Гіпотермія, спричинена окскарбазепіном після транзиторної ішемії переднього мозку, здійснює терапевтичний нейропротектор через транзиторний рецепторний потенціал. Ванілоїдний тип 1 і 4 у піщанок. Частина 3
Jul 26, 2024
4. Матеріали та методи
4.1. Піддослідні тварини
Використовували самців піщанок (загальна кількість=252) у віці 6 місяців (маса тіла 63–78 г). Піщанок вирощували в Центрі експериментальних тварин Національного університету Кангвон (Чхунчхон, Корея).
Піщанки дуже милі маленькі тваринки. Вони живуть у пустельних районах, добре копають печери та мають сильні інстинкти зберігання та пошуку їжі. Серед цих маленьких хлопців самці піщанок мають особливо гарну пам’ять, що змушує людей знати їхні секрети.
По-перше, коли самці піщанок шукають їжу, вони використовують низку сигналів, таких як орієнтири та місцевість, щоб визначити напрямок. Шляхом тривалих спостережень і практики вони створили власну «геоінформаційну систему». Навпаки, самки піщанок гірше пам’ятають ці сигнали, особливо в умовах, що постійно змінюються.
По-друге, самці піщанок також демонструють сильну пам'ять у боротьбі з природними ворогами. За словами вчених, коли піщанки знаходяться під загрозою, вони швидко проникають в нору і намагаються втекти. Але зіткнувшись із такою ж загрозою, самці піщанок запам’ятають спосіб атаки природних ворогів і уникатимуть їх, збільшуючи свої шанси на виживання.
Нарешті, пам'ять самців піщанок також полягає в їхній соціальній поведінці один з одним. Кожна піщанка має свій унікальний запах. Коли вони зустрічаються з іншими піщанками, вони використовують свій нюх, щоб визначити особу та статус один одного. Ця здатність до пам’яті не тільки дозволяє піщанкам встановлювати відносно стабільний соціальний зв’язок, але й є важливою гарантією їхнього розмноження.
Таким чином, зв’язок між самцями піщанок і пам’яттю нерозривний. У процесі пошуку виживання та розмноження в природі вони покладаються на свою сильну пам’ять, щоб постійно адаптуватися до навколишнього середовища та вдосконалюватися. Як люди, ми повинні вчитися у цих маленьких хлопців і постійно вдосконалювати свою пам’ять, щоб краще адаптуватися до цього світу, що постійно змінюється. Можна помітити, що нам потрібно покращити нашу пам’ять, і Cistanche може значно покращити пам’ять, оскільки він також може регулювати баланс нейромедіаторів, наприклад, підвищувати рівень ацетилхоліну та факторів росту, які дуже важливі для пам’яті та навчання. Крім того, Cistanche також може покращити кровотік і сприяти доставці кисню, що може гарантувати, що мозок отримує достатню кількість живлення та енергії, тим самим покращуючи життєздатність і витривалість мозку.
Натисніть Знати, щоб збільшити потужність пам'яті
Для цього дослідження експериментальний протокол був схвалений (номер схвалення KW-200113-1; дата схвалення 18 лютого 2020 р.) Інституційним комітетом з догляду та використання тварин.
Протокол дослідження дотримувався вказівок, запропонованих у «Поточні міжнародні закони та політика» Посібника з догляду та використання лабораторних тварин, опублікованого The National Academies Press (8-е видання, 2011).
4.2. Експериментальні групи, індукція tFI, лікування HyT і OXC
Щоб підтвердити захисні ефекти OXC проти ішемічного ушкодження після tFI у піщанок, піщанок розділили на шість груп: (1) група фіктивних+носій (n=24); (2) група tFI+носій (n {{5) }}); (3) група sham+HyT (n=24); (4) група tFI+HyT (n=60); (5) група sim+OXC (200 мг/кг) (n=24); і (6) група tFI+OXC (n=60).
Сім і п'ять піщанок у трьох групах tFI були використані для аналізу Вестерн-блот і гістологічного дослідження, відповідно, через 30 хвилин, 12 годин, 1 день, 2 дні та 4 дні після операції tFI, а в трьох групах імітації - сім і п'ять піщанок використовували через 30 хвилин і 4 дні після фіктивної операції, щоб мінімізувати кількість. У цьому експерименті tFI було розроблено, як описано раніше [34].
