3-адренергічний рецептор на лімфоцитах, що інфільтрують пухлину, підтримує IFN{2}}залежну експресію PD-L1 і послаблює протипухлинний імунітет при нейробластомі
Oct 19, 2023
Нейробластома (НБ) — гетерогенна екстракраніальна пухлина, що виникає в дитячому віці. Відмінною особливістю пухлин НБ є їх нейроендокринна здатність виділяти катехоламіни, які, у свою чергу, через перев’язку β-адренергічних рецепторів можуть впливати на різні сигнальні шляхи в мікрооточенні пухлини (ММЕ). Раніше було продемонстровано, що специфічний антагонізм 3-адренергічного рецептора (3- AR) на пухлинних клітинах NB впливає на ріст і прогресування пухлини. Тут, у мишачій сингенній моделі NB, ми мали на меті дослідити, чи 3-модуляція AR вплинула на відповідь імунної системи господаря проти пухлини. Результати продемонстрували, що антагонізм 3-AR призводить до реактивації імунної відповіді, частково залежної від залучення сигнальної осі PD-1/PD-L1. Дійсно, 3- блокада AR на лімфоцитах, що інфільтрують пухлину (TIL), послабила їх здатність секретувати IFN-, що, у свою чергу, зменшило експресію PD-L1, спричинену інфільтрацією TIL, на клітинах пухлини NB. Подальші дослідження шляхом геномного аналізу пацієнтів з NB показали, що висока експресія гена ADRB3 корелює з гіршими клінічними результатами порівняно з групою з низькою експресією, і що експресія гена ADRB3 впливає на різні шляхи, пов’язані з імунною системою. Загалом результати показують, що 3-AR у NB TME здатний модулювати взаємодію між пухлиною та імунною системою хазяїна, і що його антагонізм вражає численні пропухлинні сигнальні шляхи.
Графічний Анотація
ВСТУП
Нейробластома (НБ) є складним і гетерогенним захворюванням, найпоширенішим видом раку, діагностованим на першому році життя. NB — це нейроендокринна пухлина, яка виникає з коммітованих клітин-попередників нервового гребеня під час розвитку симпатичної нервової системи (SNS). Це відмінне походження визначає локалізацію пухлини, яка зазвичай виникає в наднирковій залозі та/або симпатичних гангліях [1]. Клінічна поведінка NB дуже різноманітна, починаючи від пухлин, які спонтанно регресують, до інших, які стали резистентними до всіх доступних методів лікування, включаючи інтенсивну хіміотерапію, хірургічне втручання, променеву терапію, аутологічну трансплантацію стовбурових клітин і введення ретиноїдів (13-цис-ретиноєвої кислота) [2]. Тому необхідні альтернативні терапевтичні мішені для цих нечутливих пухлин. Імунотерапія на основі інгібіторів імунних контрольних точок (ICI) є найбільш перспективною стратегією для кількох солідних пухлин [3]. Серед іншого, сигнальна вісь ліганду програмованої смерті-1/програмованої смерті-1 (PD-L1/PD-1) порушує імунітет ефекторних Т-клітин і підвищує імунну толерантність пухлинних клітин, відіграючи ключову роль роль у ослабленні протипухлинних реакцій як у миші, так і у людини [4, 5]. Однак, хоча численні дослідження вже досліджували механізми, що лежать в основі сигналізації PD-1/PD-L1 при раку у дорослих, мало що відомо про педіатричні пухлини. Складний перехресний зв’язок між SNS та імунною системою через вивільнення катехоламіну та активацію передачі сигналів β-адренорецепторів здатний визначити долю прогресування пухлин у багатьох пухлинах [6]. Це може бути особливо вірним для пацієнтів з NB, у яких дійсно підвищений рівень катехоламінів відображає тяжкість злоякісного новоутворення [7]. Підтип 3-адренорецепторів (3-AR) нещодавно було ідентифіковано як критичний регулятор раку [8–10]. Зокрема, його експресія та активація як на пухлинних, так і на стромальних клітинах пухлинного мікрооточення (TME) викликала пропухлинні сигнальні шляхи, відповідальні за прогресування пухлини в різних доклінічних моделях [11–14]. Тут, у сингенній мишачій моделі NB, ми продемонстрували, що 3-AR на лімфоцитах, що інфільтрують пухлину (TIL), підтримує IFN- - залежну регуляцію PD-L1 на пухлинних клітинах, що, у свою чергу, призводить до імуносупресивний ТМЕ, відповідальний за вихід пухлини. Крім того, 3-антагонізм AR зміг збільшити кількість імунореактивних CD8+, природних кілерів (NK) і дендритних клітин (DC), а також зменшити кількість імуносупресивних регуляторних клітин Т-клітини (Treg) і мієлоїдні супресорні клітини (MDSC) при ТМЕ. Крім того, аналіз Каплана–Майєра показав, що висока експресія гена ADRB3 була пов’язана з поганою виживаністю пацієнтів з NB, а аналіз різних доступних наборів даних про експресію NB виявив значну кореляцію між рівнем експресії гена ADRB3 та генами, залученими в сигнальні шляхи, пов’язані з взаємодія імунної системи та пухлини.
Переваги cistanche tubulosa - Протипухлинний
МЕТОДИ
Культура клітин
Мишачі ракові клітини нейро-2A NB були отримані з ATCC (CCL-131) і вирощені в DMEM з додаванням 10% FBS, 2 мМ L-глутаміну, 100 ОД·мл-1 пеніциліну та 100 мкг·мл-1 стрептоміцину при 37 градусах у насиченій водою атмосфері 5% CO2. Нейро-2клітини регулярно перевіряли на контамінацію мікоплазмою.
Сингенна мишача модель пухлини
Самки мишей NCI A/JCr віком 4 тижні були куплені в Charles River Laboratories (Frederick). Клітини нейро-2a (N2A) підшкірно імплантували мишам-реципієнтам A/J шляхом ін’єкції 1 × 106 клітин у 100 мкл PBS у правий бік. Коли клітини N2A утворили пухлину, яку можна пальпувати (приблизно через 8 днів), почали лікування. Обробку проводили двічі на день для SR59230A (Tocris Bioscience) і наповнювача (фізіологічний розчин), а також на 8 і 12 день для антитіл PD-L1 (InVivoMAb проти мишачих PD-L1 (B7-xhH1) #BE0101 , Bio X Cell) та ізотипний контроль (InVivoMAb щурячий IgG2b ізотипний контроль # BE0090, Bio X Cell). Контрольне введення ізотипу IgG2b дало ті самі результати для носіїв, тому на малюнках показано лише стан носія. SR59230A доставляли у дозі 10 мг/кг у фізіологічному розчині внутрішньоочеревинно (ip); 250 мкг PD-L1 доставляли внутрішньовенно в 100 мкл буфера для розведення InVivoPure™ pH 6,5 (#IP0065); 250 мкг контрольної миші ізотипу IgG2b доставляли внутрішньовенно в 100 мкл буфера для розведення InVivoPure™ pH 7,0 (#IP0070). Лікування FTY720 (№ 6176, Tocris Biotechne) вводили у дозі 2 мг/кг per os (перорально) з дня 6. Швидкість росту пухлини оцінювали шляхом вимірювання маси пухлини за допомогою калібру, а об’єм маси пухлини розраховували як об’єм {{ 41}} [(довжина × ширина)2 /2]. Мишей умертвляли після 8 днів лікування.
Вестерн-блот аналіз
Клітини збирали та лізували в буфері RIPA, що містить суміш інгібіторів протеази. Після кількісного визначення 20 мкг загальних білків використовували для проведення аналізу SDS-PAGE та WB. Мембрани PVDF інкубували протягом ночі з первинними антитілами анти-PD-L1 (ab238697, Abcam), фосфо-CREB (ab32096, Abcam), CREB (ab32515, Abcam), p-PKA / / (sc- 32968, Santa Cruz Biotechnology), -актин (sc-1615, Santa Cruz Biotechnology), 3-AR (ab94506, Abcam) при 4 градусах, а потім зі специфічними вторинними антитілами протягом 1 години при кімнатній температурі. Зв’язування антитіл зі специфічними білками було виявлено за допомогою Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad), а зображення були отримані за допомогою Chemidoc Imaging System (Biorad®). Програмне забезпечення ImageJ використовувалося для виконання кількісного аналізу, і інтенсивність сигналу смуг була виражена як кратне збільшення відносно контрольних значень.
