допомогою програмного забезпечення Spike2 (Cambridge Electronic Design, Кембридж, Великобританія).

Ідентифікація нейронів

Мотонейрон B11, що перемикає фази, розташований у буккальних гангліях і був ідентифікований на основі його розташування, форми шипа, синаптичних входів від PRN та здатності перемикати свою структуру активності під час прийому їжі та циклів висмоктування (16). Інтернейрон CV1a, подібний до команди ковтання, розташований у церебральних гангліях і був ідентифікований за його електричними властивостями, характерним розташуванням і здатністю керувати фіктивними циклами живлення, коли штучно деполяризований до вогняних спайків (31). Інтернейрон PRN, подібний до команди егесії, розташований у буккальних гангліях і був ідентифікований за його розташуванням і моносинаптичним збуджуючим зв’язком з B11. Нейрон N2v є центральним інтернейроном генератора шаблону, розташованим на вентральній поверхні щічних гангліїв. Його можна ідентифікувати за характерним плато під час фази ретракції циклу, а штучна активація викликає широку активність фази ретракції в багатьох буккальних нейронах (25). В9 — мотонейрон фази ретракції, розташований у щічних гангліях. CGCs — це великі серотонінергічні інтернейрони, розташовані в церебральних гангліях, які можна ідентифікувати за їхнім розміром, розташуванням і активністю тоніко-спайки (30). Щоб ідентифікувати раніше неохарактеризовані кандидати в члени егестаційної мережі, ми заповнили церебрально-буккальну сполучну (CBC) флуоресцентним барвником, 5(6)-карбоксифлуоресцеїном (5-CF). Відомо, що проекційні інтернейрони впливають на рухову структуровану активність у Lymnaea (30, 31), а нейрони, що керують егецією, були ідентифіковані в щічних гангліях (16). Заповнення CBC виявило популяцію буккальних проекційних інтернейронів, які ми могли повторно ідентифікувати в інших препаратах і перевірити електрофізіологічно. Нейрони, що представляють інтерес, були пронизані та записані за допомогою нейронів, подібних до команди ковтання та висмоктування.

Аналіз та класифікація циклів in vitro

Активність на B11 ​​вимірювали щодо початку фази ретракції, що визначається плато N2v або великим збудженням інтернейрона B9 у фазі ретракції. Щоб проаналізувати відносну активність B11 у циклі, її вимірювали за 4 с до та 4 с після початку фази ретракції. Кількість спайків B11 після початку фази ретракції віднімали від кількості спайків B11 перед початком фази ретракції, а потім ділили на загальну кількість спайків за період 8-s, щоб отримати нормалізований бал різниці. Використовуючи цю оцінку, позитивне значення означає більше активності, що відбувається перед початком фази ретракції, і тому класифікується як цикл егекції. Негативний бал означає більшу активність, що відбувається після початку фази ретракції, і тому класифікується як цикл прийому їжі. Щоб порівняти вплив сильного тренування на фіктивні цикли годування in vitro, перші 10 спонтанних циклів були проаналізовані з 19 наївних і 19 тренованих препаратів. Щоб визначити, як тренування змінює стабільність експресії циклу, були проаналізовані пари послідовних циклів. Стабільна пара циклів класифікувалася як два однакових послідовних циклу (інгест-інгест або егест-егест).