Коротше кажучи, піщанок анестезували 2,5% ізофлурану (у 32% кисню та 68% закису азоту). Під анестезією обидві загальні сонні артерії були ізольовані від сонної оболонки та закупорені кліпсами для аневризми (Yasargil FE 723K) (Aesculap, Tuttlingen, Німеччина). ) протягом п’яти хвилин.
Ідеальна зупинка кровопостачання мозку була підтверджена шляхом спостереження за артеріальним кровотоком в обох артеріях сітківки (гілки внутрішніх сонних артерій) за допомогою офтальмоскопа (HEINE K180®) від Heine Optotechnik (Herrsching, Німеччина).
Температуру тіла до та під час операції в усіх групах контролювали на нормотермії (37 ± 0,2 ◦C) за допомогою термометричної ковдри. Через п'ять хвилин оклюзії кліпси були видалені.
У цьому дослідженні було проведено фіктивну операцію, піддавши їх тій самій операції tFI без оклюзії загальних сонних артерій. HyT у двох групах sim+HyT і tFI+HyT контролювали (подібно до зміни температури тіла в tFI+ група OXC) шляхом охолодження всього тіла пакетом з льодом протягом шести годин.
Температуру тіла двох фіктивних+OXC і tFI+OXC груп реєстрували протягом шести годин після негайної внутрішньоочеревинної ін’єкції 200 мг/кг OXC (Sigma–Aldrich, Сент-Луїс, Миссурі, США) після операції tFI.
Дозування OXC було обрано на основі попереднього дослідження, яке показало, що 200 мг/кг OXC ефективно захищає від загибелі клітин мозку після [36]. Для реєстрації зміни температури тіла температуру тіла вимірювали в прямій кишці щогодини після tFI, протягом протягом 6 годин при кімнатній температурі (приблизно 22 ◦C).
Піщанки отримали чотири дні відновлення після tFI, оскільки пірамідні клітини, розташовані в області CA1 гіпокампа, починають гинути через чотири дні після tFI [30,34,62].
4.3. Тест SMA
Тест SMA проводився для вивчення змін гіперактивності в усіх групах. Коротше кажучи, як описано раніше [63], тест SMA проводився в день 1 після tFI, оскільки рухова активність досягає найвищої точки в день 1 після ішемічного ушкодження після tFI.
Піщанки всіх груп пройшли адаптацію до навколишнього середовища протягом двох годин, і їх помістили у відкриту клітку (ширина 44 см; довжина 44 см; висота 30 см), отриману від Ugo Basile SRL (Gemonio, Італія), в якій дві паралельні горизонтальні інфрачервоні промені 4 × 8 від підлоги були встановлені протягом однієї години. SMA реєстрували за допомогою Photobeam Activity System-Home Cage від San Diego Instruments (Сан-Дієго, Каліфорнія, США).
Рух (траєкторія та загальна пройдена відстань) було виявлено через переривання масиву інфрачервоних променів, створених фотоелементами.
SMA безперервно контролювали протягом однієї години, а дані збирали за допомогою аналізатора AMB від IPC Electronics (Камбрія, Великобританія).
Збір даних розпочали через 15 хвилин після звикання у відкритій клітці. Нарешті, отримані результати були оцінені як відстань (метри) руху за період тестування (одна година).
4.4. Тести когнітивних функцій
4.4.1. РАМТ
Щоб порівняти просторову пам’ять у всіх групах, було проведено RAMT відповідно до попередніх досліджень [38,44]. Для цього тесту використовувався радіальний 8-лабіринт із рукавами від Stoelting Co (Вуд-Дейл, Іллінойс, США).
Інструмент-лабіринт складався з центральної платформи та восьми рук (ширина кожної руки 5 см; висота 9 см; довжина 35 см). Піщанок тренували один раз на день протягом трьох днів перед тим.