Спільне культивування для цитофлуориметричного аналізу PD-L1
Пухлинні клітини висівали на MW24 (45 000 клітин/лунку) і через 24 години спільно культивували з лімфоцитами, отриманими з TDLN мишей, які попередньо отримували протягом 2 днів Носій або SR59230A (T2), у Співвідношення висіву 1:10 (пухлина/лімфоцити). Наприкінці загального інкубаційного періоду (48 годин) лімфоцити вилучали разом із середовищем для спільного культивування обережним піпетуванням, а потім пухлинні клітини відокремлювали трипсинізацією та мічали антитілом проти PD-L1 (антитіло CD274 { {17}}, eBioscience™) для цитофлуориметричного кількісного визначення. Пофарбовані клітини отримували на проточному цитометрі MACSQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotec, Гладбах, Німеччина), а дані обробляли за допомогою програмного забезпечення Flowlogic (Miltenyi Biotec, Гладбах, Німеччина).
Спільне культивування для імунофлюоресценції PD-L1 та кількісного визначення IFN
Пухлинні клітини висівали на мікроскопічні предметні скла (20 000 клітин/лунку) в камері Nunc Lab-Tek слайд 4 і через 24 години спільно культивували з лімфоцитами, отриманими з TDLN мишей, які отримували протягом 2 днів носій або SR59230A (T2), у співвідношенні посіву 1:10 (пухлина/лімфоцити). Через 48 годин лімфоцити в культуральному середовищі збирали обережним піпетуванням, а потім відкидали центрифугуванням; супернатант використовували для кількісного визначення IFN- за допомогою технології Luminex xMAP відповідно до інструкцій виробника. Коротко, кількісне визначення IFN- у середовищі спільного культивування проводили за допомогою Bio-Plex Pro Mouse Cytokine IFN- Set (#171G5017M, Bio-Rad), а дані отримували за допомогою системи MAGPIX (Luminex, Техас, США). Аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення Bio-Plex Manager™ (BIO-RAD, Каліфорнія, США). Натомість пухлинні клітини на предметних стеклах мікроскопа використовували для проведення імунофлуоресцентного аналізу PDL1 наступним чином. Для імунофлуоресцентного аналізу клітини фіксували в 3% параформальдегіді в PBS протягом 20 хв. Пермеабілізацію досягали додаванням розчину, що містить Tween-20 0.5% у PBS протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Потім клітини блокували в 3% BSA протягом 1 години та інкубували з первинним антитілом анти-PD-L1 (ab238697, Abcam) протягом 2 годин. Згодом, після промивання в PBS, предметні скла інкубували з вторинним антитілом Alexa-fluor 488 протягом 1 години. Зображення були отримані за допомогою флуоресцентного мікроскопа (DMi8 - Leica microsystems).
Китайська трава цистанка рослина-Протипухлина
електропорація siRNA лімфоцитів для глушіння 1- 2- та 3-AR
Лімфоцити, отримані з TDLN, трансфікували siRNA для селективного 1- (SASI_Mm01_00090154, послідовність: GUGAUCGUGGCCAUCGCCA, Merck), 2- (SASI_Mm{ {5}}, послідовність: CCAAGUUCGAGCGACUACA, Merck) і 3-AR (SASI_Mm01_00145466, послідовність: CAGUGGACGUGCUCUGUGU, Merck) мовчання. Коротко, лімфоцити електропорували з siRNA (100 нМ) за допомогою 4D-Nucleofector X Unit (Lonza) і P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM X Kit (V4XP-3024, Lonza). Була виконана програма DN-100, специфічна для електропорації мишачих Т-клітин. Після електропорації лімфоцити культивували в середовищі TexMACS (130-097-196, Miltenyi Biotec) протягом 24 годин, а потім спільно культивували з пухлинними клітинами N2A протягом 48 годин, як описано раніше, для кількісного визначення PD-L1. Ефективність глушіння -AR в лімфоцитах оцінювали за допомогою цифрової крапельної ПЛР наступним чином.
Цифрова краплинна ПЛР для кількісного визначення мРНК -AR
РНК була зворотно транскрибована за допомогою iScript Advanced cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). ddPCR проводили з використанням ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) (Bio-Rad), відповідно до інструкцій виробника, на системі QX200 (Bio-Rad) і C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad). Використані такі аналізи: Adrb3-FAM (dMmuCPE5088688), Adrb2-FAM (dMmuCPE5089938), Adrb1-FAM (dMmuCPE5100184), Rps18-HEX (dMmuCPE5196447). Дані ddPCR аналізували за допомогою програмного забезпечення QuantaSoft™ (версія 1.7.4, Bio-Rad).
РНК-секвенування
Вирізані пухлини поміщали в буфер RLT (Qiagen) і механічно гомогенізували за допомогою gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec, Gladbach, Німеччина) з використанням gentleMACS M Tubes (Miltenyi Biotec, Gladbach, Німеччина). Тотальну екстракцію РНК проводили за допомогою набору RNeasy Plus Mini (Qiagen), дотримуючись інструкцій виробника. Кількісне визначення РНК проводили за допомогою спектрофотометрів NanoDrop 2000/2000c (ThermoFisher) і Qubit RNA High Sensitivity (HS) (ThermoFisher). Цілісність РНК оцінювали за допомогою Agilent RNA 6000 Pico Kit на біоаналізаторі Agilent, і всі зразки з числом цілісності РНК (RIN) нижче 6,00 були виключені. Підготовку бібліотеки проводили за допомогою набору TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Gold Kit (Illumina) відповідно до інструкцій виробника з початковим введенням 500 нг загальної РНК. Якість бібліотеки оцінювали за допомогою набору Agilent DNA 7500 на біоаналізаторі Agilent з подальшим кількісним визначенням бібліотеки за допомогою 1X dsDNA High Sensitivity (HS) (ThermoFisher). Бібліотеки секвенували на системі секвенування NextSeq 550 (Illumina) з використанням наборів реагентів High Output NextSeq 500/550 v2.5 (150 циклів) (Illumina). Прогони проводили з конфігурацією 2 × 76 bp.
Кількісне визначення мРНК та аналізи транскриптомії
Salmon (версія 1.5.1) у режимі картографування використовувався для кількісного визначення транскриптів і еталонного транскриптома mus musculus GRCm38.98. Отримані файли qf були проаналізовані статистичною мовою R. Пакет tximport використовувався для імпорту даних у R, а транскрипти були згорнуті на гени пакетом AnnotationDbi та базою даних org.Mm.eg.db. Нарешті, ми виконали статистичний аналіз за допомогою DESeq2. Ми виконали аналіз надмірного збагачення (ORA) за допомогою пакета ClusterProfiler для запиту до бази даних GO: BP із отриманим статистичним аналізом для виявлення змінених клітинних шляхів. Щоб вибрати гени для аналізу збагачення, ми встановили поріг log2FC на 0.5 (| log2FC|⋝ 0.5) і скориговане p-значення на 0.{ {17}}5. Після фільтрації результатів за p-значенням 0,05 ми отримали 45 статистично дерегульованих процесів серед 15158 протестованих у базі даних GO: BP.
Кількісне визначення цитокінів Luminex
cistanche tubulosa - покращує імунну систему
Натисніть тут, щоб переглянути продукти Cistanche Enhance Imunity
【Запитуйте більше】 Електронна пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Мишей умертвляли після 2 днів лікування (T2) за допомогою Vehicle, SR59230A, PD-L1 та SR59230A + PD-L1, і масу пухлини вирізали ножицями та гомогенізували за допомогою набору для лізису клітин Bio-Plex (BIO-RAD, Каліфорнія). , США) та gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec, Німеччина). Потім пухлинні лізати перевіряли на концентрацію цитокінів за допомогою аналізів Bio-Plex Pro™ (BIO-RAD, Каліфорнія, США) на основі технології Luminex xMAP. Рівні IFN-, TNF-, IL-2, IL-6, IL-10, GM-CSF, IL-1 та IL-1 (пг/мл) ) вимірювали відповідно до інструкцій виробника. Дані були отримані за допомогою системи MAGPIX (Luminex, Техас, США), а аналіз проводився за допомогою програмного забезпечення Bio-Plex Manager™ (BIO-RAD, Каліфорнія, США).