Пара циклів перемикання була класифікована як два різні послідовні цикли (інгест-еґест або еґест інгест). Потім були розраховані ймовірності переходу шляхом підрахунку кількості циклів перемикання, виражених як частка від загальної кількості пар циклів. Щоб перевірити, чи життєво важливі тренування змінюють реакцію препарату на сигнали апетиту, ми стимулювали головний хемосенсорний шлях, MLN (28), який може керувати життєво важливим фіктивним годуванням (29). MLN стимулювали за допомогою скляного всмоктуючого електрода двофазними імпульсами 4 В із тривалістю 0.5- мс при 1 Гц протягом 120 с. Число ∆ фіктивного циклу живлення було розраховано шляхом реєстрації активності живильних мотонейронів, таких як B9, підрахунку кількості циклів, які відбулися в період 120- перед стимуляцією MLN, і віднімання цього числа від кількості циклів у відповідь на МЛН стимуляція. Активність CGC вимірювали за 120 с до та 120 с під час стимуляції MLN. Щоб викликати сенсорно кероване виділення in vitro, до стравоходу було застосовано тактильний стимул 1-s, який активував механосенсорні нейрони, які сигналізували аверсивні сигнали мережі живлення у відповідь на надмірне розтягнення кишечника через неїстівний предмет, який застряг у стравохід (16). Тактильний стимул застосовувався за допомогою механічного зонда, керованого транзисторно-транзисторним логічним імпульсом від micro 1401 Mk II (CED).

Іонофоретичне заповнення нейронів барвником

Following procedures previously described in (16), we filled target neurons with a fluorescent dye (5-CF) using a microelectrode. This was achieved iontophoretically using a pulse generator to apply regular interval negative square current pulses into the neuron for >30 хв. Потім препарати залишили на ніч при 4 градусах. Зображення нейронів були отримані за допомогою цифрової камери (пристрій із зарядовим зв’язком електронного розмноження Andor Ixon), встановленої на стереомікроскопі Leica.

Застосування блокатора рецепторів D2 in vitro та in vivo

Сульпірид є ефективним антагоністом дофаміну в Lymnaea, блокуючи вплив дофамінергічних інтернейронів на наступні нейрони, а також фокусне застосування дофаміну (16, 54). Щоб перевірити вплив сульпіриду (±) (Sigma-Aldrich) на з’єднання PRN → PS1, препарати спочатку промивали сольовим розчином HiDi (див. вище). Базові амплітуди EPSP реєстрували перед тим, як 10-4 М сульпіриду в фізіологічному розчині HiDi перфузували у ванну протягом 10 хвилин, а потім амплітуди EPSP записували знову. Щоб перевірити вплив сульпіриду на генерацію циклу in vitro в наївних препаратах, реєстрували перші 10 спонтанних циклів, а потім у препарат перфузували 10-4 М сульпіриду у фізіологічному розчині. Були проаналізовані перші 10 спонтанних циклів, що виникли після 10 хвилин перфузії. Щоб перевірити вплив сульпіриду на сприйняття слабкого тренування та запам’ятовування/пригадування, тваринам вводили 100 мкл 10-3 М сульпіриду у звичайному фізіологічному розчині. Раніше було показано, що введена концентрація препарату розбавляється в ~10-разів рідинами тіла тварини (55). Контрольним тваринам вводили лише 100 мкл фізіологічного розчину. Тварин залишали на 2 години перед проведенням поведінкових тестів.

Аналіз даних

Дані були проаналізовані за допомогою палеонтологічної статистики (PAST версія 4.1) (56) і виражені у вигляді графіків дощових хмар (57). У всіх випадках окремі точки відображаються у вигляді крапок, а заштрихована область (хмара) вказує на загальну форму розподілу від мінімальних до максимальних значень. Внутрішні коробкові діаграми показують медіану (чорна лінія), інтерквартильний діапазон (перший і третій квартиль) і середнє значення (сіра лінія). Кожне «n» означає окрему тварину/препарат. Нормальність перевіряли за допомогою тесту Шапіро-Вілка. Двогрупові статистичні порівняння проводили з використанням двосторонньої статистики t-критерію (парної чи непарної, як зазначено в тексті) або тесту Манна-Уітні чи тесту Вілкоксона зі знаком рангу для непараметричних даних. Дані з більш ніж двома групами спочатку аналізували за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу (ANOVA) або тесту Крускала-Уолліса. Подальші порівняння проводили за допомогою тестів Tukey або Dunn's post hoc з послідовною корекцією Бонферроні. Порівняння між відсотком укусів/циклів, класифікованих як проковтування або проковтування, та кількістю тварин/препаратів, які виконали нуль або більше нуля циклів проковтування, проводили за допомогою точного критерію Фішера. Рівень значущості був встановлений на рівні P < 0.05.