Зокрема, гранульований корм, отриманий від DBL Co (Chungbuk, Корея), був поміщений на кінці кожної руки, і кожна піщанка була розміщена на центральній платформі. Після цього піщанка шукала корм.
Після фіктивної операції або операції tFI справжній тест проводився один раз на день протягом чотирьох днів, починаючи з наступного дня після операції.
Для аналізу було оцінено кількість помилок, причому одна помилка виникала кожного разу, коли піщанка входила в руку, яку вже відвідували раніше. Випробування було закінчено, коли піщанка з'їла корм.
4.4.2. PAT
Для порівняння короткочасної пам’яті між групами було проведено PAT згідно з раніше повідомленими методами [64,65] з деякими модифікаціями. Коротше кажучи, піщанки були протестовані за допомогою системи уникнення Gemini (GEM 392) від San Diego Instruments (Сан-Дієго, Каліфорнія, США), яка складається з двох (темного та світлого) відсіків, які спілкуються один з одним через вертикально розсувні ворота.
Експериментальні сесії проводилися у дві фази: тренувальна сесія та реальна тестова сесія, проведена за день до та через чотири дні після tFI або фіктивної операції.
Справжній тест проводився через 20 хвилин після сеансу навчання шляхом вимірювання часу затримки (у секундах) під час перебування в темній кімнаті. А саме, під час сеансу навчання піщанці дозволили вільно досліджувати два відсіки протягом однієї хвилини, коли ворота були відкриті. .
Після цього, коли піщанка зайшла в темний відсік, двері зачинили, і на піщанку вдарили ступнею електричного струму (0,5 мА) від сталевої решітки на підлозі протягом п’яти секунд.
У реальному тестовому сеансі, на 4-й день після tFI, піщанка була поміщена у світлий відсік, і був записаний час затримки у світлому відсіку перед входом у темний відсік.
4.5. Вестерн-блот аналіз на TRPV1 і TRPV4
Для вивчення рівнів експресії TRPV1 і TRPV4 в гіпокампі CA1 піщанок було проведено Вестерн-блоттинг згідно з раніше описаними методами [66,67].
Коротко кажучи, відповідно до визначеного графіка (30 хв, 12 год, 1 день, 2 дні та 4 дні після фіктивної операції або операції tFI) піщанок (n=5 для кожної групи) отримували анестезію для евтаназії шляхом внутрішньоочеревинної ін’єкції 200 мг/кг пентобарбіталу натрію (JW Pharm.Co., Ltd., Сеул, Корея).
Після цього їхній мозок збирали та гомогенізували з 50 мМ фосфатним буферним розчином (PBS, pH 7,4), що містив 0.1 мМ етиленгліколь-біс (аміноетиловий ефір)-N, N, N{{ 11}}, N0-тетраоцтова кислота (EGTA) (pH 8.0), 10 мМ етилендіамінтетраоцтова кислота (EDTA) (pH 8,0), 0,2% Nonidet P{{17 }}, 15 мМ пірофосфату натрію, 100 мМ -гліцерофосфату, 2 мМ ортованадату натрію, 50 мМ NaF, 150 мМ NaCl, 1 мМ фенілметилсульфонілфториду (PMSF) і 1 мМ дитіотреїтолу (DTT).
Далі зразки центрифугували, а супернатанти відбирали для визначення рівня білка за допомогою набору для аналізу Micro BCA від Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, США) з бичачим альбуміном від Pierce Chemical Co (Rockford, IL, США).
Аликвоти, що містять 2 0 мкг загального білка, кип’ятили в буфері для завантаження, 150 мМ Трис (pH 6,8), що містить 6% додецилсульфату натрію (SDS), 3 мМ DTT, 0,3% бромфенолового синього та 30% гліцерину.
Зразки розділяли за допомогою електрофорезу в 10% SDS-поліакриламідному гелі (PAGE). Далі гелі переносили на нітроцелюлозні мембрани від Pall Co (East Hills, NY, USA) при 350 мА та 4 ◦C протягом 90 хв.