Проточний цитометричний аналіз
Аналіз проточної цитометрії проводили на пухлинних клітинах і субпопуляціях імунних клітин мікрооточення пухлини наступним чином. Коротко, пухлини гомогенізували за допомогою миші Tumor Dissociation Kit (#130-096-730, Miltenyi Biotec), а лімфоцити, що інфільтрують пухлину, виділяли із загальної суспензії клітин за допомогою миші CD45 (TIL) MicroBeads (#130-110- 618, Miltenyi Biotec) або миша CD8 (TIL) MicroBeads (#130-116-478, Miltenyi Biotec) через автоматику Pro Separator (Miltenyi Biotec) згідно з інструкціями виробника. Потім клітини інкубували та фарбували різними належним чином розведеними комбінаціями різних кон’югованих із флуорохромом антитіл (додаткова таблиця 1). Пофарбовані клітини аналізували за допомогою проточного цитометра MACSQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotec®), а дані обробляли за допомогою програмного забезпечення Flowlogic (Miltenyi Biotec®).
Імунофлуоресценція клітин і тканин
Імунофлуоресцентний аналіз мишачої пухлинної маси проводили наступним чином. Зразки швидко вирізали, фіксували в забуференому 4% формальдегіді протягом 24 годин і заливали парафіном. Зі зразків вирізали гістологічні зрізи товщиною 5 мкм, депарафінували та кип’ятили протягом 10 хв у натрій-цитратному буфері (10 мМ, рН 6,0; Bio-Optica) для виявлення антигену та імунно фарбували протягом ночі при 4 градусах з первинним антитіла (анти-PD-L1, ab238697, Abcam; анти- 3-AR, ab94506, Abcam; анти-CD4, 14-9766-82, eBioscience; анти-CD8, 14-0808-82, eBioscience; DBH, ab209487, Abcam). Імунна реакція була виявлена при інкубації зрізів із вторинними антитілами Alexa Fluor 488- conjugated IgG або Alexa Fluor 594-conjugated IgG (1:350; Jackson Laboratory). Після контрфарбування 4,6-діамідіно-2-феніліндолом (DAPI) репрезентативні зображення були отримані за допомогою мікроскопа Olympus BX63, підключеного до програмного забезпечення CellSens Dimension Imaging Software версії 1.6 (Olympus). Імунофлуоресцентне фарбування оцінювали за допомогою програмного забезпечення ImageJ (NIH, США), оскільки інтенсивність флуоресценції цікавого білка нормалізували до значень DAPI.
Переваги cistanche tubulosa - Протипухлинний
Каплана-Майєра та кореляційний аналіз генів у пацієнтів з НБ
Кореляція гена ADRB3 з генами імунних контрольних точок CD80, CTLA4, CD276, CD226, CD40LG, 4-1BBL, а також кореляція між загальною (ОВ) і ймовірністю безподійного виживання (EFS) пацієнтів із НБ та рівнями ARDB3 Експресію мРНК проводили з використанням профілю експресії генів 649 зразків NB, створених за допомогою 44K олігонуклеотидних мікрочіпів. Профілі та клінічні дані були отримані з R2: платформа геномного аналізу та візуалізації (http://r2.amc.nl), (Kocak, користувацький ag44kcwolf, n=649 випадків). Останній квартиль розподілу використовувався як граничне значення експресії для високої та низької експресії гена ADRB3 в аналізі Каплана–Майєра.
Статистика
Статистичний аналіз проводили за допомогою GraphPad Prism (GraphPad, Сан-Дієго, Каліфорнія, США) за допомогою одностороннього або двостороннього дисперсійного аналізу (ANOVA), з подальшим допоміжним тестом Бонферроні або непарним t-критерієм Стьюдента. Для експериментів in vivo, згідно з попередніми дослідженнями на тій самій тваринній моделі [12], потрібно було щонайменше 6 мишей на групу, щоб гарантувати потужність 80%. Значення представлені як середнє ± SEM. Значущість розглядалася, коли P було<0.05 and described in each figure legend. Allocation concealment was performed using a randomization procedure (http:// www.randomizer.org/).
РЕЗУЛЬТАТИ
3-Антагонізм AR знижує експресію PD-L1 у пухлинних клітинах мишей A/J, що несуть NB
Нещодавні дослідження показали, що сигналізація PD-1/PD-L1 у NB є ключовим механізмом для обмеження імунного нагляду, і що експресія PD-L1 корелює з високим рівнем онкомаркерів [15, 16]. Беручи до уваги ці та наші попередні дані, які демонструють здатність блокади 3-AR викликати імунокомпетентний TME у мишей із меланомою [13], ми задалися питанням, чи в пухлині NB 3-AR антагонізм може призвести до активації імунної відповіді залежно від залучення сигналу PD-L1. Застосування антагоніста 3-AR, SR59230A, у мишачій сингенній моделі NB зменшувало ріст пухлини більшою мірою, ніж лікування mAb (PD-L1) антитілом до PD-L1, але синергічного ефекту не спостерігалося коли мишей лікували обома препаратами (рис. 1A, B). Щоб дослідити, чи протипухлинний ефект, викликаний введенням SR59230A, частково покладався на модуляцію експресії PD-L1, ми дослідили рівень експресії PD-L1 у TME мишей, що несуть NB. Цікаво, що імунофлуоресценція (рис. 1C) і вестерн-блот (рис. 1D) мишачої пухлинної маси показали, що експресія PD-L1 була знижена в TME мишей, які отримували 3-антагоніст AR, порівняно зі станом носія. Оскільки велика кількість літературних даних показала, що при ТМЕ, окрім ракових клітин, стромальні клітини, такі як антигенпрезентуючі клітини (APC) MDSC, DC та макрофаги, є основними джерелами PD-L1 [17–20], ми далі досліджували, де в TME рівень експресії PD-L1 вплинув після блокади 3-AR. Цитофлуорометричний аналіз показав, що антагонізм 3-AR знижує експресію PD-L1 у пухлинних клітинах (рис. 1E), водночас підвищуючи рівень його експресії в DC та макрофагах (рис. 1F, G). Жодних змін у популяції MDSC не спостерігалося (рис. 1H). Ці перші результати показують, що блокада 3-AR виявила значну протипухлинну активність у сингенній моделі мишей, що несуть NB, і що супутнє введення антитіла PDL1 не викликало протипухлинного синергічного ефекту. Цікаво, що 3-фармакологічний антагонізм АР модулював рівень експресії PDL1 у ТМЕ, що свідчить про участь сигналізації PD-L1 у протипухлинній дії, викликаній блокадою 3-АР.
Рис. 1 Вплив лікування SR59230A та PD-L1 на ріст пухлини та експресію PD-L1 у мишей із пухлиною NB
3-Антагонізм AR і введення PD-L1 стимулюють імунореактивний TME у NB
Щоб дослідити, чи знижена експресія PD-L1, що спостерігається в пухлинних клітинах NB після 3-антагонізму AR, призвела до імунної реактивації при ТМЕ, ми спочатку оцінили кількість перфорину PD-1+CD{ {4}} клітин у пухлинній масі мишей, які отримували SR59230A-, PD-L1- або SR59203A + PD-L1-, порівняно з носієм (рис. 4A, B). Крім того, аналіз фарбування Ki67 показав тенденцію, яка вказує на збільшення проліферації CD8+ T-клітин у пухлинах NB мишей, які отримували антагоніст 3-AR або антитіло PD-L1, навіть якщо воно не досягло значного значення. відмінності (рис. 4C). Нарешті, вимірювання цитокінів показало в пухлинній масі мишей, які отримували PDL1-, підвищений рівень цитокінів, які, як відомо, мають протипухлинну дію, наприклад TNF-, IFN- та IL-6, а також супутні зниження рівня імуносупресивного цитокіну IL-10. Несподівано, у мишей-носіїв NB, які отримували антагоніст 3-AR, ми спостерігали підвищення рівня TNF- та IL-6 і зниження рівнів IL-10, відповідно до імунологічних реактивний статус, який можна припустити за ознаками Т-клітин, але знижений рівень IFN- (рис. 4D). Не було виявлено суттєвих відмінностей в інших аналізованих цитокінах (GMCSF, IL-2, IL-1 та IL-1). Разом ці дані демонструють, що антагонізм 3-AR викликає імунну відповідь господаря в TME мишей, що несуть NB, повторюючи ті самі ефекти, що спостерігаються після введення антитіл PD-L1. Зокрема, цитотоксичні функції CD8+ були посилені як SR59230A, так і PD-L1. При одночасному застосуванні антагоніста 3-AR з антитілом PD-L1 не спостерігалося синергічних ефектів, що підтверджує, що реактивація імунітету, спричинена блокадою 3-AR, принаймні частково залежить від передачі сигналів PD-L1 залучення шляху.