ЛІТЕРАТУРА ТА ПРИМІТКИ

1. Ф. Мері, Т. Дж. Кавецький, Вартість довгострокової пам'яті у дрозофіли. Science 308, 1148 (2005).

2. П.-Й. Plaçais, T. Preat, Щоб сприяти виживанню в умовах нестачі їжі, мозок відключає дорогу пам'ять. Science 339, 440–442 (2013).

3. AC Nobre, MG Stokes, Premembering experience: A Hierarchy of time-scales for proactive attention. Нейрон 104, 132–146 (2019).

4. ML Rosen, CE Stern, SW Michalka, KJ Devaney, DC Somers, Внесок когнітивної контрольної мережі в зорову увагу, керовану пам’яттю. церебр. Cortex 26, 2059–2073 (2016).

5. М. Г. Стокс, К. Атертон, Е. З. Патаї, А. С. Нобре, Довготривала пам'ять готує нейронну активність до сприйняття. Proc. Natl. акад. Sci. США 109, E360–E367 (2011).

6. YL Chew, Y. Tanizawa, Y. Cho, B. Zhao, AJ Yu, EL Ardiel, I. Rabinowitch, J. Bai, CH Rankin, H. Lu, I. Beets, WR Schafer, Аферентна нейропептидна система передає механосенсорні сигнали, що викликають сенсибілізацію та збудження у C. elegans. Нейрон 99, 1233–1246.e6 (2018).

7. Дж. Фелсенберг, П. Ф. Джейкоб, Т. Уокер, О. Барнстедт, А. Дж. Едмондсон-Стейт, М. В. Плейзієр, Н. Отто, П. Шлегель, Н. Шаріфі, Е. Періссе, К. С. Сміт, Дж. С. Лауріцен, М. Коста , Г. Джефферіс, Д. Д. Бок, С. Уодделл, Інтеграція паралельних протилежних спогадів лежить в основі зникнення пам’яті. Cell 175, 709–722.e15 (2018).

8. J. Huang, Z. Zhang, W. Feng, Y. Zhao, A. Aldanondo, MG de Brito Sanchez, M. Paoli, A. Rolland, Z. Li, H. Nie, Y. Lin, S. Zhang , M. Giurfa, S. Su, бажання їжі опосередковується тимчасовою активацією дофамінергічної сигналізації в мозку медоносної бджоли. Science 376, 508–512 (2022).

9. PF Jacob, S. Waddell, Spaced training forms complementary довгострокові спогади протилежної валентності у Drosophila. Нейрон 106, 977–991.e4 (2020).

10. С. Саїн, Ж.-Ф. Де Бакер, К. П. Сіджу, М. Є. Восняк, Л. П. Льюїс, Л.-М. Frisch, B. Gansen, P. Schlegel, A. Edmondson-Stait, N. Sharifi, CB Fisher, SA Calle-Schuler, JS Lauritzen, DD Bock, M. Costa, GSXE Jefferis, J. Gjorgjieva, IC Grunwald Kadow, A нейронний ланцюг вирішує між наполегливістю та відходом у голодної дрозофіли. Нейрон 104, 544–558.e6 (2019).

11. Б. Сенапаті, К.-Х. Цао, Ю.-А. Хуан, Т.-Х. Чіу, К.-Л. Wu, S. Waddell, S. Lin, Нервовий механізм для депривації стану специфічного вираження відповідних спогадів у дрозофіли. Нац. Неврологія. 22, 2029–2039 (2019).

12. K. Steck, SJ Walker, PM Itskov, C. Baltazar, JM Moreira, C. Ribeiro, Внутрішній амінокислотний стан модулює дріжджові смакові нейрони для підтримки білкового гомеостазу у дрозофіли. eLife 7, e31625 (2018)

For more information:1950477648nn@gmail.com