Для блокування неспецифічного фарбування мембрани інкубували в 5% знежиреному молоці протягом 60 хвилин при кімнатній температурі. Після цього у них проводили імунну реакцію з кожним первинним антитілом: кролячі анти-TRPV1 (розведені 1:1000) (Abcam, Кембридж, Великобританія), кролячі анти-TRPV4 (розведені 1:1000) (Abcam) і кролячі анти- - актин (розведений 1:2000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) при 4 ◦C протягом 7 год.
Згодом вони реагували з пероксидазою хрону (HRP), кон’югованою з ослячими антикролячими IgG (розведеними 1:4500) (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Каліфорнія, США) при кімнатній температурі протягом 1 години.
Нарешті, хемілюмінесцентний набір на основі алюмінію від Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, США) використовувався для покращення візуалізації.
Як описано раніше [68], імуноблоти TRPV1 і TRPV4 аналізували за допомогою програмного забезпечення Scion Image від Scion Crop (Фредерік, штат Меріленд, США). Смуги сканували та проводили денситометричний аналіз. Рівні білка були нормалізовані порівняно з відповідним рівнем -актину.
4.6. Підготовка гістологічних зрізів
Для імуногістохімічного та гістопатологічного досліджень піщанок (n=7 для кожної групи) умертвляли відповідно до визначеного графіка (30 хв, 12 год, 1 день, 2 дні та 4 дні після tFI або фіктивної операції).
Як описано раніше [34], піщанок глибоко анестезували пентобарбіталом натрію (200 мг/кг) (JW Pharmaceutical, Сеул, Корея). Під анестезією піщанок транскардіально промивали 0,1 М фосфатним буферним розчином (рН 7,4) і фіксували 4% параформальдегідом (у 0,1 М фосфатному буфері, рН 7,4).
Згодом їхні мізки були отримані та постфіксовані за допомогою того самого фіксатора протягом шести годин. Після цього тканини головного мозку розрізали (товщина корональних площин 25 мкм) в акріостаті (Leica, Wetzlar, Німеччина).
4.7. Гістохімічне фарбування за допомогою CV
Для вивчення морфологічного та нейронального пошкодження в гіпокампі кожної групи було виконано фарбування крезилфіолетовим (CV), як ми описали раніше [69]. Коротко, крезилфіолетовий ацетат (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) розчиняли при 1.0% (w/v) у дистильованій воді та крижаній оцтовій кислоті (0).28 %) до цього розчину додали. Зрізи були пофарбовані та змонтовані канадським бальзамом (Канто, Токіо, Японія).
4.8. FJ B Фарбування
Фарбування FJ B було виконано для вивчення дегенерації нейронів (смерть або втрата). Згідно з опублікованою процедурою [34], підготовлені зрізи мозку змочували в 1% гідроксиду натрію, негайно переносили в 0.06% перманганат калію та негайно реагували з 0,0004% фторнефриту B (Histochem , Джефферсон, Арканзас, США).
Зрізи ненадовго промили та помістили на нагрівальний предмет (приблизно 50 ◦C) для реакції з FJ B. Щоб оцінити терапевтичний ефект OXC проти tFI, кількість FJ B+клітин підрахували в області CA1 відповідно до методу, опублікованого в [ 70].
Коротко, цифрові зображення FJ B+клітин були отримані з п’яти зрізів на піщанку за допомогою епіфлуоресцентного мікроскопа (Carl Zeiss) (Oberkochen, Німеччина) при довжині хвилі 450–490 нм. Клітини підраховували в 250 мкм2, що включало SP, у центрі області CA1 за допомогою системи аналізу зображень (Optimas 6.5) (CyberMetrics, Скоттсдейл, Аризона, США).
4.9. Імуногістохімія
Щоб дослідити зміни імунореактивності NeuN, TRPV1 і TRPV4 в області CA1, було проведено загальну імуногістохімію. Коротше кажучи, згідно з опублікованою методикою [34], підготовлені зрізи мозку інкубували з первинними антитілами миші анти-NeuN (розведені, 1:1100) (Chemicon, Temecula, CA, США), мишачі анти-TRPV1 (розведені, 1:500) (Abcam, Кембридж, Великобританія) і кролячий анти-TRPV4 (розбавлений, 1:500) (Abcam, Кембридж, Великобританія).