Рис. 2 SR59230A та PD-L1 стимулюють імунореактивний TME у NB
Рис. 3 Експресія імунних контрольних точок на лімфоцитах у TME та TDLN після антагонізму 3-AR та введення PD-L1
Рис. 4 3-Блокада АР запускає функції CD8 і регулює секрецію імунних цитокінів при ТМЕ.
3-AR на лімфоцитах, що інфільтрують пухлину, модулює секрецію IFN і впливає на експресію PD-L1 на пухлинних клітинах NB
Експресія PD-L1 на пухлинних клітинах може бути викликана декількома факторами, але серед інших TNF- та IFN- є основними цитокінами, здатними підвищувати рівні PD-L1 у різних пухлинах [23]. Для подальшого з’ясування сигналізації, яка лежить в основі 3-перехресного зв’язку AR/PD-L1 у нашій моделі пухлини NB, ми спочатку дослідили in vitro експресію PD-L1 на пухлинних клітинах N2A після лікування TNF та IFN. Результати показали, що експресія PD-L1 посилювалася в клітинах NB, оброблених протягом 48 годин IFN-, але не TNF-. Крім того, попередня обробка пухлинних клітин N2A антагоністом 3-AR SR59230A не змогла скасувати підвищену експресію PDL1, викликану лікуванням IFN (рис. 5A). Беручи до уваги, що літературні дані визнають TIL основним клітинним джерелом IFN- під час адаптивної імунної відповіді [24] і що наші результати показали, що 3-модуляція AR на пухлинних клітинах N2A не впливала на IFN- -залежний PD -L1, нам було цікаво, чи була 3-модуляція AR на TIL відповідальною за зміну секреції IFN-, що, у свою чергу, вплинуло на експресію PD-L1 на пухлинних клітинах. Щоб підтвердити нашу гіпотезу, лімфоцити, отримані з TDLN мишей, що несуть NB, які отримували носій або SR59230A, були виділені та спільно культивовані in vitro з пухлинними клітинами. Аналіз імунофлюоресценції та проточної цитометрії підтвердив, що лімфоцити, зібрані у мишей із NB, які отримували антагоніст 3- AR, зменшили свою здатність запускати експресію PD-L1 на клітинах N2A порівняно з необробленими лімфоцитами (рис. 5B, D). Крім того, вимірювання рівня IFN- у середовищах спільного культивування підтвердило, що лімфоцити, зібрані у мишей, які отримували SR50230A, частково втратили здатність секретувати IFN- при спільному культивуванні з пухлинними клітинами NB (рис. 5C). Вже було показано, що 3-AR може з’єднуватися з білком Gs у кількох тканинах, і його активація призводить до активації сигнального шляху cAMP/PKA [25]. У той же час дослідження довели критичну роль зв’язування CLEB (cyclic AMP responsive element binding, CREB) як позитивного транскрипційного регулятора IFN- в Т-клітинах [25–27]. Починаючи з цих спостережень, ми оцінили, чи бере участь сигнальний шлях cAMP/PKA/CREB у 3-AR-залежній секреції IFN у TIL. Результати показали, що антагонізм 3-AR до CD8+ TIL знижує фосфорилювання PKA /PKA субодиниць і CREB, що призводить до зниження експресії IFN у CD8+ TIL (додаткова рис. 1A). , B). Ці результати підтвердили, що 3-AR здатний підтримувати транскрипцію IFN- в TIL NB, запускаючи сигнальний шлях cAMP/PKA/CREB. З іншого боку, імуносупресивний цитокін IL-10 був знижений у Treg мишей, які отримували SR59230A, порівняно з носієм (додатковий рис. 1C), що підтверджує імунну реактивність NB TME після лікування антагоністом 3-AR мишей, що несуть NB. Щоб підтвердити селективний ефект антагонізму SR59230A на підтип 3-AR, ми провели аналіз спільного культивування з лімфоцитами, заглушеними siRNA для 1-, 2- і 3-AR підтипи. Результати показали, що лімфоцити, у яких відсутня 3-AR, серед підтипів -AR, частково втратили здатність індукувати експресію PD-L1 на пухлинних клітинах N2A порівняно з контрольним станом (рис. 5E та додаткова рис. 1D). Більше того, експресію білка 3-AR на мишачих лімфоцитах мишей, що несуть NB, було підтверджено вестерн-блот-аналізом лімфоцитів, отриманих із TDLN (додатковий рис. 2A), та імунофлуоресценцією CD4+ та CD{{ 90}} Т-клітини, пофарбовані на 3-AR на зрізах маси пухлини (додатковий рис. 2B). Раніше ми продемонстрували, що специфічний антагонізм 3- AR проти пухлинних клітин N2A за допомогою SR59230A пригнічує ріст NB і прогресування пухлини шляхом перемикання зі стовбурових ознак на диференціацію пухлинних клітин [12]. Тут наші результати натякнули на те, що протипухлинний ефект введення антагоніста 3-AR також покладався на модуляцію сигналу 3-AR на TIL, що, у свою чергу, призвело до відновлення імунної відповіді проти пухлин. Тому, щоб підтвердити нашу тезу in vivo, ми вводили FTY720 для стримування Т-клітин у TDLN і для зменшення їх інфільтрації в пухлинній масі. FTY720 є аналогом сфінгозин 1-фосфату (S1P), і його введення індукує інтерналізацію та деградацію рецептора S1P, таким чином запобігаючи виходу лімфоцитів із лімфатичних вузлів [28]. Як припускали, попереднє лікування FTY720 знизило протипухлинний ефект, викликаний введенням 3-антагоніста AR (рис. 5F–H). Щоб підтвердити ефективність FTY720 для стримування Т-клітин у TDLN, ми виміряли кількість Т-клітин у TDLN через вісім днів (T8) лікування. Результати показали, що як CD4+, так і CD8+ клітини були збільшені в TDLN мишей, попередньо оброблених FTY720, порівняно з необробленими мишами (носій) (додатковий рис. 2C). Відповідно до наших та інших попередніх результатів, які демонструють, що передача сигналів S1P є вирішальною для виживання пухлинних клітин NB [12, 29], лікування тільки FTY720 також могло значно зменшити ріст пухлини (рис. 5F–H). Аналіз секвенування РНК пухлинних мас NB, виділених із носія та мишей, які отримували SR59230A, ідентифікував 5607 генів, серед яких 267 були генами з диференціальною експресією (DEG), 127 були з підвищеною регуляцією та 140 з пониженою регуляцією в пухлинах, які отримували SR59230A (рис. 6A). Зокрема, кілька генів, які були статистично диференційовано виражені, належали до імунозалежних шляхів згідно з базою даних GO: BP (рис. 6B). Більше того, зниження регуляції мРНК PD-L1 (ген CD274) у пухлині, обробленій SR59230A, порівняно зі станом наповнювача та активація інших інших генів, залучених до процесів, пов’язаних з імунною системою (рис. 6C), підтверджує кореляцію між 3-AR та імунна контрольна точка PD-L1, що спостерігається на рівні білка. Нарешті, диференціальний аналіз експресії генів у загальнодоступному наборі даних (GSE14880 з архіву GEO), що складається з 34 пацієнтів, уражених NB, підтвердив, що пухлинні маси NB з низькою експресією ADRB3 показали позитивну регуляцію імунних відповідей, активації Т-клітин та імунного ефектора. шляхів у порівнянні з масою пухлини з високим рівнем ADRB3 (рис. 6D). Слід зазначити, що в той час як при різних видах раку катехоламіни вивільняються через пов’язані з раком нейрони або просто досягають пухлини через кровообіг, у NB виникає надмірний рівень катехоламінів та їх метаболітів (HVA, VMA, дофамін), унікальна особливість цього злоякісного новоутворення. з іншого джерела. Дійсно, через особливе походження NB-клітин (з дефектних клітин симпатичної нейрональної диференціації нейронного гребеня), ці пухлини зазвичай здатні самостійно виділяти катехоламіни. Дійсно, у нашій мишачій моделі NB імунофлуоресценція пухлинних мас показала, що пухлинні клітини NB були позитивними щодо дофамін-гідроксилази (DBH) (додатковий рис. 3A), ферменту, відповідального за синтез норадреналіну, незалежно від 3- Експресія АР на пухлину або її антагонізм. У сукупності ці дані підкреслюють вирішальну роль, яку відіграє β-адренергічна передача сигналів у регулюванні різних біологічних процесів, залучених у взаємодію між імунною системою хазяїна та мікрооточенням пухлини в пухлинах NB. Протипухлинні ефекти, які спостерігаються після введення антагоніста 3-AR у нашій сингенній моделі мишей, принаймні частково залежать від модуляції 3-AR, що експресується на лімфоцитах, що інфільтрують масу пухлини. Зокрема, ми продемонстрували, що селективна блокада 3-AR на TIL знижує секрецію IFN, що, у свою чергу, знижує експресію PD-L1 на пухлинних клітинах NB, сприяючи імунореактивному TME.
Рис. 5 3-AR на TILs підтримує IFN- -залежну експресію PD-L1 у пухлинних клітинах NB. А
Експресія гена ADRB3 корелює з поганим прогнозом у пацієнтів з NB
Деякі дослідження показали, що {{0}}мРНК та/або білок {{0}}AR мають надмірну експресію та в деяких випадках корелюють із неопластичною проліферацією та трансформацією в різних ракових захворюваннях людини [10, 30–32]. Відповідно, наші доклінічні результати, отримані на сингенній мишачій моделі NB, продемонстрували, що передача сигналів 3-AR може підтримувати різні пропухлинні процеси, що сприяють росту пухлини. Таким чином, щоб перевірити, чи експресія гена ADRB3 корелює з виживанням пацієнтів з NB, ми провели аналіз Каплана-Майєра за допомогою R2: Genomics Analysis and Visualization Platform (http://r2.amc.nl), використовуючи базу даних Kocak, яка включає повна інформація про клінічні дані 649 хворих на НБ. Результати показали, що експресія гена ADRB3 була пов'язана з поганими результатами у пацієнтів з NB. Висока експресія гена ADRB3 справді була суттєво пов’язана зі зниженою безподійною (p=3.2e−05) (рис. 7A) та загальною виживаністю (p=8.4e−0,5) ( Рис. 7B) пацієнтів з NB. Крім того, аналіз кореляції генів у деяких когортах показав позитивну кореляцію між ADRB3 і генами інгібіторних імунних контрольних точок, таких як CD80, CTLA4 і CD276, і негативну кореляцію з генами імунних контрольних точок, що активують імунну систему, таких як CD266, Ліганд CD40 (CD40LG) і ліганд 4-1BB (4-1BBL) (рис. 7C). Загалом, отримані дані підкреслюють негативну кореляцію експресії гена ADRB3 з результатами лікування пацієнтів з NB та підтверджують і зміцнюють роль 3-AR як молекулярного гравця, здатного пригнічувати протипухлинні імунні відповіді, впливаючи на численні імунні контрольні точки сигнальні шляхи.
ДИСКУСІЯ
Через своєрідне нейрогенне походження високий рівень метаболітів катехоламінів характеризує пухлинний стан НБ [7, 33]. У попередній роботі ми припускали, що вивільнення катехоламіну в TME може націлюватися на ракові клітини через активацію -AR, запускаючи цикл прямого зв’язку росту та злоякісності при раку NB. Дійсно, експериментальні дані продемонстрували, що 3-AR експресується на різних лініях пухлинних клітин NB і в біоптатах пацієнтів і що його модуляція суттєво вплинула на ріст пухлини в сингенній мишачій моделі NB [12]. На додаток до експресії -AR на пухлинних клітинах, широко відомо, що -AR розташовані на поверхні більшості клітин ТМЕ, включаючи імунні клітини, і що лігування катехоламінів з -AR в імунних клітинах регулює як вроджений, так і адаптований імунітет. [34]. Слід зазначити, що хоча за фізіологічних умов модуляція імунної системи за допомогою -адренергічної сигналізації сприяє нормальній імунній відповіді, у змінених процесах подовжена стимуляція SNS/катехоламінів/-ARs може мати шкідливий вплив на різні імунні клітини, включаючи лімфоцити [35, 36]. ]. У цих змінених умовах тривала стимуляція адренергічної передачі сигналів сприяє патологічним процесам і, серед іншого, прогресуванню раку [37]. Починаючи з вищезазначених спостережень, наше дослідження має на меті дослідити, чи можуть протипухлинні ефекти, спричинені 3-антагонізмом AR у пухлинах NB, частково покладатися на відновлення протипухлинного імунітету та чи може це включати модуляція сигнальних шляхів імунних контрольних точок. Доклінічні дослідження свідчать про те, що експресія PD-L1 у метастатичному НБ є ключовим механізмом для обмеження імунного нагляду [15], і що комбінована імунотерапія антитілами до PD-L1/PD-1 і анти-CD4 лікує сингенний дисемінований НБ [15]. 38]. Нещодавно було оцінено експресію PD-L1 у кількох педіатричних пухлинах, і, перш за все, фарбування PD-L1 було пов’язане з нижчою виживаністю пацієнтів із НБ [16, 39]. Крім того, було показано, що PD-L1-позитивні пухлини локалізуються в наднирковій залозі частіше, ніж PD-L1-негативні пухлини, і що метаболіти катехоламінів (NSE, VMA та HVA) мають тенденцію до вище в PD-L1-позитивній групі, ніж у PD-L1-негативній групі [16].