Після цього ці інкубовані зрізи інкубували у відповідних вторинних антитілах (розведених, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Берлінгейм, Каліфорнія, США) і розвивали за допомогою Vectastain ABC (розведених, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Берлінгейм, Каліфорнія). , США). Нарешті, ці зрізи з імунореакцією мали колір після візуалізації 3,3'-діамінобензидином.
Кількість клітин NeuN+ підраховували наступним чином. Цифрові зображення клітин NeuN+ були отримані з п’яти зрізів на піщанку за допомогою світлового мікроскопа (AxioM1) (Carl Zeiss, Німеччина).
Клітини підраховували так само, як підрахунок клітин FJ B+. Щоб оцінити щільність структур TRPV1+ і TRPV4+, використовували відповідні області в регіоні CA1 у п’яти зрізах на тварину. Зображення структур TRPV1+ і TRPV4+були отримані за допомогою світлового мікроскопа AxioM1 (Carl Zeiss) (Німеччина).
Щільність структур TRPV{{0}} і TRPV4+ оцінювали як відносну оптичну щільність (ROD). Для цього зображення були перетворені на середній рівень сірого. ROD було представлено у відсотках за допомогою програмного забезпечення Adobe Photoshop (версія 8.0) і NIH Image J (Національний інститут здоров’я, Бетесда, штат Меріленд, США).
4.10. Статистичний аналіз
Ми представили дані як середнє ± стандартна помилка середнього (SEM). Усі статистичні аналізи проводили за допомогою GraphPad Prism (версія 5.0) (GraphPadSoftware, La Jolla, CA, USA). Відмінності в середніх значеннях між експериментальними групами були статистично проаналізовані за допомогою двостороннього дисперсійного аналізу (ANOVA) з тестом множинного порівняння Post hoc Bonferroni, щоб з’ясувати пов’язані з tFI відмінності між усіма групами. Статистична значущість розглядалася при p < 0. 05.
Авторські внески: Концептуалізація: M.-HW і T.-KL; Методологія, J.-CL і DWK; програмне забезпечення, H.-IK і MCS; Валідація, JHA, IJK і JHP; Дослідження, J.-CL, H.-IK та M.CS; Data Curation, JHC, IJK і JHP; Написання - Підготовка оригіналу, H.-IK та J.-CL; Написання, рецензування та редагування, M.-HW; Нагляд, С.-С.Л.; Адміністрація проекту, M.-HW; Funding Acquisition, S.-SL і T.-KL Усі автори прочитали та погодилися з опублікованою версією рукопису.
Фінансування: Ця робота була підтримана Brain Korea 21 (BK21) Fostering Outstanding Universities forResearch (FOUR, 4220200913807), що фінансується Національним дослідницьким фондом (NRF) Кореї, а також Програмою фундаментальних наукових досліджень через Національний дослідницький фонд Кореї (NRF) фінансується Міністерством освіти (NRF-2020R1I1A1A01070897).
Заява інституційної наглядової ради: піщанки були виведені в Центрі експериментальних тварин Національного університету Кангвон (Чунчхон, Корея). Для цього дослідження експериментальний протокол був схвалений (№ схвалення, KW-200113-1; дата схвалення 18 лютого 2020 р.) Інституційним комітетом з догляду та використання тварин.
Протокол дослідження дотримувався вказівок, запропонованих у «Поточні міжнародні закони та політика» Посібника з догляду та використання лабораторних тварин, опублікованого The National Academies Press (8-е видання, 2011).
Заява про інформовану згоду: не застосовується.
Заява про доступність даних: Дані, представлені в цьому дослідженні, доступні за запитом від відповідного автора.
Подяка: автори висловлюють подяку Хюн Сук Кім і Сеунг Ук Лі за технічну допомогу в цьому дослідженні.
Конфлікт інтересів: автори заявили про відсутність фінансового конфлікту інтересів.