cistanche tubulosa - покращує імунну систему
Ці дані свідчать про здатність сигнальної осі PD-1/PD-L1 контролювати імунний вихід пухлини при первинному та метастатичному NB, однак вони не досліджували точні механізми, що лежать в основі PD-1/PD- L1 регулювання сигналізації. Щоб дослідити, чи може 3-модуляція AR впливати на експресію PD-L1 у NB і, як наслідок, на імунну реактивність у TME, ми лікували мишей A/J, яким були щеплені сингенні клітини N2A NB, 3- Антагоніст AR SR59230A, моноклональне антитіло PD-L1 (PD-L1) або їх комбінація. По-перше, ми спостерігали, що антагонізм 3-AR був здатний зменшити ріст пухлини NB і одночасно знизити експресію PD-L1 у TME мишей, які несуть NB. Проточна цитометрія виявила, що зниження кількості PD-L1, яке спостерігалося в пухлинній масі мишей, які отримували SR59230A, в основному відображає знижену експресію пухлинних клітин. На відміну від цього, експресія PD-L1 на DC і макрофагах була підвищена. Кілька наукових доказів приписують здатність PD-L1, розташованого як на пухлинних клітинах, так і на APC, пригнічувати активацію Т-клітин, частково перешкоджаючи ефективній імунній реакції проти пухлини [40]. Однак нещодавні дослідження показали, що під час поглинання антигену та перехресної презентації пухлинних антигенів Т-клітинам, що є вирішальним кроком у адаптивному імунітеті, ДК і макрофаги посилюють регуляцію PD-L1, таким чином обмежуючи надмірну активацію Т-клітин і захищаючи їх від цитотоксичної активності Т-клітини [41, 42]. Таким чином, ми припустили, що зниження експресії PD-L1 на пухлинних клітинах і її супутнє збільшення на APC у пухлинній масі, обробленій SR59230A, ймовірно, відображає відновлення імунної системи при ТМЕ. Результати підтвердили збільшення кількості імунореактивних клітин, що проникають у пухлину (NK, DC і CD8+), і зменшення кількості імуносупресивних клітин, що проникають у пухлину (Treg і MDSC). Аналіз експресії імунної контрольної точки PD-1 на TIL показав значно збільшену кількість Т-клітин PD-1+CD4+ і PD- 1+CD8+ Т-клітин у TDLN на рання стадія розвитку пухлини (T2) і PD-1+CD8+ у пухлині після 8 днів (T8) SR59230A, PD-L1 або їх комбінованого лікування порівняно з контролем. Тенденція до збільшення кількості CD4+ T-клітин, забарвлених на TIM3 або LAG3, була також відзначена в пухлинах SR59230A, лікування PD-L1 та їх комбінації, але вони не досягли статистичної значущості. Для CD8+ Т-клітин, пофарбованих на TIM3 або LAG3, ми спостерігали велику варіабельність. Хоча деякі літературні дані свідчать про те, що Т-клітини, які експресують PD-1, LAG-3 і TIM-3, виснажені та нефункціонують [43–45], інші продемонстрували, що ці імунні контрольні точки, зокрема PD -1 також підвищуються після активації та диференціації ефекторних Т-клітин [46–48], і тому експресія сама по собі не відображає статус виснаження, скоріше ці маркери ідентифікують аутологічний пухлинно-реактивний репертуар, що проникає в різні пухлини [46– 49]. Відповідно, більш глибокі дослідження на нашій моделі пухлини підтвердили, що 3-антагонізм AR, оскільки лікування анти-PD-L1 mAb, викликало цитотоксичні функції CD8+, про що свідчить збільшення кількості PD Клітини 1+CD8+, пофарбовані на перфорин або гранзим B, підтверджують, що PD1+ TIL, виявлені в пухлинній масі, є функціонально активними. Було показано, що висока інфільтрація CD8+ цитотоксичних Т-клітин у пухлину корелює з позитивним прогнозом у пацієнтів із кількома злоякісними новоутвореннями, включаючи меланому, рак голови та шиї, молочної залози, колоректальний, яєчників, передміхурової залози та інші [50]. У NB нещодавнє дослідження продемонструвало, що пухлини, збагачені пухлинними інфільтруючими Т-клітинами, мали кращий клінічний результат, незалежно від інших поточних показників, прийнятих для визначення стадії пухлини [51]. Крім того, нещодавні результати показали, що присутність DC і NK-клітин у пухлинній масі позитивно корелює як з Т-клітинною інфільтрацією, так і з позитивним клінічним результатом пацієнтів з NB [52]. Усі ці клінічні дані узгоджуються з нашими доклінічними результатами, згідно з якими TME, збагачений NK, DC і CD8+ T-клітинами, спостережуваний після антагонізму 3- AR або введення PD-L1, функціонально міг контроль росту пухлини NB. Фундаментальним аспектом боротьби імунної системи організму з пухлинами є вивільнення різних цитокінів у ТМЕ, які можуть підтримувати або послаблювати протипухлинну активність. Вимірювання цитокінів у пухлині підтвердило, що у мишей, які отримували SR59230A та PD-L1-, стан змінився в бік імунореактивного ТМЕ. Однак, хоча серед протипухлинних цитокінів рівні TNF- та IL-6 підвищилися, рівень IFN-упав у масі пухлини 3-антагоністів AR мишей. Починаючи з цього спостереження, ми припустили, що модуляція сигналізації 3-AR на Т-клітинах, які інфільтрують пухлину, зокрема на CD4+ та CD8+, може бути відповідальною за зміну IFN- секреції, що, у свою чергу, вплинуло на експресію PD-L1 на пухлинних клітинах. Результати підтвердили нашу гіпотезу. Селективний антагонізм 3-AR щодо TIL справді зробив ці клітини неефективними в індукції експресії PD-L1 на пухлинних клітинах NB через змінену секрецію IFN- і фактично перешкоджав створенню адаптивного імунного опору. У ТМЕ IFN-організує як пропухлинні, так і протипухлинні імунні відповіді, діючи як цитотоксичний цитокін разом із гранзимом B і перфорином, щоб вражати пухлинні клітини, але також запускаючи синтез інгібіторних імунних контрольних точок, таким чином стимулюючи імуносупресивні механізми [53]. Ця бімодальна роль IFN-у спричиненні протилежних ефектів залежить від складних механізмів, які ще не повністю вивчені, однак кількість IFN-секретованого, здається, є вирішальною у визначенні дій, спричинених цим цитокіном [54]. Відповідно, ми припускаємо, що в нашій моделі зменшена кількість IFN-інтерферону, спричинена антагонізмом 3- AR на TIL, сприяла імунній відповіді порівняно з контрольним станом, у якому хронічний вплив IFN-форсує більше імуносупресивних механізмів. Серед підтипів -AR, 2-AR, здається, найбільше виражений на поверхні різноманітних імунних клітин. Однак слід зазначити, що 3-AR, останній ідентифікований член -AR, був найменш вивченим на сьогоднішній день. Таким чином, щоб підтвердити, що введення SR59230A спричинило блокування в основному підтипу 3-AR, ми спочатку дослідили та підтвердили експресію білка 3-AR на лімфоцитах TDLN і на Т-клітинах, інфільтрованих пухлиною. Ми продемонстрували експресію білка 3-AR у CD4+ та CD8+, що інфільтрує пухлину, а потім через селективні 1-, 2- та {{ 140}}Замовчуючи AR, ми підтвердили визначну роль 3-підтипу AR, розташованого на лімфоцитах, у контролі IFN- -залежної експресії PD-L1 на пухлинних клітинах NB. Слід зазначити, що обширні дані щодо різних моделей тканин і клітин показали, що хоча 1- і 2-АР більш схильні до явища гомологічної десенсибілізації після тривалого впливу ендогенних катехоламінів, {{147} Було показано, що підтип }AR не був таким, і коли все ж у деяких клітинах відбулася десенсибілізація 3-AR, вона була менш вираженою порівняно з 1- і 2-AR [ 55]. Потім ми припускаємо, що в пухлині NB, стані, який характеризується хронічним впливом катехоламінів, підтип 2-AR на TILs, найбільш виражений фізіологічно, може піддаватися зниженню регуляції після десенсибілізації, і, навпаки, 3-AR отримує ключову роль у опосередкуванні пропухлинних ефектів, спричинених катехоламіном. Щоб дослідити пропухлинну схильність експресії 3- AR у людей, ми зрештою провели генетичний аналіз 649 пацієнтів з NB за допомогою відкритого доступу R2: Genomics Analysis and Visualization Platform. Висока експресія гена ADRB3 корелювала з найгіршим клінічним результатом (загальне виживання та виживання без подій) пацієнтів з NB порівняно з нижчою експресією; крім того, позитивна кореляція гена ADRB3 з різними імуносупресивними контрольними точками, такими як CD80, CTLA4 і B7-H3 (CD276), і негативна кореляція з імунними активуючими контрольними точками, такими як CD266, CD40LG і 4-1 BBL підтвердив негативну роль 3-АР у комплексній регуляції імунної реактивності при НБ. Зокрема, позитивна кореляція експресії гена ADRB3 з імуносупресивними контрольними точками, такими як CD276, NB-асоційована молекула, виявлена у нереагуючих варіантах NB, яка виконує захисну роль від опосередкованого NK-клітинами лізису [56, 57], або з CTLA4, чиє інгібування, як було показано, не є надлишковим у посиленні знищення протипухлинних Т-клітин у NB [58], підкреслив здатність передачі сигналів 3-AR підтримувати різні механізми, що сприяють імунному виходу пухлини. Ми можемо припустити, що кореляція між високою експресією гена ADRB3 і підвищеною експресією різних імунних контрольних точок може покладатися на здатність 3-AR підтримувати ті механізми, надмірна активація яких сприяє виникненню резистентності пухлини, наприклад, хронічний вплив деяких про -запальні цитокіни. Ранні дослідження інгібування контрольних точок при NB не завжди були успішними. Зокрема, як у моделях доклінічних досліджень, так і на людях, кращі відповіді, отримані в терапевтичних стратегіях із застосуванням кількох ICI, свідчать про те, що націлювання на різні імунні контрольні точки представляє ненадлишковий ефективний протипухлинний підхід при NB [58, 59]. Тоді націлювання на різні імуносупресивні шляхи може представляти найкращий терапевтичний варіант, щоб уникнути резистентності пухлини до одноцільної терапії. Однак застосування кількох препаратів завжди є проблематичним через важкі побічні ефекти та токсичність і не завжди призводить до бажаних результатів. Таким чином, для розробки нових імуно-онкологічних підходів необхідні глибші знання про молекулярні механізми, задіяні в регуляції складної мережі імунного аналога ТМЕ. У цьому контексті представлені результати свідчать про те, що націлювання на 3-AR у NB TME може представляти можливий підхід до ураження багатьох ненадлишкових пропухлинних сигнальних шляхів. Зокрема, впливаючи як на імунну систему хазяїна через усунення бар’єру, спричиненого взаємодією імунних контрольних точок, так і на шляхи виживання пухлинних клітин, 3-антагонізм АР може представляти багатообіцяючу стратегію з, сподіваємося, терапевтичним потенціал для пацієнтів, уражених злоякісними пухлинами NB. Потрібні додаткові дослідження для поглиблення подальших механізмів, що лежать в основі складної взаємодії між імунною системою хазяїна та аналогом пухлини при NB. Тим не менш, у світлі того, що ми спостерігали, дослідження β-адренергічної передачі сигналів у ТМЕ пухлин НБ заслуговує на те, щоб бути взяті до уваги.
Рис. 6 Транскриптомні аналізи маси пухлини NB підтверджують визначну роль 3-AR у впливі на процеси, пов’язані з імунною системою
Рис. 7 Аналіз виживаності Каплана-Мейєра та кореляція імунних контрольних точок із експресією гена ADRB3 у пацієнтів з NB.
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. Cheung NK, Dyer MA. Нейробластома: біологія розвитку, геноміка раку та імунотерапія. Nat Rev Рак. 2013;13:397-411.
2. Меттей К.К., Маріс Дж.М., Гудрун С., Накагавара А., Маккал К.Л., Діллер Л. та ін. Нейробластома. Nat Rev Dis Prim. 2016; 2: 16078.
3. Дарвін П, Тор С.М., Наір С.Н., Елкорд Е. Інгібітори імунних контрольних точок: останні досягнення та потенційні біомаркери. Exp Mol Med. 2018;50:1–11.
4. Пардолл Д.М. Блокада імунних контрольних точок при імунотерапії раку. Nat Rev Рак. 2012; 12: 252-64.
5. Zou W, Wolchok JD, Chen L. Блокада шляху PD-L1 (B7-H1) і PD-1 для лікування раку: механізми, біомаркери відповіді та комбінації. Sci Transl Med. 2016;8:328rv4.
6. Коул С.В., Суд А.К. Молекулярні шляхи: бета-адренергічна передача сигналів при раку. Clin Cancer Res. 2012; 18: 1201-6.
7. Strenger V, Kerlb R, Dornbusch HJ, Ladenstein R, Ambros PF, Ambros IM, et al. Діагностичний та прогностичний вплив катехоламінів у сечі у пацієнтів з нейробластомою. Дитячий рак крові. 2007;48:504–9.
8. Huang XE, Hamajima N, Saito T, Matsuo K, Mizutani M, Iwata H та ін. Можливий зв’язок поліморфізму генів бета2- та бета3-адренорецепторів зі схильністю до раку молочної залози. Рак молочної залози Res. 2001;3:264–9.
9. Babol K, Przybylowska K, Lukaszek M, Pertynski T, Blasiak J. Зв’язок між поліморфізмом Trp64Arg у гені бета3-адренергічного рецептора та раком ендометрія та ожирінням. J Exp Clin Cancer Res. 2004;23:669–74.
10. Перроне М.Г., Нотарнікола М., Карузо М.Г., Тутіно В., Скіліматі А. Посилення мРНК бета3-адренергічного рецептора при раку товстої кишки людини: попереднє дослідження. Онкологія. 2008;75:224-9.
11. Magnon C, Hall SJ, Lin J, Xue X, Gerber L, Freedland SJ та ін. Розвиток вегетативного нерва сприяє прогресуванню раку простати. Наука. 2013;341:1236361.
12. Bruno G, Cencetti F, Pini A, Tondo A, Cuzzubbo D, Fontana F та ін. блокада бета3- адренорецепторів зменшує ріст пухлини та збільшує диференціацію нейронів у нейробластомі за допомогою модуляції SK2/S1P2. Онкоген. 2020;39:368–84.
13. Calvani M, Bruno G, Dal Monte M, Nassini R, Fontana F, Casini A та ін. бета3 -адренорецептор як потенційний імуносупресор при меланомі. Br J Pharm. 2019;176:2509-24.
14. Dal Monte M, Casini G, Filippi L, Nicchia MG, Svelto M, Bagnoli P. Функціональне залучення бета3-адренергічних рецепторів у ріст і васкуляризацію меланоми. J Mol Med. 2013;91:1407–19.
15. Дондеро А., Пасторіно Ф., Делла К’єза М., Корріас М.В., Моранді Ф., Пістойя В. та ін. Експресія PDL1 у метастатичній нейробластомі як додатковий механізм для обмеження імунного нагляду. Онкоімунологія. 2016; 5: e1064578.
16. Zuo S, Sho M, Sawai T, Kanehiro H, Maeda K, Yoshida M та ін. Потенційна роль експресії PD-L1 і лімфоцитів, що інфільтрують пухлину, на нейробластому. Pediatr Surg Int. 2020;36:137–43.
17. Keir ME, Butte MJ, Feeman GJ, Sharpe AH. PD-1 та його ліганди в толерантності та імунітеті. Annu Rev Immunol. 2008; 26: 677-704.
18. Curiel TJ, Wei S, Dong H, Alvarez X, Cheng P, Mottram P та ін. Блокада B7-H1 покращує опосередкований мієлоїдними дендритними клітинами протипухлинний імунітет. Nat Med. 2003; 9: 562–7.
19. Ву К., Кричек І., Ченг Л., Цзоу В., Веллінг Т.Г. Пригнічення клітинами Купфера CD8+ Т-клітин у гепатоцелюлярній карциномі людини опосередковується взаємодіями B7-H1/програмована смерть-1. Cancer Res. 2009;69:8067–75.
20. Kuang DM, Zhao Q, Peng C, Xu J, Zhang JP, Wu C та ін. Активовані моноцити в перитуморальній стромі гепатоцелюлярної карциноми сприяють імунній привілеї та прогресуванню захворювання через PD-L1. J Exp Med. 2009; 206: 1327-37.
21. Rotte A, Jin JY, Lemaire V. Механічний огляд імунних контрольних точок для підтримки раціонального дизайну їх комбінацій в імунотерапії раку. Енн Онкол. 2018;29:71–83.
22. Dammeijer F, van Gulijk M, Mulder EE, Lukkes M, Klaase L, van den Bosch T та ін. Контрольна точка PD-1/PD-L1 стримує Т-клітинний імунітет у лімфатичних вузлах, що дренують пухлину. Ракова клітина. 2020;38:685–700. e8.
23. Cha JH, Chan LC, Li CW, Hsu JL, Hung MC. Механізми контролю експресії PD-L1 при раку. Mol Cell. 2019;76:359–70.
24. Берк Дж.Д., Янг Г.А. IFN-: цитокін у потрібний час, у потрібному місці. Семін Імунол. 2019;43:101280.
25. Шена Г, Каплан М.Дж. Усе, що ви завжди хотіли знати про 3-AR* (* але боялися запитати). Клітини. 2019; 8: 357.
26. Liu Y, Guo YL, Zhou SJ, Liu F, Du FJ, Zheng XJ та ін. CREB є позитивним регулятором транскрипції гамма-інтерферону при латентних, але неактивних туберкульозних інфекціях. Clin ad Vaccine Immunol. 2010; 17: 1377-80.