Скорочення
CA1: підполе Cornu Ammonis 1; ЦНС, центральна нервова система; CV, крезиловий фіолетовий; DG, зубчаста звивина; FJ B, Fluoro-Jade B; Гіпотермія, гіпотермія; NeuN, нейронні ядра; OXC, окскарбазепін; PAT, тест пасивного уникнення; ROD, відносна оптична густина; СМА, спонтанна рухова активність; SO, східний шар; SP, шар пірамідальний; SR, stratum radiatum; tFI, транзиторна ішемія переднього мозку; TRPV1, транзиторний потенційний ванілоїдний тип 1.
Список літератури
1. Бусто, Р.; Дітріх, В.Д.; Глобус М.Ю.; Вальдес, І.; Шайнберг, П.; Ginsberg, MD Невеликі відмінності в інтраішемічній температурі мозку критично визначають ступінь ішемічного пошкодження нейронів. Я. Цереб. Кровотік Metab. 1987, 7, 729–738. [CrossRef][PubMed]
2. Махер, Дж.; Hachinski, V. Гіпотермія як потенційне лікування церебральної ішемії. Цереброваск. Метаб мозку. Rev. 1993, 5,277–300.
3. Медсестра С.; Корбетт, Д. Нейропротекція після кількох днів легкої гіпотермії, викликаної ліками. Я. Цереб. Кровотік Metab. 1996, 16,474–480. [CrossRef]
4. Фішер, М.; Feuerstein, G.; Howells, DW; Hurn, PD; Кент, ТА; Савіц С.І.; Lo, EH; Group, S. Оновлення доклінічних рекомендацій академічної індустрії з лікування інсульту. Інсульт 2009, 40, 2244–2250. [CrossRef]
5. Лю, Л.; Yenari, MA Терапевтична гіпотермія: нейропротекторні механізми. Фронт. Biosci. 2007, 12, 816–825. [CrossRef]
6. Ліден, П.Д.; Крігер, Д.; Єнарі, М.; Dietrich, WD Терапевтична гіпотермія при гострому інсульті. Міжн. J. Stroke 2006, 1, 9–19. [CrossRef][PubMed]
7. Классман Л. Лікувальна гіпотермія при гострому інсульті. J. Neurosci. Медсестра. 2011, 43, 94–103. [CrossRef]
8. Гройсман Л.І.; Емануель, Б.А.; Кім-Тенсер, Массачусетс; Sung, GY; Mack, WJ Терапевтична гіпотермія при гострому ішемічному інсульті. Нейрохірургія. Фокус 2011, 30, E17. [CrossRef] [PubMed]
9. Шваб, С.; Георгіадіс, Д.; Berrouschot, J.; Шеллінгер, П.Д.; Graffagnino, C.; Mayer, SA Доцільність і безпека помірної гіпотермії після масивного гемісферного інфаркту. Інсульт 2001, 32, 2033–2035. [CrossRef]
10. Кац Л.М.; Янг, А.С.; Франк, JE; Ван, Ю.; Park, K. Регульована гіпотермія зменшує окислювальний стрес мозку після гіпоксичної ішемії. Brain Res. 2004, 1017, 85–91. [CrossRef]
11. Лю, К.; Хан, Х.; Генг, X.; Чжан, Дж.; Ding, Y. Фармакологічна гіпотермія: потенціал для майбутньої терапії інсульту? Нейрол. Res.2016, 38, 478–490. [CrossRef]
12. Ма, Дж.; Ван, Ю.; Ван, З.; Лі, Х.; Ван, З.; Chen, G. Нейропротекторні ефекти медикаментозної терапевтичної гіпотермії при захворюваннях центральної нервової системи. Curr. Drug Targets 2017, 18, 1392–1398. [CrossRef]
13. Калабрезі, П.; Купіні, Л.М.; Centonze, D.; Пізані, Ф.; Бернарді, Г. Протиепілептичні препарати як можлива нейропротекторна стратегія при ішемії мозку. Енн Нейрол. 2003, 53, 693–702. [CrossRef]
14. Танака, Т.; Літовський Н. С. Протиепілептичні засоби при черепно-мозковій травмі у дітей. Експерт преподобний Нейротер. 2016, 16, 1229–1234. [Cross Ref]
For more information:1950477648nn@gmail.com