27. Samten B, Townsend JC, Weis SE, Bhoumik A, Klucar P, Shams H, et al. Фактори транскрипції CREB, ATF і AP-1 регулюють секрецію IFN-гамма Т-клітинами людини у відповідь на мікобактеріальний антиген. J Immunol. 2008;181:2056-64.
28. Matloubian M, Lo CG, Cinamon G, Lesneski MJ, Xu Y, Brinkmann V, et al. Вихід лімфоцитів із тимуса та периферичних лімфоїдних органів залежить від рецептора S1P 1. Природа. 2004;427:355-60.
29. Li MH, Hla T, Ferrer F. FTY720 пригнічує ріст пухлини та посилює пригнічувальну дію топотекану на пухлину при нейробластомі, перешкоджаючи сфінголіпідному сигнальному шляху. Дитячий рак крові. 2013;60:1418–23.
30. Чісхолм К.М., Чанг К.В., Труонг М.Т., Квок С., Вест Р.Б., Хеерема-МакКенні А.Е. експресія бета-адренергічних рецепторів у судинних пухлинах. Мод Патол. 2012; 25: 1446–51.
31. Montoya A, Amaya CN, Belmont A, Diab N, Trevino R, Villanueva G та ін. Застосування неселективних бета-блокаторів асоціюється зі зниженням показників проліферації пухлини на ранніх стадіях раку молочної залози. Онкотаргет. 2017; 8: 6446-60.
32. Рейнс С.Л., Амайя К.Н., Браян Б.А. Бета-адренергічні рецептори експресуються в різних ракових пухлинах. Онкосвідомість. 2017;4:95-105.
33. Verly IR, van Kuilenburg ABP, Abeling NGGM, Goorden SMI, Fiocco M, Vaz FM та ін. Профілі катехоламінів при діагностиці: підвищена діагностична чутливість і кореляція з біологічними та клінічними особливостями у пацієнтів з нейробластомою. Eur J Рак. 2017;72:235–43.
34. Eng JWL, Kokolus KM, Reed CB, Hylander BL, MA WW, Repasky та ін. Нервове мікрооточення пухлини: вплив адренергічного стресу на ракові клітини, імуносупресія та імунотерапевтична відповідь. Рак Immunol Immunother. 2014;63:1115–28.
35. Дабхар Ф.С., Мак’юен Б.С. Гострий стрес посилює, тоді як хронічний стрес пригнічує клітинний імунітет in vivo: потенційна роль у торгівлі лейкоцитами. Імунна поведінка мозку. 1997;11:286-306.
36. Дабхар Ф.С. Індуковане стресом посилення імунної функції — роль гормонів стресу, переміщення лейкоцитів і цитокінів. Імунна поведінка мозку. 2002;16:785–98.
37. Qiao G, Chen M, Bucsek MJ, Repasky EA, Hylander BL. Адренергічна сигналізація: цільова контрольна точка, що обмежує розвиток протипухлинної імунної відповіді. Передній імунол. 2018; 9: 164.
38. Rigo V, Emionite L, Daga A, Astigiano S, Corrias MV, Quintarelli C та ін. Комбінована імунотерапія з анти-PDL{2}}/PD-1 і анти-CD4 антитілами виліковує сингенну дисеміновану нейробластому. Sci Rep. 2017; 7: 14049.
39. Majzner RG, Simon JS, Grosso JF, Martinez D, Pawel BR, Santi M, et al. Оцінка експресії запрограмованої смерті ліганду 1 та пухлинно-асоційованих імунних клітин у дитячих ракових тканинах. Рак. 2017;123:3807–15.
40. Gibbons Johnson RM, Dong H. Функціональна експресія ліганду запрограмованої смерті 1 (B7-H1) імунними та пухлинними клітинами. Передній імунол. 2017; 8: 961.
41. Peng Q, Qiu X, Zhang Z, Zhang S, Zhang Y, Liang Y та ін. PD-L1 на дендритних клітинах послаблює активацію Т-клітин і регулює відповідь на блокування імунної контрольної точки. Нац комун. 2020;11:4835.
42. Сінгхал С., Стаданлік Дж., Аннунціата М.Дж., Рао А.С., Бходжнагарвала П.С., О'Брайен С. та ін. Моноцити/макрофаги, асоційовані з пухлиною людини, і їхня регуляція відповідей Т-клітин на ранній стадії раку легенів. Sci Transl Med. 2019;11:eaat1500.
43. Blackburn SD, Shin H, Haining WN, Zou T, Workman CJ, Polley A та ін. Корегуляція виснаження Т-клітин CD8+ кількома інгібіторними рецепторами під час хронічної вірусної інфекції. Nat Immunol. 2009;10:29-37.
44. Jin HT, Anderson AC, Tan WG, West EE, Ha SJ, Araki K, et al. Співпраця Тіма-3 та PD-1 у виснаженні Т-клітин CD8 під час хронічної вірусної інфекції. Proc Natl Acad Sci США. 2010;107:14733-8.
45. Сакуїші К., Апето Л., Салліван Дж.М., Блазар Б.Р., Кучу В.К., Андерсон А.С. Діяльність на шляхи Tim-3 і PD-1 для зворотного виснаження Т-клітин і відновлення протипухлинного імунітету. J Exp Med. 2010; 207: 2187-94.
46. Agata Y, Kawasaki A, Nishimura H, Ishida Y, Tsubata T, Yagita H та ін. Експресія антигену PD-1 на поверхні стимульованих Т- і В-лімфоцитів миші. Int Immunol. 1996; 8: 765-72.
47. Вібхакар Р., Хуан Г., Траганос Ф., Даржинкевич З., Фінгер Л.Р. Індукована активацією експресія гена програмованої смерті людини-1 в Т-лімфоцитах. Exp Cell Res. 1997; 232: 25-8.
48. Фрімен Дж. Дж., Лонг А. Дж., Івай Ю., Бурк К., Чернова Т., Нісімура Х. та ін. Залучення імуноінгібіторного рецептора PD-1 новим членом родини B7 призводить до негативної регуляції активації лімфоцитів. J Exp Med. 2000;192:1027-34.
49. Gros A, Robbins PF, Yao X, Li YF, Turcotte S, Tran E та ін. PD-1 ідентифікує специфічний для пацієнта CD8(+) пухлинно-реактивний репертуар, що проникає в пухлини людини. J Clin Invest. 2014;124:2246–59.
50. Galon J, Costes A, Sanchez-Cabo F, Kirilovsky A, Mlecnik B, Lagorce-Pagès C та ін. Тип, щільність і розташування імунних клітин в колоректальних пухлинах людини передбачають клінічні результати. Наука. 2006;313:1960–4.
51. Mina M, Boldrini R, Citti A, Romania P, D'Alicandro V, De Ioris M, et al. Т-лімфоцити, що інфільтрують пухлину, покращують клінічні результати резистентної до терапії нейробластоми. Онкоімунологія. 2015; 4: e1019981.
52. Melaiu O, Chierici M, Lucarini V, Jurman G, Conti LA, De Vito R та ін. Клітинні та генні сигнатури дендритних клітин, що інфільтрують пухлину, і природних клітин-кілерів передбачають прогноз нейробластоми. Нац комун. 2020;11:5992.
53 Йоргованович Д, Сонг М, Ван Л, Чжан Ю. Роль IFN-гамма в прогресії та регресії пухлини: огляд. Biomark Res. 2020; 8:49.
54. Чжан Дж. Інь і Ян взаємодія IFN-гамма при запаленні та аутоімунних захворюваннях. J Clin Invest. 2007;117:871–3.
55. Океке К, Анже С, Був'є М, Мішель МС. Індукована агоністами десенсибілізація бета3 -адренорецепторів: де, коли і як? Br J Pharm. 2019;176:2539–58.
56. Кастріконі Р., Дондеро А., Ауґульяро Р., Кантоні С., Карнемолла Б., Семента А.Р. та ін. Ідентифікація 4Ig-B7-H3 як молекули, пов’язаної з нейробластомою, яка виконує захисну роль від опосередкованого NK-клітинами лізису. Proc Natl Acad Sci США. 2004;101:12640–5.
